文摘
Irisin是纤连蛋白的裂解和分泌片段类型III域包含5 (FNDC5)主要是发布的骨骼肌和提出了协调运动对代谢的有益作用。在目前的研究中我们旨在调查irisin的循环水平的调节肥胖动物模型(食源性肥胖大鼠(戴奥)及leptin-deficient (ob / ob)小鼠),以及营养状况和瘦素的影响。Irisin水平测定,酶联免疫吸附试验(ELISA)和放射免疫检定法(RIA)。血清irisin水平未戴奥老鼠和ob / ob老鼠。此外,它的循环水平也影响禁食,瘦素缺乏,在啮齿动物和外生瘦素管理。尽管这些负面结果时,我们发现irisin和胰岛素之间的负相关戴奥动物和irisin和葡萄糖之间的正相关关系在短期营养状况的变化。我们的发现表明血清irisin水平不是由不同的生理调节设置相关能源体内平衡的改变。这些结果表明,在啮齿动物中循环水平irisin不参与肥胖的病理生理学和可能与代谢状态无关;然而,进一步的研究应该澄清其精确作用葡萄糖稳态失衡的状态。
1。介绍
高能量饮食和久坐不动的生活方式的结合加快了肥胖及其并发症的发病率包括血脂异常、糖尿病和心血管疾病。炎症过程发挥着至关重要的作用在肥胖的发展。脂肪组织释放细胞因子il - 6和il - 1等β肥胖的目标一些组织如心脏、胰腺、肝脏(1]。缺乏身体活动导致的内脏脂肪堆积诱发系统性低级炎症,进而锻炼促进各种新陈代谢有益的生物(2]。然而,它的作用机制仍然是难以捉摸的,许多努力集中描述新的分子靶点或介质的健康好处。骨骼肌是如今作为一个完整的内分泌器官(3),有超过1000个基因激活运动(4]。这些提议的介质之一是过氧物酶体proliferator-activated受体γ1α(PGC1 -共激活剂α发布的),一个转录辅激活肌肉诱发线粒体生物起源,因此生热作用[5,6)以及调节血糖、脂质和能量体内平衡(7,8]。PGC1 -α诱发的纤粘连蛋白的表达类型III域包含5 (FNDC5)基因是裂解,分泌激素从骨骼肌命名irisin8]。FNDC5于2002年同时具有两个独立的团体(9,10),但十年后当irisin吸引了更大的兴趣,因为据报道作为中介的有益作用的运动(8),增加代谢解偶联热量消耗和促进褐变(8,11,12),导致肥胖和葡萄糖体内平衡的改善。然而,进一步的研究在动物和人类有争议的报道结果和执行irisin仍在辩论的生理作用(2,8,13- - - - - -18]。
另一方面,几项研究评估人类irisin的循环水平,发现有争议的结果,因为他们中的一些人报告的条件下增加irisin肥胖(19,20.)当别人发现负面irisin水平和肥胖之间的联系(21]。而且最近被发现在人类这两个参数之间没有联系(22]。因此,循环irisin水平降低手术后(23]或dietary-induced [24减肥。在啮齿动物中,基因表达的结果表明骨骼肌FNDC5 mRNA水平成正比循环瘦素水平(25]和FNDC5表达式在戴奥动物不同的规定根据脂肪得宝(26]。然而,没有数据循环irisin肥胖的啮齿动物和某些生理条件下其监管相关的体重变化非常稀缺。本研究的目的是评估血清irisin的监管水平营养状况、瘦素和食源性肥胖在啮齿动物。
2。材料和方法
2.1。动物
