文摘
内皮细胞形成半透,监管障碍,限制了流体的通道,小分子,白细胞血液中与周围组织之间。adherens结,细胞间粘附的主要机制,由跨膜钙粘着蛋白形成同型的相邻细胞之间的相互作用和关联的细胞质连环蛋白连接钙粘着蛋白细胞骨架。炎症条件促进adherens结的拆卸和细胞间粘连,创建空缺或缺口的内皮小分子扩散和白细胞轮回。酪氨酸激酶信号已经成为中央监管机构的炎症反应,部分通过直接磷酸化和去磷酸化adherens结组件。本文讨论研究结果,支持和反对直接影响钙粘蛋白和连环蛋白磷酸化的拆卸adherens结。最近的发现表明激酶之间的复杂的相互作用,磷酸酶,adherens结组件允许的精细调节内皮渗透性小分子,白细胞游走,再密封和障碍。
1。介绍
细胞间粘附是所有后生动物的一个特点。复杂有机体进化的方法来创建胶粘剂力量强大到足以容纳生物在一起,但与此同时,足够灵活,允许组织重构和生理变化的粘合剂。特别是adherens结(AJ)是一个multiprotein结构出现在大多数生物从昆虫到哺乳动物(1,2];其基本结构包括跨膜钙粘蛋白和胞质连环蛋白连接的钙粘蛋白细胞骨架(3]。经典钙粘着蛋白都是由无数的细胞外的五个层次(EC1-EC5),一个跨膜域,细胞质c端短尾巴。Trans-homodimerization发生相互作用的两种对立的钙粘蛋白(EC1域4]。VE-cadherin(钙粘着蛋白5)被发现在1990年代早期(5,6)和内皮信息接触的是一个主要组成部分。VE-cadherin对内皮至关重要生物学和需要在多个物种从斑马鱼血管成熟(7老鼠(8,9]。类似于其他经典钙粘蛋白、胞质尾VE-cadherin包含绑定地区p120连环蛋白在近膜域(托拉斯)和β连环蛋白或γ连环蛋白c端连环蛋白绑定域(CBD)。结合p120连环蛋白稳定联接的钙粘蛋白通过防止钙粘着蛋白内吞作用(了3,10),而β连环蛋白的同事与α连环蛋白,肌动蛋白细胞骨架的链接(11,12]。
内皮细胞中发挥关键作用的规定vasoreactivity,止血,白细胞招募。血管内皮细胞也维持正常组织功能的关键,就像一个有选择性障碍,调节流体的通道,大分子,白细胞从血管间质空间。促炎通路的激活诱导内皮屏障功能的丧失通过激活内皮细胞的膜受体触发几个信号级联,包括激酶的活化信号、小GTPase-mediated肌动蛋白细胞骨架重塑,和钙释放(了13- - - - - -16])。两条途径调解跨内皮屏障的通道。内皮细胞甚至可能允许运输的蛋白质和细胞通过胞体被称为transcellular通路。在这个途径,液体和蛋白质是主动运输囊泡在一个复杂的系统从腔的基底细胞,水泡的内容发布(13,17]。白细胞也被证明通过单个内皮细胞迁移在体外和在活的有机体内(18,19]。相反,许多促炎介质促进AJ-based的脱离接触,允许通过液体和白细胞通过paracellular通路,即两个内皮细胞之间。通过调节paracellular通路,VE-cadherin-based信息联系人维护所需的强大的细胞间粘附船的屏障功能,同时允许足够的可塑性在需要时。本综述将集中的监管paracellular酪氨酸激酶信号通路,特别强调讨论研究结果,支持和反对直接影响钙粘蛋白和连环蛋白磷酸化的拆卸adherens结。最近的发现表明激酶之间的复杂的相互作用,磷酸酶,adherens结组件允许的精细调节内皮渗透性小分子,白细胞游走,再密封和障碍。
2。细胞间粘附是由钙粘蛋白的磷酸化和连环蛋白
抗体识别phosphotyrosine残留快速的发展使酪氨酸磷酸化研究证明一个关键的角色在细胞间粘附的调制,特别是通过调节AJ-based联系人。马赫等人首先显示信息连接在上皮细胞(PtK2和MDCK)和鸡胚胎成纤维细胞中蛋白质磷酸化酪氨酸(20.]。在接下来的十年中,它变得非常明显,细胞治疗与pervanadate (pan-specific酪氨酸磷酸酶抑制剂)或oncogene-induced转换在细胞培养可以产生一个戏剧性的增加phosphotyrosine内容增加磷酸化细胞连接的VE - N -钙粘蛋白,以及α连环蛋白,β连环蛋白,γ连环蛋白(20.- - - - - -32]。类似的观察是在老鼠中,静脉注射的原钒酸钠增加的交界染色anti-phosphotyrosine抗体在小肠,心脏,肝脏(23]。此外,EGF治疗人类表皮样癌A431细胞诱导β连环蛋白和γ连环蛋白磷酸化(33),表明内生激酶也可以促进连环蛋白磷酸化,以应对增长的因素。同时,雷诺et al。34]描述了120 kDa蛋白质在v - src高度磷酸化酪氨酸转化鸡胚胎细胞,其身份后来发现p120[连环蛋白家族成员35),与钙粘蛋白(36]。Src当时显示能够使磷酸化多个酪氨酸的氨基酸p120 [37]。早期的研究明确表明,酪氨酸磷酸化可以扰乱cadherin-based粘连。短期pervanadate治疗增加phosphotyrosine内容MDBK细胞连接,而长期治疗中断细胞粘附[22]。利用v - src作为模型,结果表明:oncogene-driven overactivation的酪氨酸激酶促进失去细胞间粘附的上皮细胞和成纤维细胞21,24- - - - - -28,30.,38]。
致癌Src突变体比内生激酶(可能有不同的底物特异性39),这可能会导致意想不到的后果在细胞overexpressing v - src。的确,很快明白,并非所有的酪氨酸激酶活动导致的中断,磷酸化酪氨酸粘合连接处并且还可以调解交界稳定(40- - - - - -46]。而造成大规模磷酸化磷酸酶抑制或v - src超表达导致戏剧性的变化在细胞粘附强度,抑制蛋白质酪氨酸激酶(PTK)信号也能导致细胞粘附(图中断1)。在人类乳腺腺癌MCF7细胞,一种微妙的平衡保持正常adherens所需的Src活动连接的完整性,因为要么阻止Src活动(通过显性负Src结构或药物抑制使用PP2)或overactivation Src(通过表达持续活跃的突变Y530F Src)诱导显著交界中断(47]。这些结果表明,Src-mediated信号的影响的监管严格粘合连接处并且取决于活动的水平,而高水平的Src信号干扰细胞间粘连,基础水平低的Src需要正常的细胞粘附。这些发现使作者建议信息的损失粘附功能研究中观察到使用致癌v - src结构可能反映了事件和上皮间充质细胞转化过渡,而内生SFKs基底的作用促进细胞粘附的加强反映了生理作用在AJ维护(48]。在这方面,它表明,在鼠标角质细胞,p120,β连环蛋白,γ连环蛋白(但不是钙粘蛋白)酪氨酸磷酸化后增加calcium-induced分化,恰逢协会的增加α连环蛋白和钙粘蛋白(p12040]。相反,除了激酶抑制剂的染料木素,tyrphostin,或PP1或菲英岛不足,减少信息粘附在dispase-mediated细胞释放试验和小鼠缺乏对菲英岛和Src显示缺乏信息粘附在皮肤40]。同样,PP2或者染料木黄酮治疗减少N-cadherin-based Rat-2成纤维细胞粘附,被至少部分归因于要求cortactin磷酸化来维持N-cadherin粘附[41]。Src活动也需要保持联接的稳定果蝇占主导地位,作为一个负突变的Src同族体Src42A诱导DE-cadherin联系人的瓦解42),果蝇胚胎缺乏Src同系物Src42A Src64显示,减少DE-cadherin和犰狳染色信息连接(43]。在一起,这些发现表明,酪氨酸激酶信号会导致AJ形成和稳定。
Src-mediated AJ形成的机制并不清楚。通过磷酸化酪氨酸激酶可以促进AJ组装的组件或间接通过酪氨酸磷酸酶的规定以及小gtpase。例如,Abl激酶可以通过ρ的监管,促进形成AJ Rac信号(44,45),而在E8鸡视网膜细胞,p120-associated拿来维持至关重要βN-cadherin连环蛋白绑定,通过促进Y152磷酸酶应用PTP1B的磷酸化,从而负责脱去磷酸Y654β连环蛋白(46]。强信号可以调解的装配和拆卸的粘合连接处并且复杂的相互作用。了解如何以及何时磷酸化事件将导致损失或加强细胞粘连是我们的一个主要挑战。
3所示。钙粘着蛋白酪氨酸激酶的上游也可以和RTK信号调节
