文摘

Prokineticin 2 (PK2)是一种新型chemokine-like肽具有多种促炎和nociception-related活动。本研究旨在探讨PK2的潜在作用调节膀胱活动和感觉与环磷酰胺——(CYP)诱导大鼠膀胱炎。PK2和prokineticin受体的变化(pkr)在正常和尿膀胱发炎测定在几个时间点(4 h, 48 h, 8 d)后CYP治疗。结合非选择性拮抗剂prokineticin受体(PKRA),我们进一步评估PK2的监管作用在调节膀胱功能和通过有意识的cystometry内脏疼痛感和疼痛行为得分。PK2 prokineticin受体1 (PKR1),但不是prokineticin受体2,发现在正常和异常血糖调节CYP-treated鼠膀胱在几个水平。免疫组织化学染色本地化PKR1主要尿道上皮。阻塞pkr PKRA显示没有影响排尿反射活动和膀胱感觉控制老鼠虽然空洞体积增加,长期的排尿间隔,改善内脏痛觉过敏在老鼠遭受CYP-induced膀胱炎。总之,PK2 / PKR1调制的信号通路导致inflammation-mediated排尿功能障碍和自发的内脏疼痛。当地的封锁pkr可能代表一个新颖的和有前途的治疗膀胱炎症性疾病的临床管理的策略。

1。介绍

间质性膀胱炎/膀胱疼痛综合征(IC / PBS)是一种慢性膀胱的病理条件特点是骨盆疼痛等症状,或排尿频率,紧迫性和耻骨弓上的不适1]。IC / PBS必然会影响正常的生理和心理健康,带来了显著的负面影响病人的生活质量(1]。IC / PBS的人经常感觉不舒服在正常膀胱的压力,建议异常兴奋性的排尿反射通路(2,3]。

病因,几个假设,包括上皮功能障碍,潜伏性感染,神经源性炎症和自身免疫现象,提出了;然而,IC / PBS的确切发病机制基本上仍不清楚(1- - - - - -3]。最近,生物活性分子的监管作用与炎症和疼痛感出现的IC / PBS已经受到了越来越多的研究关注3- - - - - -6]。组织学调查展示了某种程度的炎症入侵在大多数从IC / PBS患者膀胱活组织检查3,7]。这些研究强烈支持的想法inflammation-relevant因素与膀胱功能障碍和内脏过敏在IC / PBS。

Prokineticin 1和Prokineticin 2 (PK1和PK2)的哺乳动物直接同源Bv8(两栖动物肽b . variegata8)和曼巴肠毒素1 (MIT1),从皮肤分泌物中分离Bombina variegata和树眼镜蛇毒液,分别8]。PK1和PK2代表小说chemokine-like家庭特点是守恒的n端序列“AVITGA”和10个半胱氨酸残基组成的一种独特的主题9,10]。两个G-protein-coupled受体,prokineticin受体1 (PKR1)和prokineticin受体2 (PKR2),负责交付信号由PK1和PK2效应细胞(11]。

在过去的十年里,这些肽的生物活性已被广泛研究的主题,暗示PK2,但不是PK1,参与炎症和伤害感受的生理或病理过程(8]。观测证实了早些时候PK2在多个激活免疫细胞的过度表达,发炎组织和器官显示多个促炎的活动通过PKR1 [12- - - - - -15]。例如,Martucci等人的调查表明,PK2刺激巨噬细胞分泌炎性细胞因子,同时减少抗炎细胞因子的生产(15]。此外,关键作用的痛觉过敏和痛觉过敏炎症性PK2 / PKR1交互也已确定,瞬时受体电位的草酸受体1 (TRPV1)作为下游响应要素(16- - - - - -18]。

到目前为止,许多生物活性物质被证明调节膀胱功能和排尿反射。早期的观察与细胞因子、神经肽和生长因子在炎症性膀胱功能障碍的规定(2- - - - - -5]。尽管先前的调查揭示了PK2成绩单在膀胱组织的存在9)的生理作用和表达谱PK2同源受体在膀胱仍然未知。考虑到促炎的活动和伤害感受PK2的便利化属性,我们试图阐明PK2和prokineticin受体的表达(pkr)在膀胱CYP-induced在大鼠膀胱炎。此外,通过结合非选择性PKR拮抗剂,我们探索的潜在作用PK2调制排泄功能通过有意识的cystometry (CCM)和内脏疼痛评分。

2。材料和方法

2.1。动物

女性Sprague-Dawley老鼠(220 - 270 g)购买实验动物中心,华中科技大学,武汉,中国。老鼠被安置与免费获取食物和水在标准实验室条件下。机构同济医科大学动物保健和使用委员会批准所有的实验和动物使用。实验过程都是按照美国国立卫生研究院的执行指导实验室动物保健和使用的。

