文摘
客观的。间歇性缺氧(IH)是一个重要的组成部分,睡眠呼吸暂停综合征及其代谢疾病的并发症主要归因于IH。病理生理学仍知之甚少但也有一些相似之处与肥胖相关代谢疾病的并发症。因为后者的结果炎症涉及toll样receptor-4 TLR4信号,我们评估这个途径代谢疾病IH的后果。方法。精益成年男性TLR4-deficient (TLR4−−/老鼠和他们的控制(C57BL / 6小鼠)受到IH (FiO)221 - 5%,1分钟周期,8小时/天)或空气(常氧小鼠)4周。动物在1周评估暴露在四周接触后胰岛素耐量试验和形态学和附睾的炎症改变脂肪和胸主动脉。结果。IH诱导胰岛素抵抗,形态和附睾的炎症改变脂肪(小垫和脂肪细胞,释放肿瘤坏死因子-高α和il - 6)和主动脉(更大的和更高的NF内膜-中膜厚度κB-p50活动)。所有这些改变都是通过TLR4删除。结论。IH诱发代谢和血管改变,涉及TLR4介导的炎症。这些结果证实炎症的重要作用的代谢疾病后果IH和建议针对TLR4 / NFκB通路可能是睡眠呼吸暂停患者的治疗选择。
1。介绍
阻塞性睡眠呼吸暂停(OSA)是一个公共卫生问题,因为它影响了至少10%的中年男人和代表一个心血管发病率和死亡率的主要原因(1]。阻塞性睡眠呼吸暂停综合症之间的一个独立的协会、胰岛素抵抗和2型糖尿病一直证明了许多横断面,观察,和大型人群为基础的研究2,3]。此外,阻塞性睡眠呼吸暂停综合症患者颈动脉内膜中层厚度(IMT)增加,动脉粥样硬化的早期迹象,这与夜间血氧饱和度下降,独立于其他心血管危险因素(4,5]。阻塞性睡眠呼吸暂停综合症的严重程度也可能预测神秘的冠状动脉粥样硬化在健康超重或肥胖的男性受试者(6]。重复在睡眠期间上呼吸道导致间歇性缺氧(IH)被认为是负责OSA-associated代谢疾病的并发症,包括动脉粥样硬化和胰岛素抵抗[7]。数据来自动物暴露在IH,睡眠呼吸暂停的实验模型进行验证,表明,交感神经系统的激活和系统性炎症IH-induced基础代谢和血管的后果7- - - - - -9]。我们最近也证明IH-induced附睾的炎症变化白色脂肪组织(EWAT)导致这些结果10]。
在肥胖,人们越来越认识到慢性炎症信号通路的激活是导致胰岛素抵抗[11和血管病变12]。最近的研究表明,这些有害的影响可能是介导的,至少在某种程度上,通过toll样受体的激活(TLR),特别是TLR4。通常是一个家庭的模式识别受体,发挥关键作用的先天免疫系统激活炎性信号通路对微生物病原体(13]。脂多糖(LPS)结合TLR4,引发下游级联,导致促炎核转录因子的激活kappa-B (NFκB)的表达途径,最后大量的促炎的分子,如白介素6 (IL)和肿瘤坏死因子(TNF)α(14]。此外,研究不同品系的小鼠表明TLR4的表达和激活参与主动脉炎(15]和[血管硬化16]。在这些实验数据证实TLR4 / NF的重要作用κB通路之间的串扰炎症、动脉粥样硬化、新陈代谢障碍。
之前在C57BL / 6小鼠,我们发现IH-induced心血管炎症NF的活动增加的特点κB在主动脉(17)和心脏组织(未发表的数据)。我们还报道,在精益动物,EWAT暴露在IH成为病态,表现得像多余的脂肪肥胖,因为它表现出增加巨噬细胞招聘和分泌il - 6和TNF -α(10]。总的来说,这些数据表明,代谢疾病并发症由于IH和肥胖可能分享一些病理生理机制。因此,我们评估是否涉及代谢和血管引起的后果IH促炎TLR4 / NFκB途径激活。
2。方法
2.1。动物