迄今为止,研究讨论了钙粘蛋白和连环蛋白的下游PTK活性,但钙粘蛋白参与也可以调节PTK活性,将钙粘着蛋白相应上游激酶(图2)。例如,防止钙粘蛋白参与MCF7细胞使用钙粘蛋白阻止抗体减少了活跃的Src和信息枢纽,而珠涂钙粘蛋白/ Fc妄想提升活跃Src(快速增长47]。钙粘蛋白激活Src信号的机制被发现取决于酪氨酸磷酸酶RPTPα(49- - - - - -51),可能是通过删除530 Src autoinhibitory酪氨酸磷酸(52]。钙粘着蛋白也被证明能够绑定和调节受体酪氨酸激酶(RTK)信号,正面和负面的(53]。E-cadherin-mediated细胞粘附抑制表皮生长因子受体信号在MDCK细胞(54),但诱导ligand-independent表皮生长因子受体激活导致HaCat Erk信号增加角化细胞(55)在乳腺上皮细胞(56]。N-cadherin,另一方面,没有发现与表皮生长因子受体(54]。然而,N-cadherin接触刺激神经突产物在小脑神经元的激活FGFR [57),后来发现这一途径来促进肿瘤转移(58,59]。类似的VE-cadherin之间的相互作用和VEGFR2所需接触抑制内皮细胞生长的60剪切应力)和内皮反应(61年- - - - - -63年]。此外,VEGF-induced Src激活需要埋头的离解(激酶抑制SFK激活(64年从VE-cadherin]), SHP2的招聘,然后脱去磷酸Src在530年酪氨酸,允许其激活(65年]。这种机制是让人想起粘附/ RPTPα全身的Src MCF7细胞激活(47,49- - - - - -51]。相反,p120超表达在HUVECs封锁通过预防中性粒细胞TEM ICAM-1-induced VE-cadherin磷酸化和VE-cadherin协会积极(pY419) Src [66年,67年),放置p120协会VE-cadherin上游,而不是下游,Src至少激活中性粒细胞transendothelial上下文中的迁移。总之,这些结果表明,钙粘蛋白可以促进或者阻止RTK-mediated信号。
尽管一些分子机制被嘲笑,它仍然很大程度上未知的钙粘素协会如何调节RTK信号。一个重要的线索来自于VE-cadherin VEGFR2-dependent应对剪切在内皮细胞(61年- - - - - -63年]。流体剪切力是由PECAM-1传播,导致VE-cadherin-dependent VEGFR2和Akt激活信号(63年]。机制包括PECAM-1张力增加,引发PECAM-1 /波形蛋白协会和减少VE-cadherin紧张的水平68年]。可能tension-mediated钙粘蛋白的变化可能不仅限于VEGFR2剪切下激活。钙粘着蛋白不断紧张(下12,68年,69年)和最近表明张力VE-cadherin连接可以调节信息联系人(70年,71年]。然而,尚不清楚是否紧张AJ的改变可以调节其他RTK反应或钙粘着蛋白磷酸化本身。
4所示。在内皮Adherens结是磷酸化
类似于其他经典钙粘蛋白,VE-cadherin的磷酸化状态被发现与内皮功能的差异有关。Lampugnani等人首先表明phosphotyrosine抗体标记内皮信息联系人(72年)通过证明松散支流HUVECs显示强大的交界phosphotyrosine标签,虽然这染色是减少紧密融合性的文化。进一步的研究表明,VEGF诱导内皮通透性的增加,需要酪氨酸激酶(73年),在VE-cadherin VEGF促进了酪氨酸的磷酸化,β连环蛋白,γ连环蛋白,p120 [74年]。VEGF也刺激的p120脱磷酸化丝氨酸残基(75年]。最重要的是,抑制SFK活动预防水肿形成几个动物模型(76年- - - - - -79年),证明因果角色SFKs VEGF-induced内皮屏障功能丧失。
的特殊磷酸化网站VE-cadherin针对VEGF是强烈的调查。这个问题变得更加复杂一些商业缺乏特异性的抗体在先前的研究中使用。Wallez et al。80年)表明,vegf - 165 HUVECs VE-cadherin磷酸化酪氨酸685感应,以此处则映射。在体外Src能直接使磷酸化短肽含有残留。其他包含c端多肽酪氨酸(从收于Y784)不是一个好的衬底在体外试验,表明Src要么是不能直接这些酪氨酸磷酸化VE-cadherin或其他对接网站(s)的完整蛋白质需要这个反应。发现没有磷酸化丝氨酸在VEGF治疗(80年]。这是鲜明的对比与研究结果Gavard和为81年),表明VEGF HUVECs VE-cadherin磷酸化丝氨酸665感应,促进关键一步β-arrestin绑定和VE-cadherin内吞作用。665年VE-cadherin丝氨酸磷酸化也涉及下游R-Ras,小血管分化所需GTPase表达下调的漏水的肿瘤脉管系统(82年]。HUVECs,表达一个活跃的形式的R-Ras (R-Ras38V)阻止VEGF-induced磷酸化S665和VE-cadherin内吞作用,而不影响VEGF-induced酪氨酸磷酸化Y658或Y731 [83年]。
VE-cadherin磷酸化也发生在应对其他刺激,包括TNF -α有限合伙人,H2O2和高葡萄糖(84年- - - - - -87年),尽管比VEGF治疗后慢动力学。增加肿瘤坏死因子-α(84年)或有限合伙人(85年]人类肺微血管内皮细胞(HMVEC-L)诱导持续屏障功能丧失,连同VE-cadherin酪氨酸磷酸化。这种磷酸化,然而,只有检测到细胞内接受原钒酸盐和氧化phenylarsine, TNF -α——或者LPS-induced增加渗透率不需要磷酸酶抑制,提高内生磷酸酶是否足够的问题直言不讳的酪氨酸磷酸化引起这些受体激动剂,而不影响渗透率的增加。在任何情况下,酪氨酸激酶活性的要求证明了几种激酶抑制剂的能力阻止单层通透性的增加引起的肿瘤坏死因子-α或有限合伙人84年,85年]。值得注意的是,非特异性抑制剂如染料木黄酮、herbimycin A, geldanamycin更有效地防止TNF -α全身的损失比SFK-specific屏障功能抑制剂PP1 PP2,暗示其他激酶可能参与并行通路(84年]。
大量的数据明白地指出一个非常重要的角色SFK-mediated酪氨酸磷酸化调节内皮AJ的屏障功能。然而,正如上面在上皮细胞中呈现的,不是简单的或单向的链接。SFK活动和VE-cadherin磷酸化可以观察到在活的有机体内在缺乏任何病理条件。Lambeng et al。88年]表明VE-cadherin高度磷酸化在一些健康成年小鼠的组织,尤其是肺和子宫,VE-cadherin磷酸化在血管生成刺激增长。最近,这是表明VE-cadherin磷酸化酪氨酸685在小鼠卵巢和子宫不同发情周期(89年]。此外,Orsenigo et al。90年)表明,小静脉和毛细血管,但不是小动脉,在小鼠膀胱和隔膜显示本构VE-cadherin磷酸化酪氨酸在658年和685年,这小静脉磷酸化依赖于基底SFK活动。在大鼠颈动脉显示VE-cadherin磷酸化酪氨酸685远低于颈静脉。有趣的是,颈静脉搭桥让静脉动脉血流急剧减少VE-cadherin磷酸化(90年]。最近,韦塞尔et al。91年731年)表明,酪氨酸,但不是酪氨酸685年既定的磷酸化在小鼠肺。替换的野生型VE-cadherin Y685F突变,但不是Y731F突变,导致皮肤血管渗漏的衰减后注射VEGF或组胺。类似敲入所使用的策略是西迪贝et al .,他发现Y685F VE-cadherin老鼠显示增加子宫和卵巢血管渗漏,表明VE-cadherin磷酸化在本网站可能有一个重要的角色维护血管完整性(92年]。在对比观察Orsenigo et al。90年),韦塞尔et al。91年并没有发现VE-cadherin是既定的磷酸化酪氨酸685的小静脉睾提肌血管。然而,治疗小鼠pervanadate提升685年酪氨酸磷酸化在小静脉,表明不同的基底酪氨酸磷酸酶活动(由于睾提肌血管的差异或更一般的鼠标应变差异)可以解释这两个报告的区别。引人注目的是,pervanadate治疗无法促进增加VE-cadherin磷酸化在小动脉,作者可能归因于缺乏活跃激酶VE-cadherin[附近的91年]。酪氨酸685提出了埋头结合位点和Y685F VE-cadherin突变并不与埋头[65年,93年微分埋头协会),提高的可能性,可以调节活性激酶的访问VE-cadherin c端酪氨酸。另外,连环蛋白绑定可能参与调节VE-cadherin磷酸化。例如,p120超表达可以减少VE-cadherin协会积极Src (66年,67年),虽然招聘拿来和应用PTP1B AJ见视网膜细胞(46]。调节VE-cadherin连环蛋白磷酸化的潜在作用小静脉仍有待考察。总的来说,这些发现表明不仅VE-cadherin在特定的酪氨酸磷酸化是重要的一步内皮和信息损失的粘连导致渗透率的增加和TEM,而且可以磷酸化VE-cadherin缺乏血管渗漏的情况下,展示在活的有机体内同时,其他信号必须被激活。