2.2。感应的膀胱炎

腹腔内(i.p)注入CYP (Sigma-Aldrich)应用于建立膀胱炎动物模型。控制老鼠注射了生理盐水。单剂CYP(150毫克/公斤i.p。)执行注射诱导急性膀胱炎(4 h或48小时时间),和一个低剂量CYP(75毫克/公斤)每3天注射ip模仿慢性膀胱炎,直到第八天。用于CCM的老鼠研究收到CYP(150毫克/公斤i.p)。治疗48 h。

2.3。部分准备和免疫组织化学(包含IHC)

deparaffinization和补液后,5μ米横截面被加热沸腾的乙二胺四乙酸缓冲(0.01 m, pH值8.0)在高压下2分钟检索抗原。封锁与脱脂牛奶后,部分被孵化PKR1抗体溶液(1:800年,BS2957 Bioworld技术)在一夜之间在4°C。diaminobenzidine衬底工具包(GK500705,基因技术)是用于检测目标蛋白。部分没有孵化在初选中初级抗体和抗体preabsorbed PKR1肽(5μg / mL)处理评估抗体特异性。

2.4。RNA制备和实时rt - pcr

组织信使rna提取试剂盒试剂(15596 - 026,英杰公司)。对于每一个样品,3μg反转录成RNA的cDNA。实时rt - pcr进行一个20μL反应系统与以下热概要:初始变性在95°C 2分钟紧随其后40周期在95°C的变性15年代和30年代在58°C扩展。所有放大过程进行了一式三份,以确保结果的可靠性。融化曲线分析和电泳进行以确保引物的特异性。引物序列从先前的研究如表所示1(14,16,17]。β肌动蛋白作为内部控制,的相对表达水平PK2和PKR1信使rna在CYP-treated样本计算使用方法。

2.5。酶联免疫吸附试验(ELISA)

冷冻膀胱样本均质(1:2、重量/体积)0.01米磷酸盐(pH值7.4)解决方案补充10μL /毫升蛋白酶抑制剂鸡尾酒(P8340σ)冰。溶菌产物离心两次在10000 g×30分钟在4°C。总蛋白浓度与蛋白质量化分析工具(23227年,热费希尔科学)。PK2量化使用老鼠PK2-specific酶联免疫试剂盒(E-EL-R0780c Elabscience)按照制造商的指示。PK2从线性标准曲线计算每个样本的数量和总蛋白转化为内容。上层清液不稀释,没有样品低于检出限的工具包。

2.6。内脏疼痛评估的行为

特殊护理被研究者在疼痛行为观察,保持沉默,老鼠可以适应气氛在测试之前根据我们之前的经验(19]。老鼠接受CCM前内脏疼痛行为评价2 h。我们用修改过的疼痛量化疼痛的行为行为得分范围如下:正常= 0,立毛= 1,呼吸困难= 2,上睑下垂= 3,舔的腹部= 4,和柔软的身体/圆= 5。每个行为持续在1分钟内被记录和总结整体疼痛评分(最大得分= 15)。PKRA后膀胱内的滴剂(1μ米,周的实验室)或车辆(二甲亚砜1% DMSO,生理盐水),相同的老鼠在CCM后评估。PKRA是一种小分子PKR拮抗剂在周的实验室合成20.,21]。在目前的研究中,PKRA是加剧与之前报道的一些修改20.,22]。PKRA收益率集成电路₅₀值约12海里PKR1 PKR2和18海里,以Ca^{2 +}在CHO细胞发光测定。此外,PKRA自由是不溶于水,溶于DMSO溶液。

2.7。CMM

膀胱内的导管植入24老鼠执行如前所述[23]。CCM,老鼠维护在一个塑料背访问抑制剂,这是放置在多层过滤文件收集排泄的液体。preimplanted导管被连接到一个丁字路口的膀胱压力通道尿动态系统(uds - 600, Laborie医疗技术)。左端口连接与一个注射器泵始终灌输与盐水膀胱引起排尿。在导管植入术后的第八天,老鼠接受CCM建立基础数据。随后,其中一半受到CYP治疗(150毫克/公斤i.p),其余大鼠作为控制。确定的潜在作用PK2调制膀胱活动在生理和病理条件下,CMM中再次执行控制大鼠()15分钟后膀胱内的灌注与约200μL汽车()或PKRA (1μ米)的解决方案(),而CYP-treated老鼠(之前和之后)接受CCM膀胱内的灌溉工具()或PKRA (1μ米)的解决方案(30分钟)。至少六个排尿周期为每个老鼠都被记录下来。滴注法率对CCM被设定为10毫升/小时。排尿开始后,我们立即记录时间点计算排尿间隔(VI)。过滤器文件是使用电子天平称重。排泄液体的重量是转换成空洞体积(VV)规模的1 g = 1毫升。在当前的研究中使用的浓度PRKA经验决定根据试点研究。在这些试点研究,我们估计几个浓度(200 nM, 1μ5米,μ米)。PRKA 200海里的浓度显示没有影响,而最高浓度(5μ米)表现出与1类似的效果μm .因此,1μ本研究M PKRA被选中。

