文摘

虽然氧化应激已经强烈参与急性胰腺炎(AP)的发展,抗氧化治疗的病人迄今为止令人沮丧。本研究的目的是评估潜在mitochondria-targeted抗氧化保护作用,MitoQ,美联社在实验使用在体外和在活的有机体内方法。MitoQ阻止H₂O₂全身的细胞内活性氧反应小鼠胰腺腺泡的细胞,一个动作不共享的模拟dTPP控制。MitoQ不会降低线粒体两极化的诱导通过缩胆囊素(CCK)或胆汁酸tlc,和10µM导致两极化本身。MitoQ和dTPP增加基底和CCK-induced plate-reader测定细胞死亡。在TLCS-induced AP模型MitoQ治疗没有防护。在美联社caerulein过度引起的(CER-AP) MitoQ施加混合效果。因此,观察局部组织病理学评分的改善,由dTPP共享的行为,但没有减少的生化标记胰腺癌胰蛋白酶或血清淀粉酶。有趣的是,肺并发髓过氧物酶和白细胞介素- 6增加了MitoQ CER-AP。MitoQ引起两相的影响在孤立的多形核白细胞,ROS生产抑制急性增加但后来提升水平。我们的研究结果表明,MitoQ AP治疗不当,与之前一致抗氧化评价在这种疾病。

1。介绍

急性胰腺炎(AP)是一种严重的炎性疾病引起的外分泌胰腺主要由胆结石和过量的酒精1,2)的发病率大约30每100000人每年在英国(3]。尽管大多数患者有轻微和自限性的临床过程4]大约15 - 20%的病例涉及潜在的致命并发症,如持续器官衰竭与胰腺坏死感染(5),导致沉重的socioeconomical负担(6]。尽管增加的理解这种疾病的病理生理学在过去的二十年里,一个特定的治疗缺乏美联社(4]。

最初的网站在美联社的伤害被认为是胰腺腺泡细胞,展品病理特征包括过早激活消化酶的前兆,顶端分泌,抑制无序自噬溶酶体降解,线粒体功能障碍,并释放炎性细胞因子(7]。钙的证据表明,一个关键的角色,多样的美联社沉淀剂,如胆汁酸、缩胆囊素过度,和nonoxidative乙醇代谢产物,诱导钙超载,线粒体功能障碍,以及ATP的损失导致腺泡的细胞坏死(8),决定结果的程度在临床设置。局部和全身炎症反应的特点AP进展,包括激活和炎症细胞浸润到胰腺引发进一步的损伤在一个恶性循环9]。

活性氧的作用提出了美联社的基础上发展的升高氧化状态或降低抗氧化能力观察临床和实验动物模型(8,10]。例如,增加超氧化物和脂质过氧化水平,减少血液中抗氧化状态存在的AP患者与健康对照组相比,与疾病严重程度(11]。在实验美联社调查,包括在活的有机体内caerulein过度和胆汁酸模型,表明增加活性氧与疾病进展相关的12]。ROS在美联社的参与是复杂和缺乏定义的,与一代在应对许多刺激胰腺腺泡的细胞(13),包括持续钙海拔引起的胆汁酸(14),也由extrapancreatic炎症细胞包括中性粒细胞表达NAD (P) H氧化酶;淘汰赛的这种酶与减少实验AP严重程度(15]。尽管美联社,强有力的证据表明氧化应激有明显转化差距,随机临床试验使用抗氧化剂治疗到目前为止沮丧(12]。

最近有关抗氧化治疗策略一直是目标化合物以局部清除活性氧和线粒体保护细胞器(16]。mitochondrial-targeted抗氧化mitoquinone (MitoQ)旨在提供一个增长半醌抗氧化到线粒体通过十烷基链与亲脂性的阳离子triphenylphosphonium (TPP⁺),利用线粒体膜电位()的积累17]。研究表明,MitoQ防止许多氧化应激条件细胞株和动物疾病模型,这药经历了丙型肝炎患者的二期临床试验(18]。然而,潜在的保护作用的MitoQ美联社没有测试到目前为止。在这项研究中,我们调查了MitoQ在孤立的胰腺腺泡细胞的影响,多形核白细胞(中性粒细胞),在两个鼠在活的有机体内实验AP模型。