男性(TLR4 TLR4-deficient老鼠−−/、C57BL / 6背景)最初开发Shizuo彰博士(微生物研究所疾病,大阪,日本),从艾玛(欧洲鼠标变异)获得网络在新奥尔良,法国。Seventeen-week-old男性TLR4−−/小鼠和对照组(C57BL / 6小鼠)美联储standard-chow饮食。他们在整个实验。这项研究是按照欧洲公约进行保护脊椎动物用于实验和其他科学(123年欧洲委员会,欧洲条约ETS,斯特拉斯堡,1986年3月18日)和指导护理和使用实验动物(NIH没有出版。85 - 23,1996年修订)。
2.2。间歇性低氧
TLR4−−/及其控制C57BL / 6小鼠被分为2组,暴露于间歇性缺氧(IH)或normoxia (N) IH如前所述执行。10]。的四组动物暴露在IH刺激白天(每笼,8小时/天,循环FiO 21 - 5%2,60年代周期(60事件/ h),最低血氧饱和度60%)4周。FiO2测量气体分析仪(ML206 ADInstruments)在整个实验。控制动物(老鼠常氧、N)暴露在空气中类似的笼子里重现类似的噪音和动荡的IH刺激。环境温度保持在20 - 22°C。
IH接触的第一个星期期间,腹腔内胰岛素耐量试验(IpITT)进行评估全球胰岛素敏感性,当天最后的曝光时间后,禁食动物牺牲麻醉与腹腔内注射氯胺酮(100 mg·公斤−1)和甲苯噻嗪(10 mg·公斤−1)进行进一步分析。
2.3。腹腔内胰岛素耐量试验(IpITT)
小鼠禁食了5小时,然后加权之前血液收集尾尖的基线血糖测定()。使用OneTouch超glucometer血糖测量。胰岛素(0.5 IU·公斤−1体重,诺和诺德公司/ S, Bagsvaerd,丹麦)腹腔注射,紧随其后的是更多的血糖测量15岁,30岁,60岁,90分钟后注入。最低的胰岛素后血糖水平(最低点)政府为每个实验组计算。
2.4。血胆固醇测量
牺牲的时候,血液通过心脏穿刺收集EDTA管。等离子体分数收集期间血离心后10分钟11000转(4°C)。总胆固醇是由比色测量等离子体酶反应使用无穷工具包(美国马萨诸塞州热电子公司)根据制造商的指导方针。
2.5。附睾的白色脂肪组织(EWAT)改变
收集双边附睾的脂肪垫、加权和脂肪细胞形态学研究固定在90%的乙醇或细胞因子决定的孵化。
2.5.1。脂肪细胞形态
Ethanol-fixed,石蜡包埋EWAT分段(3.5μ米),在甲苯和水化deparaffinized下行乙醇系列,然后沾hematoxylin-eosin评估组织形态。脂肪细胞的大小是衡量从照片(10×40放大)使用NIS-Elements显微镜成像软件(尼康)。
2.5.2。细胞因子的分泌
每个EWAT垫被分成两等份,孵化在37°C有轻微摇晃RPMI媒介。120分钟的孵化后,il - 6和TNF -α测量在上层清液使用ELISA测试根据制造商的指示(欧洲研发系统、里尔、法国)。细胞因子浓度表示为ng / mL 1克脂肪组织。
2.6。评估血管炎症和重塑
2.6.1。主动脉内膜中层厚度(IMT)
IH和N主动脉是嵌入在最佳切削温度(10月)化合物(Tissue-Tek,樱花Finetek欧洲BV,阿尔文,长荷兰),切割(10μ米),染色。Hematoxylin-eosin染色是用来评估内膜中层厚度(IMT)。10日的形态学分析(15测量非邻接midthoracic每个动物降主动脉部分)进行了光学显微镜(尼康Eclipse 80 i,尼康)和NIS-Elements显微镜成像软件(尼康仪器欧洲BV)。