在体外SFK的影响在人类皮肤微血管细胞的激活依赖于激活的方法(94年]。与上皮细胞的发现一致,过度的既定的活性形式(Y530A)的Src VE-cadherin磷酸化,形成单层差距,三通的损失。然而,激活内源性SFKs通过阻断埋头增加VE-cadherin磷酸化没有促进单层通透性增加(94年),证明虽然SFK活动可能需要研究诱导VEGF和其他介质,SFK激活本身并不足以诱导屏障功能的丧失。相反,SFK-induced AJ磷酸化可能充当看门人,允许edemagenic刺激促进渗透率的增加。事实上,血管舒缓激肽能够诱导小静脉血管渗漏,显示增加了Src和VE-cadherin磷酸化,但不是在基底酪氨酸磷酸化(较低的网站90年]。有趣的是,气管的磷酸化酪氨酸685小静脉缓激肽、组胺注射后很快就消失了。在体外化验显示,这个事件是由于脱磷酸化clathrin-dependent VE-cadherin内吞作用和ubiquitin-mediated退化,而不是直接行动的磷酸酶(90年]。
5。白细胞Transendothelial迁移需要多个酪氨酸磷酸化的步骤
白细胞浸润到发炎组织是身体的一个主要方面对损伤的反应。到达所需的位置,白细胞必须穿过内皮细胞,这一过程被称为外渗。这是一个多步骤的过程,包括复杂的白细胞和内皮细胞之间的相互作用。白细胞与内皮细胞激活和启动一连串的分子间的接触,让他们从血液中遍历到通过内皮基质通过transcellular路线(即。通过内皮细胞)或paracellular路线(打开两个相邻差距ECs)(评论,看到95年- - - - - -97年])。内皮反应白细胞粘附和迁移涉及到多个信号通路的激活,尤其是Ca2 +释放,ρ激活、肌动蛋白重塑和酪氨酸激酶激活,周围所谓的白细胞粘附杯和促进细胞骨架变化永恒轮回白细胞腾出空间。本文重点是酪氨酸激酶信号,读者被称为最近出色的评论(16,98年,99年)全面讨论所涉及的所有其他已知的球员。
在早期,酪氨酸磷酸化的关键作用是公认的白细胞transendothelial迁移(TEM),至少部分由白细胞ICAM-1整合蛋白绑定,导致肌动蛋白细胞骨架(图的重构3)。ICAM-1结扎诱导多种蛋白质的酪氨酸磷酸化,包括粘着斑激酶(FAK),桩蛋白,中科院One hundred.],cortactin [101年]。ICAM-1 antibody-coated珠子促进了Src协会和酪氨酸磷酸化cortactin ICAM-1。抑制SFK活动阻止cortactin磷酸化与ICAM-1但不联系。符合的模型需要磷酸化cortactin ICAM-1集群、PP2治疗显著降低固定THP-1单核细胞的结合能力激活HUVECs和阻止ICAM-1集群粘附细胞(101年]。同样,cortactin击倒废除中性粒细胞通过TNF -轮回α激活HUVECs,可以拯救野生型cortactin-GFP reexpression,但不是由一个cortactin变异三个酪氨酸(Y421、Y466 Y482)是苯丙氨酸突变(cortactin 3 f-gfp) (102年]。ICAM-1 cross-linking-induced形成肌动蛋白在肿瘤坏死因子-应力纤维α对待HUVECs也被cortactin击倒,PP2治疗,或表达无尾的ICAM-1-GFP或cortactin 3 f-gfp。更重要的是,cortactin siRNA封锁了肌动蛋白的聚集和ICAM-1附着中性粒细胞(102年]。完全,这些发现强烈主张的关键作用SFK-mediated cortactin磷酸化调节ICAM-1集群和TEM。的cortactin调和TEM的证明在活的有机体内被斯诺et al。(提供103年)发现亏损cortactin小鼠中性粒细胞减少招聘。Cortactin基因敲除小鼠显示增加白细胞滚动速度,这与降低粘附postcapillary小静脉和减少ICAM-1集群在中性粒细胞。老鼠也显示增加基底血管渗漏,从而从力学上看从TEM分离屏障功能的规定。在体外营地,EPAC-specific模拟救了渗透率增加,而恢复了TEM效率表达式的一种本构RhoG [103年),激活下游的GTPase ICAM-1和Src SH3-containing guanine-nucleotide交换因子(SGEF) Rho-specific交换因子(104年]。
符合角色cortactin-mediated ICAM-1集群、顶端ICAM-1流动性减少在HUVECs ICAM-1抗体介入细胞表达全长ICAM-GFP交联,但不是无尾的ICAM-GFP [102年]。然而,表达一个ICAM-1缺失突变体缺乏细胞内尾更有效地防止transcellular比paracellular TEM (105年]。这一发现的影响是不完全清楚,与肌动蛋白细胞骨架ICAM-1集群通过协会似乎是一个关键组成部分的响应调节白细胞绑定paracellular和transcellular迁移。ICAM-1流动性也减少ICAM珠子的网站绑定到海拉细胞表达野生型ICAM-1-GFP,但不是c端尾删除(106年]。ICAM-1珠粘附HUVECs Rac1抑制剂,防止肌动蛋白聚合或肌凝蛋白II。mef从Src,有趣的是,是的,菲英岛(SYF)三重SFK基因敲除小鼠reexpressing与否Src显示类似ICAM-1-GFP收紧动力学和珠绑定,这表明至少在mef SFK活动不是一个主要玩家在ICAM-1动力学(106年]。
有趣的是,白细胞受体可以磷酸化酪氨酸(图3)。Src使ICAM-1磷酸化在体外在512年酪氨酸(107年]。绑定的HUVECs激活纤维蛋白原诱导的酪氨酸磷酸化ICAM-1和推广ICAM-1 / SHP2交互通过一种机制,要求512年酪氨酸磷酸化107年]。可能这个磷酸化作用ICAM-1函数提出了因为TNF -α全身ICAM-1乳沟被废除Y512A突变(108年]。HUVECs ICAM-1-mediated Src和以挪士激活依赖于ICAM-1酪氨酸磷酸化,因为表达式鼠标Y518F突变ICAM-1构造(对应于人类残渣人民币)阻塞ICAM-1 cross-linking-induced Src,以挪士,一种蛋白激酶磷酸化(109年]。重要的是,这种Y518F ICAM-1构造是不像野生型高效ICAM-1在促进中性粒细胞在HUVECs TEM。PP2抑制实验表明,SFK ICAM-1所需活动,一种蛋白激酶,和以挪士磷酸化而PI3K抑制剂渥曼青霉素能够阻止以挪士,但不是ICAM-1磷酸化,表明PI3K行动Src的下游和上游以挪士(109年]。然而,表达Y512F ICAM-1几乎一样有效地促进淋巴细胞迁移的野生型ICAM-1 GP8/3.9永生化大鼠大脑微血管内皮细胞(110年),这表明这个Src衬底网站不是ICAM-1功能的关键。此外,内生ICAM-1不是这些细胞磷酸化与淋巴细胞孵化后的(110年]。说明ICAM-1磷酸化作用的白细胞轮回就需要进一步的研究,特别是在活的有机体内。
PECAM-1是另一个白细胞受体已知至少两个酪氨酸磷酸化,Y633和Y686111年]。相反大多数leukocyte-interacting蛋白质,PECAM驻留在一个专业室,叫外侧边界回收舱(LBRC) [96年]。酪氨酸磷酸化PECAM浓缩在LBRC [112年),这对于成功的TEM,磷酸化似乎重要因为要么PP2治疗(112年)633年酪氨酸或突变(111年)防止PECAM回收细胞表面和TEM(图3)。