2。材料和方法

2.1。动物和试剂

男性CD1小鼠(30克)或C57BL / 6 j小鼠(20 - 25克)有限公司从英国买回来查尔斯河(马尔盖特、英国)。他们被安置在°C下12小时光/暗周期随意访问标准实验室食物和水。12小时前开始的在活的有机体内实验中,动物被剥夺食物但被允许获得水。研究进行了符合适当的英国内政部个人和项目许可证,和利物浦大学的机构伦理审查过程。试剂如果不提到都从σ(吉林厄姆,英国)。MitoQ及其nonantioxidant控制decyl-TPP (dTPP)合成的化学,Octago大学新西兰。

2.2。胰腺腺泡细胞的隔离

刚分离胰腺腺泡的细胞获得成人CD1小鼠的胰腺使用标准胶原酶(美国新泽西州卫氏生化公司,莱克伍德)消化过程建立在以前的工作19]。细胞外的解决方案包含(毫米):140氯化钠,氯化钾的4.7,1.13 MgCl₂1 CaCl₂,10 d -葡萄糖,和10个消息灵通的。最后的pH值的解决方案是使用氢氧化钠调整pH值7.35。所有孤立的胰腺腺泡的细胞实验在室温下进行(第23 - 25°C)和细胞不超过4 h后隔离如果不是另有说明。

2.3。隔离的中性粒细胞

中性粒细胞的隔离实现如前所述[20.]。小鼠长骨头与无菌PBS孤立和刷新,紧随其后的是一个70毫米无菌过滤器过滤(费舍尔科学、拉夫堡、英国)和离心机在600 g 5分钟在4°C。然后细胞颗粒悬浮在4毫升PBS和加载到Percoll密度梯度(62%和81%),其次是在1500 g离心20分钟在4°C。收集细胞Percoll层之间和悬浮在4毫升红细胞裂解缓冲摇臂上5分钟,洗2:1与PBS,离心机在600 g RPMI1460暂停前5分钟。这些孤立的细胞进一步统计的伯爵夫人自动细胞计数(美国表达载体,卡尔斯巴德,CA)。本研究中使用的所有细胞形态学> 90%中性粒细胞> 90%的可行性。

2.4。测量活性氧的生产

实时ROS生产和胰腺腺泡细胞氧化还原变化测量探针5-chloromethyl-2,二乙酸7-dichlorodihydrofluorescein乙酰(CM-H₂DCFDA)使用蔡司LSM510共焦显微镜(Jena,卡尔蔡司Jena GmbH德国)如前所述[14]。刚分离小鼠胰腺腺泡的细胞被孵化与1μM MitoQ或者dTPP同时含有10μM CM-H₂DCFDA 30分钟。然后细胞灌注与H₂O₂诱导活性氧。的荧光CM-H₂DCFDA很兴奋在488 nm和排放收集在505 - 550海里。

ROS测量在中性粒细胞,peroxidase-enhanced鲁米诺化学发光测定采用使用POLARstarω板读者(BMG Labtech,德国)。细胞被镀的密度每使用1。500000μM MitoQ或者dTPP 10分钟,之前添加50μ鲁米诺和75单位/毫升辣根过氧化物酶。激活NAD (P) H氧化酶被50 ng / mL佛波醇诱导十四烷酸酯(PMA),而抑制是通过使用1μM二苯基碘鎓(DPI)。ROS的发光排放在440纳米染料被记录了40分钟。化学发光强度是负控制每个鼠标/运行正常。