2.6.2。NFκB活动
我们调查了IH是否可以激活NFκB通过评估其激活单元NF的表达κB-p50易位到细胞核。核NFκB-p50决心在胸主动脉的老鼠暴露在N或IH。组织均匀化和蛋白质提取根据制造商的说明进行使用核提取工具包(比利时欧洲活动主题)。蛋白质浓度是评估使用BCA化验(ThermoScientific,麻萨诸塞州,美国)。核蛋白质化验为激活的存在p50使用TransAM NF ELISAκB-p65 / p50 p52工具包(欧洲活动主题)。NFκB活性表达任意单位。
2.7。统计分析
结果表示为平均值±标准错误的方法(SEM)和分析使用双向方差分析和后续Bonferroni多个事后比较或Mann-WhitneyU测试。统计学意义是。
3所示。结果
3.1。TLR4缺乏阻止IH-Induced脂肪组织炎症和重塑
C57BL / 6小鼠暴露于IH EWAT的形态和功能变化。他们有更小的小脂肪细胞脂肪垫(数字1(一),1 (c),1 (d)),EWAT释放更多的TNF -α和il - 6与常氧控制(数字1 (e)和1 (f))。所有这些改变在缺氧TLR4缺席−−/老鼠。关于体重的改变,常氧和缺氧TLR4−−/老鼠不不同于各自控制动物(图1 (b))。
(一)
(b)
(c)
(d)
(e)
(f)
3.2。TLR4缺乏防止IH-Induced胰岛素抵抗
一周的曝光后,实验组4评估胰岛素耐量试验(图2(一个))。C57BL / 6小鼠暴露于IH表现出响应胰岛素降低葡萄糖减量(图如图所示2 (b))和一个趋势较小的葡萄糖最低点相比,他们常氧控制(图2 (d))。缺氧TLR4的胰岛素反应没有影响−−/老鼠:响应曲线几乎与常氧TLR4 superposable−−/动物(数据2 (c)和2 (d)),而不是显著不同的曲线常氧C57BL6动物(图2(一个))。
(一)
(b)
(c)
(d)
3.3。TLR4缺乏阻止IH-Induced炎症性血管重建
缺氧C57BL / 6小鼠主动脉的形态和功能改变,因为他们表现出更大的(内膜-中膜厚度数据3(一个)和3 (b))和更高的NFκB-p50活动(图3 (c))。这些改变不是在缺氧TLR4观察−−/老鼠(图3(一个),3 (b),3 (c))。血浆总胆固醇水平没有差异(图4实验组3 (d))。
(一)
(b)
(c)
(d)
4所示。讨论
的病理生理学OSA-induced代谢疾病后果仍知之甚少。有一些由于肥胖和代谢疾病并发症相似,后者涉及TLR4信号导致的炎症。在这里,我们显示在nonobese IH诱导C57BL / 6小鼠形态和炎症性血管重塑和白色脂肪组织胰岛素抵抗。这些改变是预防小鼠在缺氧TLR4-deficient表明IH-induced代谢疾病后果涉及TLR4 signaling-mediated炎症。
4.1。方法论的注意事项
正如前面发表了我们组和其他人来说,我们使用了一个深间歇性缺氧主要模仿严重的睡眠呼吸暂停患者而遭受轻度至中度睡眠呼吸暂停综合症(7,17,18]。事实上,在没有其他因素如肥胖、高脂肪饮食,和遗传脆弱性,IH需要严重到足以产生可测量的和可再生的血管改变,尤其是在C57BL / 6小鼠的atheroresistant动物(7]。
4.2。IH-Induced EWAT改造涉及TLR4介导的炎症