允许通过paracellular TEM路线,内皮细胞必须拆卸adherens紧密连接,维持强劲的同型的细胞内接触为了创建空间的迁移(图3)。早期的工作表明,白细胞通过内皮间隙轮回在活的有机体内(113年),在体外(114年)和单核细胞和诱导U937细胞可逆交界VE-cadherin和连环蛋白的损失在TEM (115年]。已经有相当大的兴趣了解酪氨酸磷酸化影响上下文的粘合连接处并且TEM的稳定。中提升VE-cadherin磷酸化抗体介入ICAM-1结扎GPNT老鼠大脑内皮细胞和bEND5老鼠大脑内皮瘤细胞(116年]和bead-mediated ICAM-1交联诱导迅速Src和Pyk2-dependent磷酸化VE-cadherin TNF -α对待HUVECs [66年,117年]。特别是,ICAM-1 ligation-induced, Src-mediated VE-cadherin磷酸化可以被p120超表达(66年]。类似的磷酸化事件观察单核细胞的粘附后THP-1细胞肿瘤坏死因子-α对待HUVECs [117年老鼠的外周淋巴结淋巴细胞)和绑定GPNT细胞(116年]。连环蛋白的酪氨酸磷酸化、ZO-1或occludin ICAM-1交联后没有发现GPNT细胞(116年]。其他受体可能激活类似下游通路,交联的内皮细胞诱导Src CD47, Pyk2, VE-cadherin磷酸化激活HUVECs [118年)和VCAM-1交联促进VE-cadherin和VE-PTP离解bEnd5细胞(119年,120年]。HUVECs、活跃pY419 Src和pY402 Pyk2 ICAM-1珠子周围的标签显示了类似的模式,但是没有β连环蛋白还是VE-cadherin在网站看到ICAM-1订婚的117年]。然而,治疗SFK抑制剂PP2或表达的显性负Pyk2 CRNK减少中性粒细胞TEM pY658 pY731信号和预防。进一步确认的角色这两个磷酸化酪氨酸,过度Y658F和Y731F nonphosphorylatable VE-cadherin-GFP突变体强烈降低paracellular TEM野生型相比VE-cadherin-GFP [117年]。令人惊讶的是,VE-cadherin磷酸化在GPNT ICAM-1交联后细胞对PP2治疗,排除SFKs为主要参与这种磷酸化激酶116年]。造成这种差距的原因是未知的,但是微分定位Src和其他激酶在回应珠或IgG-induced ICAM-1交联可能解释这种矛盾的结果。确定的具体网站VE-cadherin磷酸化ICAM-1结扎,CHO细胞工程表达与野生型或突变VE-cadherin-GFP ICAM-1在一起。胰蛋白酶的消化32P-labeled CHO-ICAM-1细胞表明ICAM-1交联促进VE-cadherin Y731磷酸化。有趣的是,作者提到,大多数磷酸化VE-cadherin事件发生在丝氨酸和苏氨酸,而不是酪氨酸残基(116年),但这些磷酸化残留的影响仍然未知。为了测试VE-cadherin磷酸化的因果作用,一系列的Y / F点突变体表达内皮瘤细胞来源于VE-cadherin零老鼠。令人惊讶的是,reexpression野生型VE-cadherin或VE-cadherin-GFP融合构建双重的增加,而不是减少,TEM抗原的T细胞。表达不同的突变体在CHO细胞表明酪氨酸731是主要的磷酸化参与TEM。与野生型相比VE-cadherin-GFP,表达Y731F-VE-cadherin-GFP突变只允许50%的TEM在不影响t细胞粘附,而细胞表达Y658F和Y685F TEM的野生型VE-cadherin突变体允许类似的水平。Y731的作用在体外确认GPNT细胞,表达内源性VE-cadherin。在这些细胞,表达Y731F(以及Y645F Y733F,但不是Y / F Y658突变,Y685, Y725,或Y757)显著降低t细胞TEM。没有突变影响淋巴细胞粘附细胞(116年]。至关重要的是,老鼠窝藏Y731F敲入突变VE-cadherin显示大大减少白细胞浸润,从而直接展示在白细胞TEM酪氨酸的至关重要的作用在活的有机体内(91年]。虽然这酪氨酸似乎既定的磷酸化,白细胞附件诱导其通过一个机制,该机制涉及磷酸酶SHP2脱磷酸作用。未知是否酪氨酸658也是必需的在活的有机体内所显示的数据获得的阿林厄姆et al。117年]。类似敲入的方法可能有助于回答这个问题。因此,在体外数据显示,白细胞附件能促进VE-cadherin磷酸化,但是在活的有机体内实验表明临界VE-cadherin既定的磷酸化酪氨酸,表明SFK-mediated磷酸化下游的主要目标白细胞附件(通过至少ICAM-1、VCAM-1和CD47订婚)可能比VE-cadherin其他蛋白质,如cortactin FAK,或以挪士。
6。的酪氨酸磷酸化调节钙粘着蛋白/连环蛋白协会
连环蛋白绑定支持cadherin-based粘连是至关重要的。因此,p120绑定增加上皮侧聚集和粘附强度121年,122年和防止钙粘蛋白的内吞作用123年,124年]和VE-cadherin [125年- - - - - -129年]。β连环蛋白也会增加VE-cadherin粘附强度(130年)和函数作为一座桥连接钙粘蛋白α连环蛋白和肌动蛋白细胞骨架(11,12]。后者协会的一个关键作用是证明了锁钙粘素的表达直接融合结构α连环蛋白,因此是独立的β连环蛋白协会和离解。钙粘蛋白的表达构建融合α连环蛋白促进强有力的信息粘附[131年,132年]。此外,细胞表达这种构造被pervanadate耐离解诱导治疗(132年]。优雅的研究舒尔特et al。133年使用敲入小鼠表达VE-cadherin -]α连环蛋白嵌合体证明的离解α从VE-cadherin连环蛋白是一个需要一步的血管通透性诱导VEGF或组胺和允许嗜中性粒细胞和淋巴细胞招聘到炎症组织。
酪氨酸磷酸化调节信息附着力的观察,发现钙粘着蛋白一起连环蛋白酪氨酸激酶的目标,导致强烈的研究来确定磷酸化adherens结结构的影响,认为钙粘蛋白的磷酸化和/或连环蛋白可能导致钙粘着蛋白发生变化/连环蛋白协会。一致地,β连环蛋白磷酸化可能作为开关允许或阻止钙粘着蛋白与肌动蛋白细胞骨架的影响其粘附和结合的能力α连环蛋白。F9细胞,phosphomimetic Y142E突变β连环蛋白没有coimmunoprecipitateα连环蛋白,而Y654Eβ连环蛋白突变降低但没有废除与钙粘蛋白(coimmunoprecipitate的能力134年),这表明这两个酪氨酸是明显的参与β连环蛋白与钙粘蛋白α连环蛋白。因此,在IEC18肠道上皮细胞,k - ras基因导致的过度β连环蛋白磷酸化酪氨酸在142年和654年,诱导钙粘蛋白和离解α连环蛋白(135年]。拿来和菲英岛促进了销售税的磷酸化β连环蛋白构建酪氨酸142,导致的离解β连环蛋白从α连环蛋白而不是钙粘蛋白。Y142Fβ连环蛋白突变体抗Fer-induced损失α连环蛋白绑定。相比之下,Src和是的能够使磷酸化β连环蛋白酪氨酸在站点之外的其他站点142135年]。在老鼠心脏,VEGF诱导FAK激活,绑定VE-cadherin,磷酸化β连环蛋白酪氨酸Y142,促进的离解β从VE-cadherin连环蛋白136年]。
尽管phosphorylation-induced连环蛋白绑定的损失是一个有吸引力的机制来解释信息的减少粘连,积累证据清楚地表明,AJ磷酸化不能直接与AJ拆卸在每一个案例。相反,净效应的整体和多个操作,增加或减少AJ蛋白质协会,根据相关激酶和特定的酪氨酸磷酸化。例如,在3日元成纤维细胞(25)和MDCK细胞(27)改变了v - src,钙粘蛋白能够coimmunoprecipitateα连环蛋白或β分别连环蛋白,即使v - src诱导钙粘蛋白磷酸化的显著增加。此外,v - src激活细胞粘附强度降低L成纤维细胞表达上皮-α连环蛋白融合构建没有绑定β连环蛋白,证明Src可以抑制细胞粘附独立于结拆卸β连环蛋白磷酸化(30.]。角化细胞诱导分化培养的高2 +媒体显示增加的磷酸化β连环蛋白和γ连环蛋白,与协会的增加有关α连环蛋白和钙粘蛋白(p12040]。此外,p120和β连环蛋白可能是独立监管。例如,诱发性转换MCF10A人类乳腺上皮细胞促进了AJ的酪氨酸磷酸化和钙粘蛋白的损失/组件β连环蛋白绑定同时增加钙粘蛋白/ p120协会(29日]。类似的观察是在IEC细胞k - ras基因表达(135年]。一致地,在体外磷酸化和绑定化验表明,Src可以直接使磷酸化p120和β连环蛋白有显著不同的结果:β连环蛋白磷酸化在Y654减少β连环蛋白亲和力的钙粘蛋白胞质域,p120磷酸化增加钙粘蛋白绑定(137年]。在E8鸡视网膜细胞,p120-associated拿来维持至关重要β连环蛋白绑定N-cadherin通过磷酸化和磷酸酶应用PTP1B的激活,进而负责脱去磷酸β连环蛋白酪氨酸654 (46]。γ连环蛋白磷酸化也会导致不同的结果,这取决于相关激酶和磷酸化酪氨酸。虽然Src-mediated磷酸化酪氨酸683减少了协会γ连环蛋白和钙粘蛋白α连环蛋白,Fer-induced磷酸化酪氨酸549增加了γ连环蛋白绑定α连环蛋白(138年]。