2.5。测量在胰腺腺泡的细胞

在不同的实验中,胰腺腺泡的细胞是由四甲基罗丹明甲酯(TMRM;分子探针,尤金,或者美国)试验如前所述14]。简而言之,这些细胞被装载40 nM TMRM 30分钟前孵化与1μ米或十μM MitoQ或dTPP。Cholecystokinin-8 (CCK-8 10 nM)或胆汁酸taurolithocholic酸3-sulphate (tlc, 500μ米)被用来诱导两极化。年底的灌注,protonophore羰基氰化物3-chlorophenylhydrazone (CCCP 10μ米)添加诱导完整的两极化。的荧光TMRM很兴奋在543 nm和排放收集在560 - 650海里。

2.6。在体外细胞死亡的检验胰腺腺泡的细胞

胰腺腺泡的细胞死亡的强度检测荧光染料propidium碘(PI)的坏死细胞的细胞核(14]。CCK-8引起的细胞死亡的时间进程荧光板读者方法。简单地说,从一个小鼠胰腺细胞被孤立,离心机,resuspended 1毫升的解决方案。细胞被小心地用移液器吸取成单个井以确保同质性。细胞治疗CCK-8 (10 nM),或在1μM MitoQ或dTPP。正常对照组,细胞治疗相同体积的细胞外的解决方案。5分钟后,π(50μ米)被添加到所有井由自动化搅拌混合。在POLARstarω板被放置在阅读器(预热至37°C),和荧光由励磁543 nm和发射620海里下阅读。试验将运行周期时间为600秒。所有从基底荧光(荧光测量表示为更改F/F₀比),F₀代表了初始荧光记录在实验的开始,和F在特定的时间点记录的荧光。

2.7。据美联社模型实验

七个超大的剂量腹腔注射(50μcaerulein g / kg), CCK-8模拟,给出了每小时一次地诱导过度急性胰腺炎(CER-AP) [21]。控制老鼠收到平等的PBS注入。MitoQ治疗组,MitoQ 10毫克/公斤(1)剂量或25毫克/公斤(剂量2)在第一和第三caerulein注射。同样,dTPP在9.6毫克/公斤(剂量1)或24毫克/公斤(剂量2)给出dTPP治疗组。MitoQ和dTPP相同的摩尔浓度剂量1和2。老鼠牺牲在12 h第一caerulein注射后收集样本。

胆汁段美联社是通过tlc逆行灌注到胰管(TLCS-AP) [22]。麻醉诱导后,薄层色谱应用使用一个微型输液泵(哈佛装置、肯特、英国)的速度5μL / min 10分钟。成功的胰腺灌注的tlc证明了漫射光蓝色(亚甲蓝)出现在胰头。没有tlc输液控制老鼠收到虚假的手术。治疗组,MitoQ(10毫克/公斤)或dTPP(9.6毫克/公斤)在1 h和tlc灌注后3小时以内。老鼠牺牲在tlc输液或虚假的手术后24小时。在这两种动物模型,镇痛是通过0.1毫克/公斤盐酸丁丙诺啡。

2.8。美联社的严重性标记

牺牲的老鼠后,血液被允许自然凝结了30分钟,其次是离心收集血清1500 g×10分钟。胰腺和肺样本也收获和快速冷冻,以供将来使用。胰腺的比例也由10%福尔马林固定在一夜之间被接受之前)染色(5μ米厚的每张幻灯片)。

血清淀粉酶在临床生物化学检验部门在皇家利物浦大学医院使用动态方法。血清il - 6是衡量ELISA根据制造商的指令(研发,阿宾顿,英国)。胰腺胰蛋白酶活性决定成立协议使用胰蛋白酶肽底物Boc-Gln-Ala-Arg-MCA(肽,大阪,日本)荧光板读者(BMG Labtech、英国)。胰腺癌和肺癌髓过氧物酶活动,胰腺胰蛋白酶活动,和胰腺组织病理学分析方法之前报道(23]。所有的组织病理学评分进行双盲的方式由独立评估员。

2.9。统计分析

结果从三个或更多意味着±SEM获取独立的实验。在所有的数据,竖线表示SEM值。一个学生的t以及用于统计评估与正态分布的数据,而一个方差分析测试数据进行了偏态分布。P< 0.05的值被认为是显示显著差异。