男性Sprague-Dawley老鼠(培育Animalario Xeral南加州大学;西班牙圣地亚哥德孔波斯特拉)和ob / ob老鼠(查尔斯河,巴塞罗那,西班牙)被安置的条件下控制照明(12:12 h光/暗周期),湿度和温度。动物喂养标准饮食(动物食品科学与工程、蛋白质16%,碳水化合物60%,脂肪3%)和自来水随意除非另有指示。动物们从其他实验动物牺牲在另一个房间,和血液样本在1500 g离心10分钟和血清是收获和储存在−80°C到可以进行分析。综述了所有实验程序和伦理委员会批准的圣地亚哥德孔波斯特拉大学的依照制度指导和严格遵守欧盟规范性的护理和使用实验动物。每个实验中使用的动物数量设置显示在相应图的标题。
2.2。实验设置1:饮食对血清Irisin水平的影响
断奶后,6男Sprague-Dawley要么老鼠喂食高脂肪的饮食(高频)(能量)的60%或低脂饮食(低频)(能量)的10%(参考#:D12492, D12450B resp。,研究饮食,新泽西,美国)10周。
2.3。实验设置2:食物不足对血清Irisin水平的影响
只10周大的雄性老鼠的食物被剥夺了48 h,或者裁判24 h后禁食而对照组随意(27,28]。所有的动物都有免费的自来水。
2.4。实验设置3:瘦素对血清Irisin水平的影响
系统性的影响瘦素血清irisin管理水平进行了研究瘦素缺乏小鼠(ob / ob老鼠)。Leptin-deficient动物被称为野生型(WT)控制动物,分布在三组:(a) ip车辆随意,(b) ip车辆后36小时禁食,在美联储和(c) ip瘦素随意老鼠。动物对待重组瘦素(l - 4146, Sigma-Aldrich)剂量为0.5毫克/公斤体重每6 h 3天(腹腔内注射)29日]。
2.5。身体成分测量
身体成分(脂肪和肌肉)评估使用核磁共振成像系统(整个身体成分分析仪;美国休斯顿EchoMRI)正如前面所示30.,31日]。
2.6。测量的生化和荷尔蒙的参数
Irisin和胰岛素水平用ELISA测定试剂包和方法提供的凤凰制药公司和密理博公司。这些包是适合人类、老鼠和老鼠,在先前的研究20.,24,32- - - - - -34]。irisin的定量测定血清样本进行了使用商业酶联免疫试剂盒针对FNDC5蛋白质的氨基酸33 - 142 (irisin酶联免疫试剂盒ek - 067 - 52个;凤凰制药公司,CA)根据制造商的指示。每个样品的吸光度测量中重复使用光谱光度测量的标在波长450 nm (Versamax标;Associates的科德角合并,东法尔茅斯,MA)。内部和interassay系数变化的工具包是4 - 6%和8 - 10%,分别。Irisin水平也取决于RIA使用试剂凤凰制药有限公司提供的工具和方法(贝尔蒙特,CA;猫。不。rk - 067 - 16)。 For testing serum irisin levels, the samples were obtained from trunk blood by decapitation and were collected in tubes for serum separation (BD Vacutainer SST II Advance). Results were expressed as ng per milliliter of irisin in serum. Serum samples were tested in duplicate within one assay, and the results were expressed in terms of the rat irisin standard (ng/mL).