酪氨酸磷酸化也与AJ内皮的离解。酪氨酸VE-cadherin尾巴的658年和731年所需的绑定连环蛋白(139年),因为phosphomimetic突变Y658E和Y731E VE-cadherin构造CHO细胞表达p120和防止绑定β分别连环蛋白。表达相同的突变体避免紧张障碍的形成在这些细胞(139年]。同样,Y658F VE-cadherin,但不是wt或Y658E VE-cadherin,能够结合p120在大鼠脂肪垫内皮细胞缺乏内生VE-cadherin [140年]。一致,VEGF治疗人类肺微血管细胞诱导的损失βVE-cadherin连环蛋白和p120绑定,这与磷酸化VE-cadherin和相关β连环蛋白酪氨酸654 (141年,表达一个Y658F / Y731F VE-cadherin突变阻止VEGF-induced VE-cadherin绑定的渗透率和损失β连环蛋白和p120141年]。进一步说,过度的催化地活动C459S SHP2突变体在大鼠肺微血管内皮细胞导致增加VE-cadherin的磷酸化,p120,β连环蛋白和减少与VE-cadherin p120协会与屏障功能的丧失(142年]。VE-cadherin磷酸化,然而,并不总是与协会与p120或下降β连环蛋白。在早期,埃塞尔et al。74年)表明,HUVECs,刺激VEGF促进VE-cadherin连环蛋白磷酸化,但这种治疗并不影响钙粘蛋白的水平/连环蛋白coimmunoprecipitation,显然分离磷酸化事件钙粘着蛋白与连环蛋白的丧失。同样,histamine-induced VE-cadherin HMEC-1细胞磷酸化并没有紧随其后的丧失与p120 VE-cadherin协会,β连环蛋白,或γ连环蛋白(143年]。此外,血管舒缓激肽治疗HUVECs推广VE-cadherin磷酸化酪氨酸所需658这磷酸化VE-cadherin内吞作用,内化VE-cadherin仍与p120 [90年]。因此,多种因素可以促进AJ酪氨酸磷酸化没有促进钙粘着蛋白绑定的丧失。直接评估的能力Src-induced AJ磷酸化分解adherens结复杂,增加酪氨酸信号在人类皮肤微血管细胞诱导的超表达持续活跃(Y530A) Src结构或通过抑制埋头活动(94年]。埋头是通过抑制过度的激酶死(K222R)作为主要的变异埋头负(144年]。而细胞显示明显增加酪氨酸磷酸化,包括VE-cadherin、内生能力VE-cadherin colocalize和coimmunoprecipitate p120,β连环蛋白,γ连环蛋白没有影响(94年]。Y530A Src(但不是DN-Csk)诱导的屏障功能,以形成单层差距来衡量,三通,白蛋白渗透率(94年),证明减少钙粘着蛋白/连环蛋白协会不得要求内皮屏障功能丧失。
诱发凝血酶,另一个强大的代理迅速增加内皮通透性,促进了酪氨酸的磷酸化β连环蛋白而不影响其与VE-cadherin协会,以coimmunoprecipitation [145年]。HPAE细胞,thrombin-induced单层空白薄膜包含预测仍然连接两个相邻细胞(146年]。有趣的是,作者观察到的水平的减少colocalization钙粘蛋白和连环蛋白只有在这些预测,没有一般钙粘着蛋白损失/连环蛋白coimmunoprecipitation或colocalization身体细胞的其余部分(146年),这表明AJ破坏可能发生只在附着力损失的网站。这些预测是“指状”结构形态相同的TGF -后观察β治疗牛肺动脉细胞(147年),不连续处TNF诱导-α(148年),焦Huveneers等人所示包含粘合连接处并且vinculin分子连接VE-cadherin径向肌动蛋白连接(149年]。在其他研究中,VE-cadherin后这些薄结构内和连环蛋白仍然存在差距的形成,可能是负责维护两个内皮细胞周围的差距之间的连接(147年- - - - - -149年]。事实上,至少在TGF -β,似乎差距形成之前的损失连环蛋白染色(147年),这表明adherens结复杂混乱的可能性是一个结果,而不是原因,持续亏损的附着力。焦点可能参与交叉的粘合连接处并且形成和重塑在体外(149年,150年]这剩余的连接可能是至关重要的在活的有机体内确保快速关闭差距提出巴et al。151年]物质P-induced差距形成的详细描述后大鼠气管小静脉。详细的实验进行多色生活以高分辨率成像需要设置这个问题。
adherens结复杂的规定还可能涉及到的磷酸化丝氨酸和苏氨酸。HPAE细胞,凝血酶效果PKC-dependent VE-cadherin和脱磷酸化β连环蛋白和p120磷酸化146年]。VE-cadherin磷酸化是评估通过二维电泳而不是phosphotyrosine写就可以,许多观察事件发生在脱磷酸化丝氨酸和苏氨酸残基,而不是酪氨酸(146年]。事实上,PKCα被证明调解凝血酶和LPS-induced p120磷酸化丝氨酸879,导致VE-cadherin的离解和AJ拆卸(152年]。上皮型丝氨酸磷酸化调节α连环蛋白,β连环蛋白,γ连环蛋白绑定和集群的八个丝氨酸残基的突变catenins S838 S853阻止钙粘蛋白绑定(以钙粘蛋白IP的35S-labeled细胞)和废除粘附的能力,促进细胞聚合的方法来确定信息接触强度(153年]。结构研究表明增加磷酸化钙粘蛋白和之间的亲和力β连环蛋白(154年,155年]。上皮型丝氨酸磷酸化可能由酪蛋白激酶(CK)。CK-II-mediated上皮型丝氨酸磷酸化作用增加β连环蛋白绑定在老鼠NIH3T3表达外源钙粘蛋白(156年,157年]。在体外,CK-II磷酸化野生型钙粘蛋白,而S840A S853A, S855A钙粘蛋白突变体是抵抗CK-II-mediated磷酸化(156年]。在另一项研究中,CK-I磷酸化在S846钙粘蛋白在体外(158年],而CK-II能够使磷酸化S846A钙粘蛋白突变体,但不是钙粘蛋白构造中丝氨酸849年,852年和855年的突变为丙氨酸,这表明CK-I和CK-II使磷酸化粘附在接近但不同的站点。在销售税拉化验,S846D phosphomimetic变异显示降低绑定β连环蛋白但没有修改与p120 [158年]。丝氨酸846、849、852和855年的钙粘蛋白对应S742, S745, T748, S751 VE-cadherin,但它是未知的酪蛋白激酶能否使磷酸化VE-cadherin。联想到,在该地区phosphorylatable残留物都是守恒的,唯一例外的丝氨酸苏氨酸替代和两个酸性氨基酸相互替换(S852年年代853年E854年→T748年D749年年代750年),称支持守恒的负电荷在这一领域的必要性。CK-I是最好的一个组成部分β连环蛋白破坏复杂,是Wnt通路的一部分(159年),但也发现使磷酸化p120和α连环蛋白。Wnt3a, CK-I p120磷酸化,连接p120 Wnt-mediatedβ连环蛋白转录(160年]。为了应对EGF, CK-II磷酸化α641年连环蛋白在丝氨酸,导致释放β连环蛋白和增加β连环蛋白transactivation [161年]。最近,它还表明CK-I和CK-II可以使磷酸化α连环蛋白在体外集群上的丝氨酸和苏氨酸残基α连环蛋白灵活连接器(162年),包括S641。nonphosphorylatable和phosphomimetic的表情α连环蛋白突变体在MDCK细胞模型的单层分散建议的磷酸化α连环蛋白在该地区推广信息粘附强度和单层完整。这种效果,然而,并不是由于联接的装配的变化,与钙粘蛋白或相关联的所有突变体β连环蛋白相同的程度(162年]。