3所示。结果

3.1。MitoQ回收活性氧产量分离胰腺腺泡的细胞

1毫米的应用H₂O₂引起细胞ROS的稳步上升(对照组)所反映的CM-H强度增加₂DCFDA荧光;细胞使用1μM MitoQ显示显著降低ROS生产与细胞对照组相比,而预处理的1μ的亲脂性的阳离子M dTPP MitoQ(图没有抗氧化活性没有影响1(一))。无论是MitoQ还是dTPP诱导活性氧的生产本身(图1 (b))。

3.2。MitoQ没有防止线粒体两极化的美联社沉淀剂造成的孤立的胰腺腺泡的细胞

无论是预处理与1μM MitoQ也dTPP两极化的引起的在孤立的胰腺腺泡细胞,与protonophore CCCP应用于实验的最后引出完整的两极化。(图2(一个))。然而,在10μM MitoQ和dTPP诱导稳定的降低本身这是更深刻的MitoQ(数据2 (b)和2 (c))。CCK (10 nM)诱导的两极化而控制细胞治疗玫瑰(图2 (d)),效果没有明显影响预处理与1μM MitoQ或dTPP(图2 (e))。同样,灌注tlc (500μ米)动摇(图2 (f)1)不受影响μM MitoQ或dTPP(图2 (g))。

3.3。MitoQ胰腺腺泡的细胞死亡和严重CCK-Induced坏死造成的

两个1μM MitoQ dTPPπ吸收增加指示性坏死引起的;显著差异观察2、6、10 h细胞之间使用MitoQ或dTPP和细胞治疗的对照组与玫瑰(图3(一个))。添加10 nM CCK引起坏死的时间增加。然而,1μM MitoQ没有施加任何保护CCK-induced细胞死亡。而MitoQ和dTPP显著恶化坏死与CCK仅在2 h,而dTPP,但不是MitoQ,加重CCK-induced细胞死亡后跨度为(图3 (b))。

3.4。MitoQ改善CER-AP但加重系统性的整体胰腺组织病理学损伤

图4(一)显示了控制和组织病理学幻灯片代表不同的治疗组,与单个组件的整体组织病理学评分和分解分数总结在图4 (b)。腹腔内注射生理盐水没有造成任何重大的胰腺组织病理变化,而过度caerulein诱导美联社的典型特征;明显水肿,vacuolisation,中性粒细胞浸润性导管利润率,和胰腺实质,焦腺泡的细胞坏死明显12 h后第一个caerulein注入。CER-AP也以明显增加血清淀粉酶、胰胰蛋白酶和MPO活性,肺MPO活性生理盐水相比控制。

MitoQ治疗剂量测试显著降低胰腺水肿和中性粒细胞浸润。然而,胰腺坏死并没有阻止,高剂量的趋势更大的坏死虽然没有获得意义。MitoQ剂量依赖性增加血清淀粉酶与高剂量(图的近似两倍5(一个))。胰腺胰蛋白酶活性和MPO活性没有显著影响MitoQ剂量(数据5 (b)和5 (c))。此外,MitoQ caerulein引起的治疗肺MPO活性几乎翻了一番(图5 (d))显著增加的血清il - 6水平也明显剂量1(图5 (e))。

nonantioxidant模拟dTPP显著降低水肿、中性粒细胞浸润,在两个剂量和坏死,导致整个组织病理学评分的降低。血清淀粉酶没有显著影响(图5(一个)),尽管dTPP减少胰腺胰蛋白酶和MPO活性(数字5 (b)和5 (c))。与MitoQ类似结果,dTPP也显著增加caerulein-induced肺MPO活性和血清il - 6水平(数字5 (d)和5 (e))。

