文摘

背景。高密度脂蛋白(HDL)的功能异常可能导致慢性肾脏疾病患者的心血管疾病。我们测量一个验证标记的HDL功能障碍,硝化载脂蛋白-ⅰ,肾移植受者测试的假设功能肾移植减少血清硝化apoA-I浓度。方法。硝化apoA-I和飞机观测的浓度测量使用间接的夹心ELISA检测血清收集从每个移植前和移植,移植后3和12个月。患者排除是否有糖尿病史,降脂药物或治疗HIV蛋白酶抑制剂,强的松的剂量> 15毫克/天,肾病蛋白尿,血清肌酐> 1.5 mg / dL,或积极的炎性疾病。从18移植患者血清进行了分析。四个受试者排除由于数据不足。十二和八个患者肌酐< 1.5 mg / dL在移植后3个月和12个月,分别。结果。硝化apoA-I明显降低移植后12个月()。减少apoA-I硝化与显著减少髓过氧化物酶(MPO)活动()。apoA-I相比,硝化飞机观测肾移植后没有影响。结论。运转良好的移植患者有显著减少硝化apoA-I肾移植后12个月。还需要进一步的研究在一个大群体来确定硝化apoA-I可以用作心血管危险分层有价值的标记在慢性肾脏疾病。

1。背景

心血管疾病(CVD)是患者死亡的主要原因在终末期肾病(ESRD),占所有死亡的大约一半(1- - - - - -4]。透析治疗的主要课程。透析病人死在6到7倍的个体在普通人群中与其他类似的危险因素。不太严重的患者的慢性肾脏疾病(CKD)阶段还携带多余的心血管死亡率的风险,不是用传统的风险因素来解释(5,6]。使用他汀类药物降低低密度脂蛋白胆固醇降低动脉粥样硬化的风险事件nondialysis CKD患者(7,8]。然而,没有发现类似的保护,他汀类药物在临床试验中涉及病人在透析9,10]。

高密度脂蛋白的数量和质量可能可以解释一些晚期CKD患者的残余风险。流行病学研究表明,有一个在心血管疾病的风险逐渐增加高密度脂蛋白胆固醇降低(11,12]。然而,最近的药物干预旨在增加高密度脂蛋白丰富未能提供相关的临床益处和意想不到的副作用,尽管有前景的临床结果(13,14]。

目前的最近的研究聚焦于评估HDL功能而不是测量其传统的血浆浓度(15- - - - - -17]。在这方面,已经试图衡量硝化apoA-I。这些研究先进概念,高密度脂蛋白的氧化改性MPO呈现高密度脂蛋白功能失调(18- - - - - -20.]。海拔在硝化apoA-I包含高密度脂蛋白在动脉粥样硬化斑块和已报告在等离子体CVD患者6,21- - - - - -23]。

定性和定量描述了高密度脂蛋白的变化在CKD患者24]。具体来说,高密度脂蛋白富足是降低,高密度脂蛋白获得促炎的财产,而不是其抗炎作用[25,26]。此外,从CKD患者高密度脂蛋白减少了反向胆固醇运输能力(27]。在最近的研究中,慢性肾病已被证明改变特定的HDL功能与控制炎症和内皮反应(28]。低HDL水平与早些时候进入透析或血浆肌酐水平翻倍独立存在的糖尿病(29日]。免疫组织化学染色显示更高的硝基酪氨酸与媒体动脉钙化CKD患者(30.]。此外,慢性肾病患者的血浆蛋白显示较高的硝化负担比健康对照组(31日]。尽管有这些重要报告等离子nitroproteome硝化脂蛋白的含义在CKD患者疾病进展还没有探索。

apoA1-HDL的硝化程度评估的几种方法,如质谱分析和免疫印迹分析在不同疾病设置(23,32,33]。然而,所有这些技术都是耗时的,还不能很好地适应高吞吐量的屏幕设置。我们开发了一个基于ELISA方法量化血清硝化apoA-I。我们表明,心血管疾病主题总低HDL但硝化apoA-I含量高(34]。使用相同的ELISA,巴斯克斯等人表现出显著降低胆固醇流出ABCA1转运蛋白和血管内皮功能受损增加硝化apoA-I-HDL的肥胖女性(35]。CKD患者心血管风险增加和减少了HDL水平和改变高密度脂蛋白成分(36]。我们因此调查是否循环硝化脂蛋白水平变化CKD患者肾移植。