总的来说,生化的观测数据表明,未必意味着一个特定的磷酸化发生巨大变化,钙粘着蛋白/连环蛋白协会将检测到。虽然这个事实并不否定一个重要的角色在联接的磷酸化调节adherens结的装配和拆卸,可以得出几个结论从所有积累的证据。首先,酪氨酸信号必须一致行动与其他途径促进细胞粘附交界拆卸和损失,直接激酶激活并不总是导致交界的损失。第二,激酶缺陷模型和小分子抑制剂表明基底的酪氨酸磷酸化交界的维护,需要一个精确的监管活动可能需要的水平,以确保正常的细胞粘附。第三,荧光成像技术显示联系人信息的损失是可逆的,地理位置有限,因此生化方法可能缺乏敏感性检测小而重要的变化。可以设想,联接的拆卸和钙粘蛋白损失/连环蛋白协会可能会严格限制亚细胞周围的地区立即形成差距或永恒轮回的白细胞和暂时限制的起始事件,改革很快允许交叉的复苏。
7所示。FAK有双重角色
尽管大多数的努力理解酪氨酸激酶信号调节内皮联系人一直关注SFKs,一个重要的角色出现粘着斑激酶的酪氨酸激酶家族。顾名思义,FAK而闻名(综述[信号转导过程的上下文中163年])。值得注意的是,FAK和Src有复杂的相互作用。FAK Src衬底,但是它也可以调解Src激活,将FAK上游和下游Src (163年]。FAK调节上皮细胞连接有多个角色在集体细胞迁移和转移,这超出了本文的范围(164年,165年]。与其他酪氨酸激酶信号在内皮细胞,FAK被描述作为发起人的AJ形成和加强以及AJ拆卸的诱导物。在大鼠肺微血管内皮细胞,FAK介导的增加引起的te hyperosmolarity [166年)以及经济复苏的障碍函数的瞬时损失了过氧化氢处理后(167年]。同样,从thrombin-induced HPAECs失去屏障功能的恢复依赖于FAK活动(168年]。在这个研究中,FAK的表达相关nonkinase (FRNK,内生FAK活动块(163年)降低基底三通和阻止凝血酶后的复苏。FRNK阻塞p190 RhoGAP磷酸化和提升持续ρ激活。此外,阳离子liposome-mediated FRNK表达式肺灌注液体渗透性增加隔离小鼠肺、展示FAK活动在整个组织的作用168年]。FAK激活下游的PAR1凝血酶受体介导的Gβ1与菲英岛,导致激活与p120 FAK协会(169年]。FAK还招募了AJ的细胞治疗鞘氨醇1-phosphate (S1P)受体激动剂,促进内皮屏障加强(170年]。在这些实验中,FAK共沉淀β连环蛋白S1P治疗后,击倒β连环蛋白阻止了FAK和VE-cadherin之间的联系。SFK此外,林恩激酶,促进内皮屏障的稳定的FAK磷酸化酪氨酸576/577和925171年)和FAK-deficient鼠标内皮细胞通透性增加显示FITC-dextran [172年]。因此,有许多强大的迹象在体外和体外FAK促进联接的装配和内皮屏障功能。然而,公布的数据还认为赞成另一个角色在促进屏障破坏。FAK击倒在永生的人类微血管基底细胞增加三通(173年)和FRNK表达封锁了VEGF-induced渗透率增加隔离猪冠状动脉小静脉和HUVECs174年]。此外,而不是观察老鼠的肺(168年),直接转染FRNK成猪冠状动脉小静脉并不影响基底透气性但阻止neutrophil-induced泄漏(175年]。确认这个激酶VEGF的作用效果,VEGF-induced渗透率废除了FAK抑制剂pf - 562271 HPAECs和激酶死FAK的表达鼠内皮细胞(136年]。此外,FAK可以直接使磷酸化在体外在Y658 VE-cadherin (176年]。
最终证明内皮FAK的要求促进内皮屏障功能在活的有机体内是由施密特et al。177年),通过证明条件FAK删除在急性肺损伤的内皮提升功能,如出血、水肿、中性粒细胞积聚。作者认为表型p115RhoGEF RhoA介导的激活增加。然而,陈等人。136年]表明VEGF-induced渗透率被废除激酶在小鼠表达死亡(K545R) FAK在内皮。作者使用了一个小鼠模型中一个液氧FAK等位基因被删除在它莫西芬的内皮,而另一个等位基因由野生型FAK或K545R FAK敲入,因此呈现鼠标ECs与活跃或不活跃的FAK,分别。使用这个模型中,他们需要证明FAK VEGF-induced真皮血管渗漏。这种效应被FAK模仿抑制剂pf - 562271 (136年]。K545R FAK敲入小鼠还显示减少VEGF-mediated肿瘤细胞外渗和VE-cadherin Y658磷酸化(176年]。以上提供的数据显然FAK牵连到至少两个截然不同的角色,一个激酶,需要正常联接的装配和另一个角色的下游edemagenic VEGF的影响。一个可能的解释这些看似矛盾的角色可能躺在FAK抵消ρ激活的能力(可能是占主导地位的联接的装配和对凝血酶)和调解Src激活(一个关键的步骤,VEGF信号)。其他Cre-inducible FAK敲入小鼠已经被开发出来,包括nonphosphorylatable突变体Y397F和Y861F phosphomimetic Y397E [178年]。将重要的确定这些点突变体的表型之间的异同与FAK null和上述激酶死突变,因为他们可能会提供新的认识了解微分FAK在细胞粘附的角色。
8。硬币的另一面:酪氨酸磷酸酶
Adherens结可以绑定到至少12个不同的蛋白质酪氨酸磷酸酶(了15,179年])。其中,一些已经被证明能够影响细胞间粘附强度,通过直接脱去磷酸adherens结组件或通过间接影响他们的磷酸化水平RTK信号的调制和SFK激活。最相关的结果的讨论有关内皮屏障以下规定。
8.1。SHP2
Src homology-2 (SH2) domain-containing磷酸酶2 (SHP2,也叫做PTP11、PTP-1D或PTP-2C)是一种无所不在地表示磷酸酶与多个肿瘤恶性肿瘤有关,以及三个密切相关的遗传发育障碍(180年- - - - - -182年),努南综合症,Noonan-like障碍与多个巨细胞病变综合征,豹综合症,包括,在许多其他缺陷,淋巴管畸形和出血的困难183年]。
第一次表明SHP2可能调节内皮和信息提供的联系人是Ukropec et al。184年]。HUVECs,凝血酶促进持久的瞬态增加不到30分钟的几个phosphotyrosine乐队VE-cadherin与p120 comigrated免疫沉淀反应,β连环蛋白,γ连环蛋白。增加与SHP2磷酸化和失去SHP2 VE-cadherin免疫沉淀反应。直接SHP2协会β连环蛋白可能是,因为一个偏远的污点分析表明,构造组成的GST-tandem SHP2 SH2域绑定到孤立β连环蛋白,但不是VE-cadherin、p120或γ从HUVEC连环蛋白溶菌产物(184年]。一致,Timmerman等人表明凝血酶促进了瞬态β连环蛋白磷酸化,持续了15 - 30分钟(145年]。凝血酶治疗诱导Src激活和SHP2磷酸化在Y542动力学相关的损失β连环蛋白磷酸化和三通的恢复。证明SHP2介导复苏,不仅表明,SHP2从细胞免疫沉淀反应用凝血酶治疗能够脱去磷酸β连环蛋白在体外,而且SHP2击倒延长了β连环蛋白磷酸化和thrombin-induced te损失(145年]。此外,SHP2-mediated调节细胞粘附可能涉及ρgtpase,凝血酶反应的主要介质。在早期,它是显示SHP2抑制成纤维细胞促进ρ激活(185年]。在血管平滑肌细胞,SHP2介导血管紧张素II-induced脱磷酸作用和p190RhoGAP失活,导致增加RhoA激活(186年]。证明这个途径是活跃在内皮细胞中提供PAECs [142年]。在这些细胞,抑制SHP2活动的表达活性突变C459S SHP2或治疗的药理SHP2抑制剂nsc - 87877减少p190RhoGAP活动和推广RhoA激活以GST-RBD拉化验。SHP2抑制基底在PAECs单层阻力减少,促进了磷酸化VE-cadherin和增加β连环蛋白以IP和phosphotyrosine免疫印迹(142年]。最近,这是表明,有限合伙人和诱导减少凝血酶治疗肺SHP2活动和协会与FAK [187年]。另外,脂质体的交付一个既定的活动(D61A) SHP2突变小鼠减少肺水肿与有限合伙人或挑战铜绿假单胞菌(187年),这表明SHP2在预防急性肺损伤中起着重要的作用。