3.5。MitoQ没有防止TLCS-AP

虚假的操作只引起轻微的水肿的胰腺腺泡的细胞没有明显的炎症和坏死的迹象。tlc注入3毫米到胰腺通过胰管导致显著的胰腺组织病理变化在24 h,特点是显著增加水肿,炎症、坏死和因此,整体组织病理学评分(图6(一)(i-iv))。然而,胰腺的身体和尾巴是更少的影响(数据未显示)。TLCS-AP与增加血清淀粉酶、胰MPO活性,血清il - 6水平比虚假的集团(数字6 (b)- - - - - -6 (d))。

无论是MitoQ还是dTPP在低剂量诱导胰腺组织病理学变化,水肿、炎症、坏死,和整体组织病理学评分没有改变(图6(一)(i-iv))。同样,没有明显的变化时血清淀粉酶和胰腺MPO活性TLCS-AP老鼠MitoQ或dTPP(处理数据6 (b)和6 (c))。血清il - 6水平略微增加了MitoQ或dTPP治疗但没有达到统计学意义(图6 (d))。应用MitoQ或dTPP都单独剂量小鼠缺乏caerulein注射或tlc注入表明MitoQ和dTPP肺MPO活性显著增加本身(数据没有显示)。

3.6。两相的影响在中性粒细胞MitoQ PMA-Induced ROS的生产

图7(一)说明1的影响μM MitoQ或dTPP PMA-induced ROS生产孤立的中性粒细胞。NAD (P) H氧化酶刺激PMA (50 ng / mL)诱导活性氧的急剧增加在中性粒细胞的胞外溶液最初几分钟内达到8分钟,大约20分钟后拒绝一个高原。应用NAD (P) H氧化酶抑制剂DPI减少高峰阶段和完全抑制ROS高原(图7 (c))。MitoQ治疗引起中性粒细胞的活性氧产量两相的影响。因此,浓度抑制初始ROS PMA诱导的峰值,峰值时间推迟到10分钟(数字7(一)- - - - - -7 (c))。应用程序1μM dTPP没有显著影响的峰值PMA-induced ROS生产中性粒细胞相比,细胞治疗PMA孤单。有趣的是,MitoQ造成浓度的强化PMA-induced ROS生产40分钟(图7 (c)),一个动作由dTPP共享只有在较高的浓度。

4所示。讨论

我们的研究评估,首次mitochondria-targeted抗氧化剂MitoQ的影响在体外和在活的有机体内实验AP模型。以前的临床前评价抗氧化剂AP模型产生了不同的结果,与诊所到目前为止(不成功的翻译12]。混杂因素之前,可能有积极影响的结果在实验模型中抗氧化评价大多是这样代理管理作为预处理;在疾病的感应,这并不充分反映临床情况。因此在目前研究MitoQ被作为治疗诱导后,美联社在两个实验模型。CER-AP是最常用的动物模型之一的美联社但几乎没有临床相似之处(7),而TLCS-AP模仿胆石病原学与坏死性胰腺炎胰腺头与中度到重度的系统性表现有关,包括大大升高血清il - 6。

MitoQ可以发挥保护作用在不同与氧化应激相关疾病模型,包括结肠炎(24),脑脊髓炎(25)、糖尿病(26),心脏ischaemia-reperfusion损伤(27),和脓毒症28]。然而,MitoQ的行为在美联社的两个小鼠实验模型是复杂的,与TLCS-AP受治疗影响线粒体的抗氧化。虽然没有研究直接测量氧化应激在鼠标TLCS-AP,高架标记已被证明在胰腺和红细胞在大鼠胰腺导管牛磺胆酸盐后政府(29日- - - - - -31日]。劳和他的同事们的研究(30.)表示,虽然ROS可能是介质的组织损伤,细胞外代就没有引起典型的生化和形态学变化表明AP;缺乏在当前TLCS-AP MitoQ模型的保护作用会支持这一观点。相比之下,通用(NAC)抗氧化剂防治作用,阻止oxidant-induced ROS增加胰腺腺泡的细胞(32),组织坏死,减少白细胞浸润、水肿,出血taurocholate-induced美联社的老鼠,虽然这是作为预处理而不是postinsult [33]。然而,一项调查相比,小鼠CER-AP特别是南京政府之前和之后的影响第一caerulein注入;只有预防性治疗成功地限制了实验AP严重程度而抗氧化治疗postinsult是无效的34]。