2。对象和方法

2.1。病人临床变量选择和评估

七十八对象是从纽约州立大学州南部医学中心的门诊2010年11月和2013年6月之间。该研究机构审查委员会批准的协议编号441318 - 1。书面知情同意了所有的研究参与者。参与者都是成年人。肾移植受者是参加研究,除非他们符合排除标准。下面的标准被排除在研究患者:糖尿病、艾滋病抗逆转录病毒疗法,活跃的系统性疾病疾病,肾病综合症,蛋白质:肌酐比率> 1,降脂药物治疗,身体质量指数(BMI) > 35岁,肌酐> 1.5 mg / dL或估计肾小球滤过(eGFR) < 60毫升/分钟的修改对肾脏疾病的饮食(MDRD)方程,类固醇剂量> 15毫克强的松或等效移植后一个月或更多,和西罗莫司治疗或everolimus。以上这些选择标准将消除最重要的混杂因素的干扰脂质和脂蛋白代谢。12的样本量估计提供448功率检测的差异的90%μg / dL与移植前12个月的硝化apoA-I集中在双尾第一类误差具有重要的意义α0.05使用Wilcoxon符号秩检验(34,35]。

血清收集从每个移植前和移植,移植后3和12个月。总共18移植患者的血清资格,提出稳定肾功能进行回顾性分析。4名患者由于不完整的时间点数据被排除在外。最后,在这一组中,十二和八个患者肌酐< 1.5 mg / dL在移植后3个月和12个月,分别。

2.2。样品制备和量化ELISA的硝化脂蛋白

整除血清储存在−70°C解冻,硝化apoA1-containing高密度脂蛋白的浓度测量使用的夹心ELISA方法(34]。类似的夹心ELISA了硝化apoB-containing LDL粒子的测量水平。ELISA检测的特异性是前面描述的34]。intra-assay和interassay系数变化对硝化脂蛋白和载脂蛋白测量分别小于5%和10%,分别。这些值符合典型的夹心ELISA检测的精度34,37,38]。简单地说,在96 -孔板稀释血清样本孵化之前涂上单克隆抗体anti-nitrotyrosine(美国EMD微孔,Billerica的;克隆1 a6,猫。# 05 - 233),使硝化血清总蛋白质的捕获包括apoA-I和飞机观测。盘子被封锁在PBS缓冲含有3%牛血清白蛋白(BSA)和洗PBS-Tween (0.05%)。主要多克隆抗体对人类apoA-I或飞机观测(罗福斯生物制剂,利特尔顿有限公司美国;猫。# nb400 - 147和猫。# nb120 - 7616、职责)被添加到具体绑定硝化apoA-I或硝化飞机观测被anti-nitrotyrosine抗体。使用增加浓度标准曲线生成(1 - 100 ng / mL, 1 - 100μg / mL)的提纯人血清高密度脂蛋白和低密度脂蛋白,分别(MyBioSource、圣地亚哥、钙、美国;猫。# MBS173145和猫。# 173147)。为此,单克隆抗体apoA-I和飞机观测固定在96孔板(4 h1和1 d1,分别地。渥太华大学研究所,加拿大渥太华)。绑定HDL (apoA-I-HDL)和低密度脂蛋白(apoB-LDL)对硝基苯磷酸与碱性phosphatase-conjugated二级抗体检测(pNPP)作为衬底(1毫克/毫升)。

吸光度在405纳米测量和校正吸光度控制井PBS-Tween添加代替血清。血清总apoA-I和飞机观测水平测定如前所述[34,35]。绝对值的硝化载脂蛋白(apoA-I和飞机观测)归一化总血清载脂蛋白和硝化程度是用百分比表示。

2.3。脂质分析和酶化验

Non-HDL分数被沉淀分离血清(低密度脂蛋白(VLDL)二氯化锰溶液(1.06米)。离心后,上层清液中总胆固醇(为)和PBS-reconstituted沉淀(non-HDLc)是由比色测定测量(Wako诊断,里士满,弗吉尼亚州,美国;猫。# 439 - 17501)。脂质过氧化作用/氧化应激评估通过测量硫代巴比土酸活性物质(TBARS)的血清。简单地说,低密度脂蛋白(VLDL分数被1.06氯化锰沉淀和TBARS水平测定使用OXI-TEK TBARS化验设备(ZeptoMetrix Corp .,布法罗,纽约,美国;猫。# 0801192)。MPO由比色测量活动分析工具包(σ,圣路易斯,密苏里州,美国;猫。# MAK068).