每个样品的吸光度对胰岛素水平测定在重复使用光谱光度测量的标在波长450 nm和590 nm。内部和interassay系数变化的工具包是1 - 4%和6 - 9%,分别。血清样本进行重复在一个试验,结果是表达的大鼠胰岛素标准(ng / mL)。
葡萄糖和总胆固醇测定(Spinreact、赫罗纳、西班牙)的使用比色测定法(如前所述)(35]。
2.7。免疫印迹分析
如前所述(执行免疫印迹36,37]。白色脂肪组织(窟)和褐色脂肪组织(蝙蝠)解剖和存储在−80°C,直到进一步的处理。
窟和蝙蝠在冰冷的均质裂解缓冲包含50更易与L Tris-HCl (pH值7.5),1更易/ L EGTA 1更易/ L EDTA,特里同x - 100 1%, 1更易/ L原钒酸钠,50 L更易与氟化钠,5 L更易与焦磷酸钠,0.27 mol / L蔗糖0.1% 2-mercaptoethanol,完整的蛋白酶和磷酸酶抑制剂鸡尾酒(1片/ 50毫升;罗氏诊断,德国曼海姆)。匀浆在13000 g离心10分钟在4°C,上层清液被移除,整除被存储在−80°C。
窟和蝙蝠溶解产物进行sds - page凝胶。短暂,总蛋白质溶解产物从窟和蝙蝠(20μg)受到的8%和12% SDS聚丙烯酰胺凝胶和electrotransferred聚乙二烯二氟化物膜。膜被封锁的1 h TBS-Tween 20 (TBST: 50更易与L Tris-HCl pH值7.5,0.15 mol / L氯化钠和0.1%渐变20)含3% BSA和探测16 h在TBST 4°C,表示3% BSA抗体:il - 6 (ab - 6672), il - 1β(ab - 9722) (Abcam,剑桥,英国);PGC1α(sc - 13067)(圣克鲁斯生物技术、圣克鲁斯,CA),α微管蛋白(t - 5168)β肌动蛋白(a - 5316) (Sigma-Aldrich)。对蛋白质检测我们使用辣根peroxidase-conjugated二级抗体(斯特鲁普Daku丹麦,丹麦)和化学发光(皮尔斯ECL免疫印迹基质,热科学、美国)。然后,膜暴露在x射线胶片(超级RX,富士医学x光胶片,富士胶片、日本)和开发的开发人员和修理液体(德国爱克发)在适当的暗室条件下。我们使用七个样品每组和蛋白质水平正常化β肌动蛋白(窟)和α微管蛋白(蝙蝠)为每个样本。
2.8。统计数据
结果显示为平均值±标准误差的意思。使用学生的统计分析以及(两组分析时)或单向方差分析之后事后多重比较检验(图基测试)(以上两组分析时)。一个值小于0.05被认为是具有统计学意义;图棱镜软件(圣地亚哥,CA)是用于数据分析。相关研究统计分析使用SPSS 20.0版软件统计软件包(SPSS,芝加哥,IL)。变量之间的关系进行了分析由皮尔森相关(正态分布数据)或斯皮尔曼等级相关系数(非正态的分布数据)()。一个被认为具有统计显著性值小于0.05。
3所示。结果
正如所料,在高频饮食喂养的大鼠体重越高(图1(一))符合精益质量指数显著增加脂肪和低频饮食喂养大鼠相比(表1)和il - 1的蛋白水平显著增加β在窟但是il - 6(图2(一个))。我们没有一个明确的解释这一事实,但可能是由于有限的时间阐述饮食(10周)或因为总il - 6和肥胖之间的正相关关系并不总是一个强有力的证据,因为缺乏il - 6已被证明导致肥胖和胰岛素抵抗在啮齿动物38]。然而,戴奥老鼠少吃的食物量比低频的饮食喂养的老鼠,因为高频饮食是hypercaloric食品和这些老鼠相比需要更少数量的食物满足hypocaloric低频饮食喂养动物(图1 (e))。相应地,这些戴奥大鼠高血糖的血糖(表1)和显示高胆固醇水平的趋势虽然这种趋势并不显著(表1),如前所述22]。关于肥胖的单基因模型,ob / ob老鼠表现出高体重(图1 (b))和食物摄入量(图1 (f)),类似于戴奥老鼠,ob / ob显示显著增加小鼠胰岛素,血糖和胆固醇水平对WT控制(表1)和高水平的炎症标记物在窟(图2 (b))。此外,我们测量这些生化和荷尔蒙的水平参数在大鼠的血清提交短期营养状况的变化。正如预期的那样,一个48小时空腹血清诱发显著降低血糖和胰岛素水平相比随意喂动物和总胆固醇水平(表中显著增加1)[39,40]。