2.8。统计数据

数据表示为均值±SE的所有值。统计学意义发现组间方差分析或重复测量方差分析(CCM数据),其次是Bonferroni事后测试。意义被认为是在。

3所示。结果

3.1。实时rt - pcr

CYP治疗显著升高PK2所有膀胱发炎的mRNA水平(图1(一))。相比与控制(),PK24 h老鼠(mRNA水平,),48小时大鼠(,)和8 d大鼠(,)增加6.15、2.97和1.53倍,分别后CYP注入。相比与控制(),PKR1信使rna水平显著增加4.02倍()和2.07倍()在膀胱48 h ()和8 d (分别)CYP-induced膀胱炎,但不是在膀胱4 h膀胱炎()(图1 (b))。然而,PKR2信使rna并非在所有样本中检测到。

3.2。包含IHC

PKR1主要表达于膀胱上皮和固有层中分散分布的所有老鼠(数字2(一个)- - - - - -2 (d))。CYP治疗显著调节PKR1表达式4 h的膀胱,膀胱上皮的48小时,8 d膀胱炎(数字2 (b),2 (c),2 (d))。逼尿肌平滑肌表现出没有PKR1免疫反应性膀胱。增加单核细胞的渗透也观察到膀胱发炎。preabsorbed初级孵化与阻断肽的抗体减少PKR1免疫反应性(图控制水平2 (e))。当主抗体缺席,没有积极的免疫染色观察(数据没有显示)。

3.3。ELISA

(pg / PK2蛋白水平μg总蛋白)在膀胱48 h膀胱炎(奇遇记》)立志于成为最健壮()和显著增加(),而与控制()。总结,如图3,PK2也显著增加和在膀胱发炎4 h (,)和8 d (,分别)CYP-induced膀胱炎。

3.4。PKRA对自发的影响内脏疼痛

CYP治疗显著()增加了自发的内脏疼痛行为在所有大鼠(),48 h膀胱炎,表明增加从内脏疼痛评分的平均值(CYP)前为8.50±1.15 (CYP)后(图4)。膀胱内的灌注PKRA (1μ米)显著()减少内脏疼痛感和逆转疼痛行为得分在同一大鼠(,图4)。然而,观察疼痛的行为无显著变化的控制大鼠(),收到车辆灌注(数据未显示)。

3.5。PKRA对膀胱功能的影响

3.5.1。控制老鼠(CYP治疗)

调查是否PKRA生理调节膀胱功能的膀胱内的应用,我们在控制老鼠之前和之后执行CCM车辆()或PKRA治疗()(数据5(一个)和5 (b))。药品监督管理局PKRA (1μ米)施加任何影响尿动态参数,包括VV, VI,和最大膀胱压力(MBP)在大鼠膀胱炎(数字5 (c),5 (d),5 (e))。也观察到类似的结果的老鼠收到车辆灌溉(数据未显示)。

3.5.2。膀胱炎大鼠(48小时)

CCM进行全部12个老鼠CYP之前注射建立基线数据(图6(一))。CYP治疗生成不稳定的压力-容积曲线(图6 (b))和显著()减少和VI毫升,年代毫升,年代,分别为(数字6 (d)和6 (e))。后续应用PKRA (1μ米)稳定了膀胱(图6 (c))在六大鼠和显著()恢复和VI毫升,年代,分别为(数字6 (d)和6 (e))。此外,没有观察到显著改变MBP这些老鼠在所有时间点(图6 (f))。然而,灌溉的膀胱泡未能稳定膀胱发炎(数据未显示)。

4所示。讨论

在目前的研究中,我们首次展示的表达PK2和PKR1的位置以及PKR1膀胱的老鼠有或没有膀胱炎(数字1- - - - - -3)。CYP治疗反应,表达的PK2和PKR1膀胱发炎显著增加在基因和蛋白质水平(数字1- - - - - -3)。膀胱炎的上下文中,抑制与PKRA pkr不仅缓解炎症相关的内脏疼痛(图4),而且显著改善膀胱功能障碍(图6)。然而,局部管理PKRA膀胱水平施加不影响正常排尿控制老鼠,指示的不作为PK2 / PKR1信号通路在生理条件下膀胱(图5)。总的来说,我们的研究提供了新的见解超敏反应的发生机制和膀胱逼尿肌过度活跃在炎症反应紊乱。此外,PK2 / PKR1信号可能代表一种新颖的目标治疗膀胱的炎症性疾病。