2.4。统计分析

只有结果对于那些肌酐< 1.5(那些成功的移植)。数据为连续变量(意味着±SD)和中位数(四分位范围)报道。所有分析使用棱镜GraphPad 5.0和10.0 Statistica软件。配对的硝化apoA-I百分比值或硝化飞机观测移植比较之前和之后使用非参数Wilcoxon符号秩和检验。此外,线性回归和皮尔森相关系数是用来评估变量之间的关联。被认为是具有统计学意义。

3所示。结果

3.1。量化ELISA的硝化高密度脂蛋白和低密度脂蛋白

图1(一)说明了动态曲线的固定化nitrotyrosine-bound脂蛋白检测井的多克隆抗体apoA-I和飞机观测。克分子数相等的浓度,氮化低密度脂蛋白结合达到饱和比硝化HDL更快,和分析实现线性0到100之间μg / mL LDL添加和0和100 ng / mL高密度脂蛋白之间添加(前2面板图1(一))。心血管疾病患者的血清显示增加的二硝化脂蛋白水平与健康受试者相比。有大约6倍增加硝化高密度脂蛋白分子相比,低密度脂蛋白(图1 (b))。

3.2。研究对象的临床特征

病人满足合格标准如上所述进行了分析研究。18中移植的患者都有资格,提出稳定肾功能4名患者被排除在外由于不完整的数据和十二和八个患者肌酐< 1.5 mg / dL在移植后3个月和12个月,分别。

该队列研究受试者的年龄从29到64年不等。临床特点是总结表1。在基线,意思是高密度脂蛋白胆固醇和平均non-HDL胆固醇mg / dL (22.4 - -85.3)mg / dL(分别为71.7 - -147.3)。甘油三酯水平的平均值mg / dL, apoA-I和飞机观测水平mg / dL和分别mg / dL。肌酐(Cr)水平介于4.6 mg / dL 13.2 mg / dL和c反应蛋白(CRP)水平低于4 mg / L。有降低血清肌酐和有轻微增加BMI和血红蛋白水平移植后12个月相比在基线值。

3.3。时态变化,血清组件和硝化脂蛋白的地位总CKD组

总体而言,血清组件(如总apoA-I和飞机观测移植后不随时间变化(数据2(一个)和2 (b))。分析所有患者14好移植肾功能没有任何明显的变化在硝化脂蛋白1个月,3个月,移植后12个月(数字2 (c)- - - - - -2 (f))。

3.4。硝化高密度脂蛋白和低密度脂蛋白的变化在肾移植受者肌酐< 1.5 mg / dL

在研究结束时,我们有十二个患者和8例患者具有良好的移植肾功能(肌酐< 1.5 mg / dL)在移植后3个月和12个月,分别。对于每一个主题,我们比较配对的硝化apoA-I百分比和飞机观测值在肾移植,肾移植后3个月和12个月。分析的12个患者肌酐< 1.5 mg / dL在移植后3个月硝化apoA-I(图中没有显示出差异3(一个))。在移植后12个月,apoA-I-HDL水平略有增加但没有达到意义(平均值mg / dL和mg / dL基线和移植后12个月,分别地)。这种温和的血清apoA-I水平与显著减少(~ 12%)在硝化apoA-I(图3 (b))。有趣的是,六名病人中八个减少了10% ~ -30%的硝化apoA-I移植后12个月。百分比的平均值显著降低了硝化apoA-I 18.5纳克/毫克apoA-I(中值降低22.5纳克/毫克apoA-I;)移植后12个月。相比之下,没有明显的变化硝化飞机观测在移植后3个月和12个月(数字3 (c)和3 (d))。像apoA-I,血清飞机观测水平倾向于略有增加但没有达到任何意义(平均值mg / dL和mg / dL基线和移植后12个月)。

3.5。MPO活性和脂质过氧化作用

减少apoA-I硝化移植后12个月内与MPO活性水平显著降低(表1;值中位数:68.3和107.1μμ/毫升/毫升;下降32%;)。脂质过氧化作用以TBARS化验持平于移植后3个月和12个月。