在精益C57BL / 6小鼠,我们表明,IH诱导EWAT改变特点是脂肪垫浪费和萎缩的脂肪细胞。这些结果与之前的报道相一致在精益C57BL / 6 (19)和载脂蛋白e−−/(10)小鼠IH 4和6周后,分别。脂肪细胞萎缩暗示的脂解作用,循环游离脂肪酸升高(远期运费协议)已报告由美国和其他IH-exposed动物(10,20.,21和患有睡眠呼吸暂停的病人22]。在后者,血浆FFA水平与低通气指数呈正相关(22]。该项受体的激活是一个著名的脂解作用机制(23),IH和阻塞性睡眠呼吸暂停综合症通常与sympathoadrenergic激活(10,24]。脂肪炎症可能也导致脂解作用[25)我们发现增加释放炎性细胞因子TNF -α和白细胞介素6缺氧C57BL / 6小鼠的脂肪垫。这也是与先前的报道在精益ApoE一致−−/6周后,小鼠IH [10),最近在3 t3-l1脂肪细胞暴露于氧浓度波动(26]。这些炎症变化可能是由于局部组织缺氧(27),这是EWAT失调的主要原因(28等),以及系统性影响升高循环远期运费协议(29日)和激活sympathoadrenergic系统(10]。
我们发现IH-induced形态和炎性改变EWAT被阻止在TLR4-deficient老鼠。越来越多的研究证明使用激活小鼠肥胖模型的促炎TLR4 / NFκB通路构成一个链接机制,炎症和代谢紊乱30.- - - - - -32]。尽管TLR4激活是提高脂类分解(33,34),我们惊奇地发现,EWAT浪费和脂肪细胞不足生长完全阻止TLR4-deficient老鼠表明TLR4信号可能是这些后果的主要机制。食源性肥胖的老鼠模型中观察到的(30.,32),TLR4缺乏预防的增强版本TNF -α和白细胞介素6小鼠缺氧。这加强了TLR4 IH-induced炎症的作用,与肥胖以及病理生理学相似之处,也就是说,一个正常的脂肪含量在缺氧表现得像过多的脂肪在肥胖10]。
4.3。IH-Induced胰岛素抵抗包括TLR4信号
我们发现IH诱导C57BL / 6小鼠胰岛素抵抗。这是在协议与先前的研究结果在不同品系小鼠获得(遗传肥胖,瘦C57BL / 6,和载脂蛋白e−−/老鼠)和IH曝光时间(急性或慢性IH),使用不同的方法来评估胰岛素敏感性(HOMA-IR、ITT公司血糖euglycemic夹)10,19,35,36]。这证实了IH的角色改变的葡萄糖稳态中观察到睡眠呼吸暂停,胰岛素抵抗与阻塞性睡眠呼吸暂停综合症严重恶化,独立于肥胖(37- - - - - -39]。这种关系也被证实在健康人体内实验暴露在IH [40]。两个慢性炎症(11和FFA水平升高41,42)建立因素导致肥胖胰岛素抵抗。确实从脂肪细胞分泌的促炎细胞因子obesity-induced胰岛素抵抗被认为是作为一个关键的一步,为唯一TNF -α中和在肥胖老鼠就足以改善胰岛素敏感性(43]。相反,上游的激活炎性细胞因子级联使用的toll样受体受体激动剂会导致胰岛素抵抗[33,34]。在目前的研究中,我们观察到增加释放肿瘤坏死因子-α和白细胞介素6 EWAT和缺氧C57BL6小鼠胰岛素敏感性下降。两个参数都没有受损TLR4-deficient老鼠表明TLR4介导炎症参与代谢的结果。体重变化不为这些改进,缺氧C57BL / 6和TLR4-deficient小鼠体重相似。
4.4。IH-Induced血管重建涉及TLR4信号