SHP2也调节响应其他血管活性的介质。早期发现VEGFR2磷酸化针对vegf - 165在vitronectin HUVECs增长远高于在胶原细胞生长我188年)是归因于微分SHP2通过直接的参与与磷酸化VEGFR2 [189年]。SHP2可能间接促进Src脱去磷酸活化的埋头调节器Cbp和灭活埋头190年]。事实上,SHP2介导Src和VEGF治疗后PI3K激活诱导的离解埋头从VE-cadherin BAECs [65年]。与Gab1 SHP2交互,一个适配器强烈associates SHP2和PI3K蛋白(191年,192年),也可以部分解释为什么需要SHP2 VEGF-induced PI3K激活。在猪主动脉内皮细胞,流诱导形成的一个复杂的涉及SHP2 Gab1, PI3K所需,以挪士磷酸化(流193年]。流也诱导SHP2 Gab1易位BAECs的质膜(194年),以及增加两BAECs SHP2 PECAM-1协会(194年]和HUVECs [195年]。复杂的涉及SHP2 Gab1, Grb2也介导PI3K激活下游FGFR1受体(196年,197年]。重要的是,FGF2 FGFR1的配体,提升紧在小鼠角膜血管新生毛细血管的形成模式198年]。SHP2介导的监管adherens结稳定的下游FGF似乎涉及到一个不同的机制。BAECs,抑制FGF信号提升VE-cadherin内化,从p120离解,效果有重要影响在活的有机体内老鼠的,因为抑制FGF信号使用adenoviral交付FGF陷阱稳定血管完整性和促进血管障碍损失(199年]。同一组的后续研究显示,过度FGFR1的占主导地位的否定形式(FGFR1DN)减少VE-cadherin协会和SHP2 p120 [200年]。FGFR1DN诱导VE-cadherin的磷酸化,但不是p120以及交界的本地化VE-cadherin-GFP构造的丧失。磷酸化的VE-cadherin Y658所需交界本地化的损失,作为Y658F VE-cadherin-GFP构造是抵抗FGFR1DN-induced交界的损失。确认损失的因果角色SHP2在这个模型中,过度的SHP2部分获救FGFR1DN-induced te的损失(200年]。
8.2。Dep1
Dep1(也称为CD148和20元η)是一种广泛表达磷酸酶,最初从海拉cDNA克隆库(201年]。在体外,发现Dep1直接绑定到Src (202年),并脱去磷酸ZO-1, occludin [203年),p120,β连环蛋白(204年]。有趣的是,Dep1表达与细胞密度增加WI38和AG1518成纤维细胞201年]。将大鼠甲状腺PCMPSV细胞表达Dep1 Src活动增加通过Y527脱磷酸作用(对应于人类Src Y530)而不影响磷酸化水平Y416 (Y419人类Src)。这导致增加FAK和桩蛋白酪氨酸磷酸化的和整体的附着力增加基础(202年]。实验使用销售税在下拉菜单显示Dep1可以与蛋白质磷酸化交界内皮(205年和上皮203年)细胞。衬底捕获(D / A突变体)与p120 Dep1催化域共沉淀,β连环蛋白,γ连环蛋白的溶解产物HUVECs pervanadate处理,但不能控制细胞(205年]。类似于HUVECs观测,GST-C / S Dep1绑定到ZO1, occludin, Src,和p120 MCF10A乳腺上皮细胞的溶解产物用pervanadate预处理,但不是从控制细胞溶解产物(203年]。表达Dep1 MDCK-II细胞促进了单层屏障功能,以增加三通和减少FITC-dextran钙开关后渗透率测定(203年]。Dep1所扮演的角色也是研究A431D缺乏内源性表皮样宫颈癌细胞(经典钙粘蛋白(206年]),钙粘蛋白是reexpressed (204年]。Coexpression Dep1提升交界钙粘蛋白的增加的这些细胞,这依赖于钙粘蛋白/ p120协会,因为Dep1无法交界协会764年增长速度→AAA钙粘蛋白(204年),这一突变无法绑定p120 [121年]。钙开关试验,野生型而不是C / S Dep1强adhesion-mediated Rac激活而不影响CDC42或ρ三磷酸鸟苷水平。Rac激活通过Dep1也依赖于p120和钙之间的联系是观察到的细胞中表达野生型但不是764 aaa钙粘蛋白(204年]。尽管在体外Dep1被证明脱去磷酸p120, A431D细胞Dep1提拔的磷酸化水平的增加Y228 p120后钙补充。重要的是,作者发现Dep1表达也增加了交界VE-cadherin HUVECs表示时,尽管它仍然未知是否相同的p120-dependent机制是治理行动HUVECs [204年]。
Dep1也证明是内皮细胞中表达在活的有机体内并与VE-cadherin colocalize [207年),但它的作用并不是完全理解。纯合子突变的表达Dep1缺乏磷酸酶域embryonically是致命的。从多个血管缺陷包括胚胎死在E11.5扩大血管和增加血管内皮细胞增殖208年]。矛盾的是,老鼠完全缺乏Dep1是可行的和肥沃的209年),这表明敲入的表型表达Dep1变异可能是由于这个构建的主导作用。然而,Dep1基因敲除小鼠,而可行的,显示在模型中缺乏脑arteriogenesis左颈总动脉闭塞(210年),从而确认野生型Dep1在脉管系统的作用在活的有机体内。Dep1-mediated调节细胞增殖的机制通过VEGFR2的调制信号提出了Lampugnani et al。60]。降低扩散与内皮细胞接触抑制VEGF信号融合性的细胞。抑制VEGF信号依赖于Dep1活动,一起的表达β与VE-cadherin连环蛋白及其交互。表达式的催化地不活跃的C / S Dep1突变或siRNA-mediated Dep1击倒恢复VEGF-induced VEGFR2磷酸化和融合性的细胞中细胞增殖60),暗示的负面作用Dep1中介接触抑制VEGF信号。然而这磷酸酶,可能对不同VEGFR2下游信号相反的影响。在HUVECs Dep1击倒强VEGF-induced VEGR2在多个酪氨酸残基磷酸化,以及PLC的磷酸化γ以挪士,Erk1/2,但阻止VEGF-induced Akt激活(211年]。符合先前描述的角色在Src Dep1激活(202年),这是与减少VEGF-induced Src激活Dep1击倒细胞由于增加在Y530 Src磷酸化和减少Src和Gab1之间的联系(211年]。形成鲜明对比,吗啉代针对其中一个斑马鱼Dep1基因(Dep1a或Dep1b)促进血管缺陷可以通过抑制PI3K获救,这表明在斑马鱼Dep1负调节PI3K [212年]。相反地,可以磷酸化Dep1 Src和菲英岛Y1311 Y1320,导致Y530 Src的去磷酸化Dep1 [213年]。BAECs表达Y1311F / Y1320F Dep1突变没有显示Src VEGF在Y530脱磷酸化后,而Erk激活相似的野生型和YYFF Dep1-expressing细胞。Dep1击倒或YYFF突变HUVECs防止VEGF-induced VE-cadherin S665磷酸化,形成单层差距,增加FITC-dextran渗透率(213年]。
8.3。VE-PTP