(一)
(b)
(c)
(d)
(e)
(f)
(g)
(h)
(一)
(b)
(c)
人类肥胖(自循环irisin水平增加19,20.),我们评估血清irisin水平两个动物肥胖模型:戴奥老鼠模型的多基因的肥胖和ob / ob小鼠模型的单基因肥胖。在啮齿动物肥胖模型,血清irisin水平仍然没有改变。高频的饮食喂养的老鼠表现出类似的血清irisin水平作为低频饮食动物美联储在10周(图3(一个))。有趣的是,这些结果符合人类最近的一项研究[22]。同样,循环irisin水平保持不变的WT与肥胖老鼠缺乏瘦素(ob / ob老鼠)(图3 (b))。值得注意的是,缺乏不同循环irisin肥胖两种模型被发现,尽管不同的身体重量(数字1(一)和1 (b))。irisin水平持平在长期肥胖动物模型,我们下一个目标来确定irisin可能受短期营养状况的变化。为了测试这一假说,我们测量irisin在动物喂食随意在食物不足。血清irisin水平保持不变的48 h后禁食或当老鼠ref 24 h(图3 (c))。瘦素是主要的球员之一在能量平衡的规定,我们进行了食物匮乏和瘦素替换ob / ob老鼠证实了我们之前的数据。此外,我们测量PGC1——的水平α,提出了上游irisin调节器的蝙蝠。我们发现一个非常PGC1 -蛋白质含量明显减少αob / ob老鼠相比WT老鼠(图2 (c));然而,这些水平增加了瘦素治疗(图2 (c))如前所述41,42]。
(一)
(b)
(c)
(d)
符合我们之前的发现,我们未能发现重大变化循环irisin水平ob / ob小鼠禁食36 h ob / ob白鼠相比随意(图3 (d)瘦素),管理的外生ob / ob小鼠血清中没有造成任何重大变更irisin水平(图3 (d))。然而,尽管食物匮乏和瘦素显著降低体重引起的(图1 (c))和食物摄入量(图1 (g))和蛋白质水平变化PGC1 -α(图2 (c))leptin-deficient老鼠。
值得注意的是,这种缺乏血清irisin水平的差异在这些动物模型复制在一个独立的实验中通过使用放射免疫检定法(数据没有显示)。
最后,我们之间也进行了相关性研究血清irisin与身体成分参数和生化和荷尔蒙水平(数字4和5;表2)。我们没有找到任何脂肪量之间的相关性,精益质量,或胆固醇水平和irisin不同模型研究(数据4(一),4 (b),4 (c),4 (d);数据5(一个),5 (c),5 (d),5 (e),5 (f),5 (h),5(我);表2);然而,我们发现irisin和胰岛素之间的负相关戴奥模型(图5 (b);表2)如前所述在人类21)和葡萄糖之间的正相关和irisin短期营养状况的变化(图5 (g);表2)。
(一)
(b)
(c)
(d)
(一)
(b)
(c)
(d)
(e)
(f)
(g)
(h)
(我)
4所示。讨论
irisin创造了一个伟大的发现期望由于其提出有益的代谢影响。然而,知识irisin监管和分泌仍不足,结果是有争议的。从这个意义上说,肥胖已报告的循环irisin水平是负相关的肥胖男性(21),而其他人则表示,irisin水平高在肥胖人士或者是身体质量指数呈正相关(19,20.,23,43]。在啮齿动物中,结果是同样的模棱两可,结果表明,血清irisin水平减少肥胖大冢Long-Evans德岛脂肪(OLETF大鼠相比,瘦老鼠(25),在肥胖Zucker老鼠(26),但增加了戴奥大鼠(26]。在当前的研究中,我们分析了血清irisin水平在两个不同的肥胖动物模型,戴奥大鼠模型的多基因的肥胖和ob / ob小鼠作为模型的单基因肥胖。