在哺乳动物中,PK2存在于各种器官,构成多样的生物活性(20.,24]。最近,一些研究报道关于PK2的表达和pkr在各种上皮组织(25,26]。我们还发现膀胱上皮的基底表达PKR1控制;然而,堵塞的pkr PKRA展出不影响排尿反射的活动在这些老鼠。这个结果表明PKR1-mediated信号并不导致膀胱功能的调制和感觉在正常情况下。缺乏的影响可能归因于相对较低浓度的PK2尿道上皮在正常情况下,表明PK2不是足够高的水平激活同源受体,因此生物信号传输。进一步的研究关注的分布在膀胱可以帮助阐明PK2 PK2的监管作用在生理条件下排尿反射。

腹腔注射后,CYP代谢丙烯醛,直接接触尿道上皮和导致严重的膀胱炎伴有炎症细胞浸润(19]。几个发表调查展示了PK2在各种白细胞的存在,以及过度的炎症网站(12- - - - - -15,27]。因此,渗透并激活免疫细胞可能会猜测,至少在一定程度上有助于增加PK2 CYP后的膀胱治疗。此外,膀胱尿道上皮本身或其他组件可能产生和分泌PK2刺激时,丙烯醛等有害物质。在体外,PK2促进迁移、生存和分化的单核细胞;它还可以促进生产促炎细胞因子il - 1和il - 12同时减少释放PKR1-dependent方式抗炎趋化因子单核细胞(12,13,15]。在活的有机体内、系统管理Bv8显著增加外周白细胞计数和il - 1β小鼠的脾细胞水平(12,28]。这些发现表明,PK2 / PKR1信号促进,至少在某种程度上,在膀胱炎症的发生和进展CYP管理。

膀胱上皮的表达PKR1是调节CYP治疗后,根据我们的包含IHC数据显示,炎症刺激(图2)。类似的结果在其他组织的研究报告,包括上皮细胞在生理或病理条件下(25,29日- - - - - -31日]。CYP政府可以导致免疫细胞渗透进入膀胱壁,这表明移民并激活免疫细胞可能导致的过度PKR1在膀胱炎PKR1表达在这些细胞。然而,详细的机制需要进一步阐明。然而,PKR1表达式的增加后的膀胱上皮CYP政府增强PK2 / PKR1信号的调节影响膀胱功能和感觉在膀胱炎。

的角色PK2 / PKR1信号通路在调节炎症反应,包括inflammation-mediated内脏疼痛,已经被广泛的研究13,16- - - - - -18,32]。精确的机制可能不是完全清楚,但一些研究支持了这样的观点,即局部升高PK2减少了疼痛的感觉阈值通过刺激释放促炎细胞因子激活免疫细胞,除了表达下调抗炎因子的生产(15,28,33]。PK2也可能调节疼痛知觉通过直接激活pkr在疼痛的感觉神经元涉及功能与托管的TRPV1的交互,各种有害刺激的关键效应(13,16- - - - - -18,34]。此外,在泌尿道上皮细胞表面TRPV1的表达,以及其重要的作用在膀胱炎膀胱感觉和监管,先前已经被证明(35]。在当前的研究中,高架PK2可能直接模拟神经丛系统底层尿道上皮和增加了通过传入肢体感官信号输入,造成内脏痛觉过敏和膀胱过度活跃。PK2也可能扩散到膀胱腔和激活PKR1移行细胞的细胞,从而调节膀胱感觉通路。这些猜测都是符合我们发现膀胱内的应用PKRA可以改善大鼠膀胱过度活跃和cystitis-mediated炎症性疼痛行为。

仍需要进一步的研究PKR2也表示在背根神经节神经元。更有选择性抑制剂的开发和具体PKR2零动物模型可以帮助准确定义的信号通路PK2调节膀胱炎症性过敏症和过度活跃。此外,PK2信号的精确机制调节膀胱感觉和功能在炎症条件下仍然是未知的。然而,我们的研究提供了新的见解在膀胱炎膀胱功能的调制和感觉。改进的理解交替在膀胱膀胱炎增加发展中增强的方法治疗的可能性。

5。结论

PK2和PKR1鼠膀胱生理表达,和CYP-induced膀胱炎显著上调他们的表达水平。功能研究表明PK2 / PKR1信号参与调节膀胱过敏症和内脏痛觉过敏在膀胱炎。药物抑制pkr显示一个潜在的临床价值治疗膀胱炎症反应紊乱如IC / PBS。

利益冲突

作者宣称他们没有利益冲突有关的出版。

承认

作者感谢Qunyong周博士提出了受体拮抗剂对他们作为一种礼物。