3.6。高密度脂蛋白和低密度脂蛋白水平之间的相关性和硝化apoA-I百分比和硝化飞机观测

在我们之前的研究中,我们报告之间的负相关关系程度的apoA-I-HDL和循环患者高密度脂蛋白颗粒在低HDL水平(34]。在这项研究中,我们试图确定模式潜在的硝化载脂蛋白和循环脂蛋白之间的关系在肾移植患者在基线和移植后3个月和12个月(图4)。之间没有显著相关性硝化apoA-I百分比和血清apoA-I水平在慢性肾病患者肾移植(图4(一)),3个月(图4 (b)(图)和12个月4 (c)肾移植后)。相比之下,有一个重大的负面硝化飞机观测百分比之间的关系和血清飞机观测水平基线(图4 (d))。这种逆相关保持3个月后(图4 (e)),成为显著显著的肾移植后12个月(图4 (f))。没有明显关联硝化apoA-I或硝化飞机观测与其他已知的炎症和心血管标志物如hs-CRP、MPO、Cr。(数据没有显示)。

4所示。讨论

CVD在CKD主要是由氧化应激,血管钙化,高血压、炎症和氧化脂蛋白以及高密度脂蛋白缺乏积累和功能障碍39,40]。最近的研究表明,高密度脂蛋白功能受损的心脏移植受者但它不是心脏代书相关血管病变和CRP水平(41]。到目前为止,没有足够的信息在肾移植受者HDL功能。在本报告中,我们首次证明,血清硝化apoA-I减少12个月后肾移植受者具有良好的肾脏功能。

我们检查了硝化与血清脂蛋白水平的关联apoA-I和飞机观测的肾移植受者。我们没有发现显著的硝化apoA-I和循环apoA-I水平之间的关系在基线和移植后3个月和12个月(数字4(一)- - - - - -4 (c))。这不是同意我们之前观察心血管疾病患者较低的高密度脂蛋白(34]。这可能是由于可能的脂蛋白和/或差异程度的硝化和病人的人口从CKD和心血管疾病。令人惊讶的是,硝化飞机观测百分比之间有显著负相关,血清水平的飞机观测基线和移植后3个月和12个月(数字4 (d)- - - - - -4 (f))。血清是富含飞机观测越小飞机观测硝化的程度。一个合理的解释这个意想不到的观察与间隙的差异不同形式的修改apoB-LDL粒子。我们推测,硝化apoB-LDL分子会比未改性低密度脂蛋白清除更快的循环导致的硝化飞机观测量低。事实上,先前的研究表明,apoB-containing脂蛋白结果的积累主要来自间隙减少而不是增加合成(42]。低密度脂蛋白硝化已被证明是与增强巨噬细胞吸收相比,氧化低密度脂蛋白孤立和风湿性关节炎患者心血管疾病(43]。更多的研究是必要的,以进一步阐明氮化低密度脂蛋白颗粒的间隙在CKD患者巨噬细胞。

MPO的主要酶参与氯化、硝化脂蛋白。等离子体MPO水平与冠状动脉疾病(有关44]。Cavusoglu等人表明,较高的基线MPO水平在2年内独立预测心肌违规的发生在急性冠脉综合症患者45]。发现了高水平的硝化高密度脂蛋白在动脉粥样硬化病变和等离子体CVD患者。相比之下,大多数的氮化低密度脂蛋白主要驻留在动脉粥样硬化斑块(21,46- - - - - -48]。使用的药物如他汀类药物,β-阻断剂或血管紧张素转换酶抑制剂已被证明会降低MPO水平在急性冠脉综合症患者而不是稳定的冠状动脉疾病患者(49]。

有趣的是,减少apoA-I硝化移植后12个月内与MPO活性显著降低(表1)。从我们的研究目前尚不清楚是否减少硝化载脂蛋白-ⅰ在12个月内会导致降低MPO活性。可能成功的肾移植后血清MPO的浓度减少是由于衰减的氧化剂和炎症状态引起的尿毒症。事实上,最近的研究表明,MPO缺乏改善肾损伤小鼠慢性肾病的肾消融模型(50]。另一项研究报告MPO和尿素和肌酐水平之间的负相关(51]。