在这两种情况下,我们的结果都是相同的,因为我们没有发现任何显著性差异精益和肥胖的动物之间和谐人类肥胖的研究(22]。尽管所有这些结果在不同的肥胖动物模型不指向同一个方向,重要的是要强调每个模型与不同的代谢改变,可能影响irisin水平。例如,OLETF大鼠糖尿病而戴奥大鼠胰岛素抵抗而不是糖尿病。这是一个关键问题,因为irisin在葡萄糖代谢的作用仍在辩论(21,32,44,45]。需要注意的另一个关键方面是irisin的方法用于测量。这些方法论方面可能影响导致戴奥老鼠。从这个意义上讲,研究Roca-Rivada和同事评估血清irisin水平免疫印迹(26而我们radioimmunoassay-based方法使用。尽管这些差异不同的动物模型或方法,我们目前的结果表明,循环irisin水平在啮齿动物不受肥胖的影响。
因为肥胖的啮齿动物代表模型与长期代谢变化和补偿机制,我们下一个评估如果irisin含量可能会在短期内影响代谢改变的情况下。营养状况引发各种内分泌轴的变化提出了如果irisin代谢调节剂,我们假设它应该由禁食。然而,我们没有找到任何改变血清irisin水平通过热量限制或重新喂料,表明其循环水平不受营养状况的影响。我们的研究结果与之前的研究一致表明减肥引起的热量限制在老鼠没有调节循环irisin水平(46]。另一方面禁食和热量限制都是许多代谢改变有关,和一个最相关的瘦素水平下降。以往作品显示瘦素和irisin之间可能的相声因为irisin水平与瘦素在人类和老鼠21,25),和增加瘦素mRNA的表达PGC1 -α(41,42上游),该调节器irisin [8]。而且最近它表明瘦素治疗略上调ob / ob老鼠[循环irisin水平47]。因此,我们决定在深度调查可能的特定的瘦素和irisin之间的相互作用。为了测试这种交互,我们测量irisin水平的模型hypoleptinemia执行瘦素替代ob / ob老鼠。我们的数据表明,循环irisin水平保持不变的瘦素后政府在这些老鼠无论实验组。因此,这些结果表明,血清irisin水平不是由瘦素调节我们的实验范式。最后,我们用身体成分进行相关性研究的irisin,生化和荷尔蒙的参数。符合我们之前的结果我们没有找到任何他们的大多数参数之间的相关性研究(数据4(一),4 (b),4 (c),4 (d);数据5(一个),5 (c),5 (d),5 (e),5 (f),5 (h),5(我);表2);然而,尽管这些负面结果我们发现irisin和胰岛素之间的负相关在戴奥动物如前所述在肥胖受试者(21)和irisin和葡萄糖之间的正相关关系在短期营养状况的变化(数据5 (b)和5 (g);表2)。这些数据表明,irisin可以扮演一个角色在涉及障碍的葡萄糖体内平衡的状态。
综上所述,我们得出这样的结论:血清irisin水平似乎是根据我们目前的结果不受肥胖、营养状况、瘦素在啮齿动物。然而,重要的是要注意的一个限制的解释目前的结果是数据是基于直接irisin测定血清样本没有机制探索与代谢或信号转导研究irisin肥胖模型。irisin进一步的研究将需要澄清其精确的在调节能量平衡中的作用和其潜在的治疗肥胖及其并发症中使用。
利益冲突
作者宣称他们没有利益冲突在本文的作者或出版。
作者的贡献
而Folgueira和爱丝特雷娜Sanchez-Rebordelo贡献同样这项工作。
确认
3月醌类的博士后奖学金接受者加利西亚政府(Xunta德加利西亚ED481B2014/039-0)。而Folgueira是由伊迪。爱丝特雷娜Sanchez-Rebordelo的奖学金Ministerio de隐藏y Competitividad (ref: bes - 2013 - 062796)。奥马尔Al-Massadi由ISCIII / SERGAS认为研究合同“莎拉博雷利”(CD14/00091)。