我们发现IH诱导血管重建,包括形态学(大)内膜-中膜厚度和炎性改变(NF更高κB-p50活动)。这证实了我们之前的结果以及其他有关装修带来的不利影响IH preatherosclerotic (17,18和动脉粥样硬化21,44,45)的过程。我们在目前的研究证实,IH的确是一个强大的血管压力,只有28天的接触,这是非常短的与人类疾病的持续时间相比,诱导早期血管改变atheroresistant C57BL / 6小鼠品系。除了著名的角色sympathoadrenergic系统和相关的血流动力学改变18),越来越多的证据表明炎症早期参与IH-related动脉粥样硬化的病理生理学45]。关于动脉粥样硬化加重的ApoE-deficient IH的老鼠,我们最近证明,这涉及炎性改变EWAT有害的影响,作为EWAT脂肪切除预防IH的proatherogenic效应(10]。有趣的是,这种有益的效应时发生胰岛素抵抗(一个著名的动脉粥样硬化的危险因素)并不是提高EWAT脂肪切除,这表明EWAT炎症可能是主要的行列式IH-induced atherogenicity。在这里,我们表明,从缺氧EWAT C57BL / 6小鼠释放大量的炎性细胞因子,这种效果,以及主动脉形态学和炎性变化,防止在TLR4-deficient动物。鉴于TLR4在脂肪组织炎症和胰岛素抵抗中的作用[46,脂肪组织炎症之间的关系,胰岛素抵抗和血管功能障碍(12,47TLR4的有益作用,缺乏对动脉重塑的预防可以解释脂肪炎症和胰岛素抵抗。这里,EWAT炎症的作用似乎主要相比光改善胰岛素反应和缺乏胆固醇改变这些动物。IH-induced dyslipidemic改变老鼠确实是易变的(45,48- - - - - -50),这表明血脂异常部分只占血管重建的第一步在这个模型。减少IH-driven血流动力学改变可以进一步解释,TLR4-deficient老鼠不太容易高血压(51,52]。最后,直接影响血管壁也是可能的,TLR4已经证明人类[53和小鼠54动脉粥样硬化斑块,抑制TLR4信号通路减毒食源性ApoE的动脉粥样硬化−−/老鼠(16,55]。最近的一项研究还发现了TLR4信号通路直接血管炎症和内皮损伤的关键中介胰岛素信号在肥胖的设置15]。对脉管系统甚至可以主导的直接影响,如LDLR TLR4缺乏预防动脉粥样硬化−−/老鼠,没有影响脂肪组织炎症和全身胰岛素敏感性(56]。
5。结论
我们在nonobese IH诱导C57BL / 6小鼠形态和炎症主动脉和附睾的白色脂肪组织的重塑,以及胰岛素抵抗。这些改变是预防TLR4-deficient老鼠表明IH-induced代谢疾病后果涉及炎症TLR4介导的信号。确切的机制和一种类型的组织或细胞的特定的角色(例如,脂肪组织)仍有待确定,TLR4基因敲除研究中使用没有特定细胞。TLR4确实表达了在许多细胞类型,主要的免疫系统,而且在nonhematopoietic细胞(如内皮细胞、上皮细胞,等等)。尽管有这些限制,实用的角度来看,整个身体暴露在缺氧睡眠呼吸暂停期间,和各细胞TLR4可能参与睡眠呼吸暂停的许多并发症。此外可用的治疗块TLR4激活(eritoran)不是细胞特定的。我们的结果是否可以外推到人类疾病仍有待确定。然而,一个临床研究最近调查了TLR4信号通路的激活在阻塞性睡眠呼吸暂停综合症。作者发现TLR4表达增加,NFκB核绑定,干扰素的释放γ肿瘤坏死因子-α,在循环单核细胞il - 6 (57]。有因此相似性这些临床结果和我们的实验结果表明针对TLR4 / NFκB途径可以提供进一步的睡眠呼吸暂停患者的治疗选项。
利益冲突
作者宣称没有利益冲突有关的出版。
承认
作者感谢莱提纱Guedin育种和TLR4基因分型−−/老鼠。莫里斯Dematteis和克莱尔Arnaud是文章的第二作者。