CKD的进化和严重性已被证明与升高有关氧化应激(52]。分析apoB-associated TBARS含量低密度脂蛋白(VLDL粒子没有透露任何显著差异在移植后3个月和12个月相比基线(表1)。这是完全不同于Vostalova等人的研究显示有益影响成功的肾移植的抗氧化状态和脂质代谢导致肾功能改善和减少心血管并发症(53]。一个合理的解释这种差异可能与脂质状态的差异,病人的选择,和协议设计两者之间的研究。此外,脂质过氧化产物的变化在CKD人口仍在争论54- - - - - -56]。

在这项研究中,大部分的主题有高水平的血清飞机观测(> 100毫克/分升;正常范围≤60 mg / dL)可能由于缺乏这些患者降脂治疗和可能的免疫抑制药物的效果。与apoA-I,好肾功能并不影响程度的飞机观测硝化在移植后3个月和12个月(数字3 (c)和3 (d))。这些差异可能与低水平的血清比硝化apoA-I硝化飞机观测。另外,结构和分子脂蛋白之间的差异可能发生在慢性肾病的进展,呈现改性低密度脂蛋白分子特别是(氧化、糖化和carbamylation)不容易被MPO硝化。分析总人口(所有14个病人)具有良好的移植肾功能没有任何明显的时态变化硝化脂蛋白1个月,3个月,移植后12个月(图2)。这可能是由于患者重要的个人间的变异小。然而,适度的海拔血清apoA-I水平与显著减少肾移植受者的硝化apoA-I只有12个月后(图3 (b))。这是符合最新研究报告,血脂水平的变化是早期发生的普遍在肾移植后12个月57]。

我们的研究的一个主要限制条件是小样本大小由于严格的病人的排除标准设置。然而,没有一个病人接受降脂治疗,可能影响研究结果。另一个限制是缺乏合适的正常对照组(捐赠者)这个特定的协议。需要确认这些发现在大型前瞻性研究以验证的有效性硝化apoA-I作为独立的CKD患者的心血管疾病风险的预测标志。更有针对性的研究才能阐明是否修改HDL在先进CKD参与动脉粥样硬化的非常相似的细胞过程,如泡沫细胞形成,平滑肌细胞的增殖和迁移,而且,最重要的是,斑块不稳定。

5。结论

总之,我们已经表明,运转良好的肾移植患者有显著减少硝化apoA-I-HDL肾移植后12个月内在硝化apoB-LDL没有任何重大变化。鉴于高心血管负担的肾移植受者,硝化apoA-I可能作为人口分层和有价值的标志作为小说的可能目标的治疗策略。

缩写

ABCA1:	腺苷结合盒转运体A1
ApoA-I:	载脂蛋白-ⅰ
飞机观测:	载脂蛋白B
包子:	血尿素氮
CKD:	慢性肾脏疾病
Cr。	肌酸酐
c反应蛋白:	c反应蛋白
心血管疾病:	心血管疾病
表皮生长因子受体:	估计肾小球滤过
ELISA:	酶联免疫吸附测定
迹象:	终末期肾脏疾病
高密度脂蛋白:	高密度脂蛋白
低密度脂蛋白:	低密度脂蛋白
MDA:	丙二醛
MDRD:	修改在肾脏疾病的饮食
MPO:	髓过氧物酶
VLDL:	极低密度脂蛋白
TBARS:	硫代巴比土酸活性物质。

免责声明

所有作者同意负责这项工作的所有方面。每个作者都有充分参与这项工作,公共责任适当的部分内容。

利益冲突

作者宣称没有利益冲突有关的出版。

作者的贡献

艾哈迈德Bakillah执行实验,参与数据的采集和解释的结果,和修改后的文章中写道,期末报告的批准。Fasika Tedla负责这项研究的概念和设计和修改论文和期末论文已经批准。伊莎贝尔Ayoub负责研究设计和样品收集和期末报告的批准。德文郡约翰和艾伦·j·诺修改论文,期末报告的批准。m·马哈茂德侯赛因负责数据的解释和报纸编辑在一个重要的时尚和已批准最终的论文。克林顿布朗负责这项研究的概念和设计和修改论文和期末论文已经批准。所有作者阅读和批准了期末论文。

确认

这项研究得到了纽约州立大学/射频科研合作基金资助项目(克林顿布朗)和美国国立卫生研究院拨款RO1HL095924 (m . Mahmood Hussain)。艾哈迈德Bakillah接受者的NIH多样性补充奖(HL095924-03S1)。作者要感谢所有病人和医护人员在纽约州立大学州南部医学中心的诊所。