在目前研究的一些保护措施MitoQ CER-AP模型中很明显,虽然效果被dTPP nonantioxidant控制变量和共享。因此,MitoQ部分保护的严重性CER-AP胰腺组织病理学评估,但没有显著减少胰腺坏死,增加分离胰腺腺泡的细胞。无明显降低血清淀粉酶或胰腺胰岛素,同时MitoQ同时提升系统损伤肺MPO活性和血清il - 6等标记。此外,也许令人惊讶的是,dTPP显著提高整体和个体胰腺组织病理学评分,降低胰腺癌胰蛋白酶,胰MPO活性降低。目前dTPP的解释任何有益的效果尚不清楚,但一些有害的MitoQ可能导致抗氧化活性的影响。之前我们已经表明,ROS抑制在孤立的胰腺腺泡的细胞暴露于tlc导致坏死,减少细胞凋亡,表明这些细胞ROS的保护作用[14]。在高剂量MitoQ和dTPP引起线粒体两极化本身和增加胰腺腺泡的细胞死亡,可能表明非特异性毒性作用可能与解偶联行动由于积累脂酰链的线粒体。脂肪酸被解开氧化磷酸化和之前我们已经表明,应用引起的长链脂肪酸分离胰腺腺泡的细胞线粒体两极化,NAD (P) H和ATP的损失,导致坏死(35,36]。在本研究MitoQ和dTPP增强基底和CCK-induced坏死细胞死亡鉴定。

有趣的是,MitoQ施加对中性粒细胞ROS生产两相的影响,产生的激活NAD (P) H氧化酶。因此,它最初抑制PMA-induced急性ROS峰值在8分钟后来会加强高原40分钟。这个初始的抑制作用不是由dTPP共享,表明这是归因于MitoQ ROS清除的特性。相比之下,NAD (P) H氧化酶抑制剂DPI,也同样急性ROS水平降低,完全废除了后期阶段。中性粒细胞,占大约60%的白细胞,是必不可少的先天免疫和最早的炎症细胞到达感染/损伤部位(37]。在实验AP模型,组织学显示中性粒细胞适度积累后胰腺2小时内诱导和丰富在6小时。在临床急性胰腺炎、招生和胰腺的中性粒细胞浸润和远处器官疾病的一个主要特征(38]。中性粒细胞可能会进一步加重组织损伤释放活性氧生成的NAD (P) H氧化酶(15)或脱粒和发布他们的核内容形成细胞外陷阱(39]。血清il - 6,主要由髓细胞分泌包括中性粒细胞,细胞因子是一个已知的胰腺损伤连接到远端器官损伤(40),也是对人类AP严重程度标志(41]。因此,ROS整体增产MitoQ引起的中性粒细胞和dTPP可能促进肺癌MPO、生成次氯酸和活性氧化剂,进一步提升其活动。事实上,MitoQ和dTPP所用的剂量在活的有机体内实验肺MPO活性显著增加本身(数据没有显示)。

5。结论

总之,这项研究的结果进一步强调了不适当的抗氧化疗法治疗AP,之前强调的一个随机,双盲,安慰剂对照的临床试验(42]。没有保护实验TLCS-AP温和CER-AP MitoQ和混合效果观察的模型,包括炎症标记物的海拔。这些结果按照先前的研究表明,抑制ROS提高胰腺腺泡的细胞坏死通过抑制凋亡保护机制(14),一个动作,促进当地的胰腺损伤的美联社。

利益冲突

作者宣称没有利益冲突有关的出版。

确认

这项工作是支持通过BBSRC和MRC(英国)和国家卫生研究所资助NIHR利物浦胰腺生物医学研究单位,英国。魏黄被授予英国/中国优秀研究生奖学金。李文是英国从中国获得奖学金奖学金委员会。魏黄和妮可现金贡献同样这项研究。