VE-PTP(也称为R-PTP -β)是一个endothelial-specific跨膜酪氨酸磷酸酶,从bEnd5 cDNA克隆库(214年]。VE-PTP第一示范与VE-cadherin被显示,由Nawroth等人体内表达VE-PTP和VE-cadherin coimmunoprecipitated从COS-7溶解产物(215年]。COS-7细胞表达VE-PTP、VE-cadherin VEGFR2, VE-PTP能够脱去磷酸VE-cadherin [215年]。VE-PTP可能有一个重要的角色在促进联接的装配和维护细胞粘附。VE-PTP relocalization核内体回收舱和协会的信息接触VE-cadherin增加内皮bEnd3细胞融合和HUVECs,建议在AJ成熟(119年]。进一步支持这一概念,VE-PTP能够绑定和脱去磷酸γ连环蛋白(119年),一个交叉的组件,也增加了绑定VE-cadherin与细胞融合72年]。同样,在CHO细胞表达VE-PTP增加VE-cadherin协会γ连环蛋白,这表明这个磷酸酶可以增强VE-cadherin /γ连环蛋白绑定,但所有c端酪氨酸残基突变VE-cadherin取而代之的是苯丙氨酸也绑定γ连环蛋白在VE-PTP的存在,证明VE-PTP的效果γ连环蛋白绑定是独立于VE-cadherin的酪氨酸磷酸化水平(119年]。相反,VE-PTP击倒VE-cadherin-mediated附着力降低,FITC-dextran内皮通透性增加,增强中性粒细胞轮回。此外,中性粒细胞或t细胞对bEnd5细胞诱导的离解VE-PTP VE-cadherin和提升VE-cadherinβ连环蛋白,γ连环蛋白磷酸化(119年]。Leukocyte-induced VE-PTP离解从VE-cadherin被发现由VCAM-1通过通路,包括Rac1 ROS生成和Pyk2激活。阻塞VCAM-1抗体预防T-cell-induced离解,而直接VCAM-1交联促进VE-PTP / VE-cadherin离解(120年]。有限合伙人和VEGF也促进了离解VE-PTP和VE-cadherin之间在活的有机体内(216年]。确定这个分离的作用,作者敲入小鼠窝藏生成两个融合蛋白,VE-cadherin-FKBP VE-PTP-FRB。对待小分子rapalog时,这些VE-cadherin VE-PTP嵌合体被锁在一个heterodimeric构象,从而防止VEGF诱导的离解或白细胞附件。符合一个角色VE-PTP / VE-cadherin离解TEM, rapalog在这些敲入小鼠注射预防白细胞il - 1的外渗β全身的提睾肌的炎症模型,在不影响白细胞附件或滚动,并降低LPS-induced增加中性粒细胞的支气管肺泡灌洗(BAL)流体。Rapalog注射也降低VEGF和LPS-induced血管渗漏(衡量一个英里BAL流体分析和蛋白质含量,分别地。)(216年]。作用在血管渗透性VE-PTP还发现在斑马鱼模型中,这表明VE-PTP角色高度进化保存(217年]。在这个模型中,注入对斑马鱼的吗啉代VE-PTP引起血细胞聚集,出血,以及tetramethylrhodamine-dextran研究进展。电子显微镜显示,VE-PTP morphants, 60%的尾船ECs没有交叉的复合物,支持认为VE-PTP维护斑马鱼VE-cadherin粘连(217年]。
VE-PTP发挥了至关重要的作用在血管发展通过监管Tie2和VEGFR2信号。VE-PTP空鼠(218年]或老鼠表达一种截断VE-PTP [219年)不可行和胚胎死在E8.5-10由于血管畸形。尿囊外植体从VE-PTP-mutant老鼠显示大血管内皮细胞生长在表(219年]。此外,抗体VE-PTP诱导血管扩大在尿囊外植体,像观察VE-PTP-mutant老鼠(220年]。这些抗体没有导致Tie2血管扩张−−/尿囊,证明Tie2介导这一效应。进一步支持VE-PTP-Tie2轴控制生长,每天注射7天anti-VE-PTP抗体的年轻小鼠诱导血管扩大在舌头和Tie2磷酸化肺溶解产物(220年]。VE-PTP被证明与Tie2 bEnd5细胞和脱去磷酸Tie2体内表达,但不是VEGFR2 COS-7 [214年]。VE-PTP和Tie2可能作为负调节VEGF受体激活下游信号。VE-PTP击倒了VEGF-induced管形成telomerase-immortalized人类微血管内皮细胞种植在三维胶原蛋白我矩阵(221年]。这是与增加VEGF-induced磷酸化VEGFR2和扩散,在细胞凋亡(没有任何效果221年]。此外,VE-PTP-deficient拟胚体显示增加血管生成发芽和Y1175 VEGFR2磷酸化(222年]。研究同样发现,VE-PTP茎细胞脱去磷酸VEGFR2, Tie2所需的一种机制。同样,在猪主动脉内皮细胞缺乏Tie2, VE-PTP VEGFR2不共沉淀,即使在一个在体外测定VE-PTP能够直接脱去磷酸VEGFR2 [222年]。VE-PTP还可能涉及到的机制下游VE-cadherin磷酸化的规定,作为血管生成芽VE-PTP击倒胚胎体内显示增加pY658 VE-cadherin VEGF治疗后(222年]。这种效应可能是特定于VEGF-induced磷酸化,因为在bEnd5细胞VE-PTP通过抗体阻断或抑制siRNA-mediated击倒诱导Tie2磷酸化没有促进增加VE-cadherin磷酸化(220年]。
8.4。20元μ
20元μ是一种跨膜受体蛋白酪氨酸磷酸酶分离利用老鼠大脑的退化PCR引物cDNA其他酪氨酸磷酸酶(基于其同源性223年]。它包含一个免疫球蛋白四纤连蛋白域和类型III重复,可以调解亲同种抗原的交互通过其细胞外域(224年]。20元μ定位信息连接在MvLu貂肺上皮细胞和共沉淀钙β连环蛋白,α连环蛋白(225年]。在体外,20元μ可以直接绑定到细胞内钙粘蛋白域而不是α连环蛋白或β连环蛋白。Pervanadate治疗并没有阻止PTP的共同沉淀μ与钙粘蛋白,这表明20元μ也可以与过度磷酸化钙粘蛋白(225年]。然而,热敏v - src结构促进钙粘蛋白磷酸化和PTP的离解μ在WC5新生儿鼠小脑细胞(226年),这表明酪氨酸磷酸化可以调节钙粘蛋白/ PTP事件μ协会。20元的μ钙粘蛋白结合位点是位于38 c端氨基酸,接近β连环蛋白结合位点(226年]。有趣的是,20元μ能够维持钙粘蛋白粘附在LNCaP前列腺癌的细胞通过一个机制,包括脚手架,但没有催化活性(227年]。AJ / PTPμ协会并不局限于钙为20元μ共沉淀与钙N-cadherin, R-cadherin鼠肺提取(226年)和促进神经突的鸡视网膜神经节细胞种植在N-cadherin-coated表面(228年]。在人类肺微血管ECs, 20元μ与VE-cadherin共沉淀,在体外销售税在下拉菜单显示20元之间的直接交互μ和VE-cadherin229年]。这种相互作用可能是重要的调节内皮屏障,因为20元μ击倒或表达式构造白蛋白渗透率增加催化地无所作为。这种效应可能是由于监管VE-cadherin磷酸化,20元μ超表达细胞无限增殖HMEC-1减少基底VE-cadherin酪氨酸磷酸化(229年]。20元的表达μ在内皮细胞似乎是变量。20元μ表达增加几倍的提高单层融合在HUVECs [230年和牛主动脉内皮细胞231年]。在活的有机体内,其表达式可能局限于动脉。免疫荧光研究表明,20元μ小动脉和动脉的表达高于静脉的多个大鼠组织(231年,20元μ-LacZ敲入小鼠显示β牛乳糖小动脉和毛细血管的活动,但不是在静脉或有孔的内皮(232年]。这个观察可能至少部分解释为什么小静脉显示增加Src激活和VE-cadherin磷酸化(90年]。然而,pervanadate(块多个磷酸酶的活性,包括20元μ(233年)增加VE-cadherin磷酸化只有在睾提肌的小静脉血管(91年)反对PTPμ微分表达式是唯一的解释。
8.5。应用PTP1B
应用PTP1B是广泛表达nonreceptor酪氨酸磷酸酶保存的记录是第一个酪氨酸磷酸酶纯化和特征234年- - - - - -237年]。应用PTP1B可以脱去磷酸多个phosphotyrosine-containing蛋白质,包括一些受体和receptor-associated酪氨酸激酶(238年),因此它在心脏疾病中起着至关重要的作用,胰岛素抵抗,和瘦素调节,以及在多个肿瘤疾病(238年]。应用PTP1B的能力与所表现出的第一次粘合连接处并且Balsamo et al。239年,240年在鸡视网膜细胞。在这些细胞中,N-cadherin copurified酪氨酸磷酸化应用PTP1B和nonphosphorylatedβ连环蛋白。N-cadherin绑定应用PTP1B需要应用PTP1B酪氨酸磷酸化(152240年,241年]。反过来,应用PTP1B导致β连环蛋白去磷酸化(46,239年]。类似于20元μ(226年),应用PTP1B / N-cadherin协会是由一种N-cadherin糖基附近的地区,靠近β连环蛋白结合位点,虽然β连环蛋白和应用PTP1B不出现争夺N-cadherin绑定(242年]。除了直接参与脱去磷酸β连环蛋白,可能应用PTP1B可能影响交叉的稳定性通过Src的直接调制活动(243年- - - - - -246年]。例如,纤维蛋白原绑定β3整合素在血小板触发器应用PTP1B招聘到一个复杂的涉及Src,埋头,整合蛋白,导致埋头离解和Src激活通过脱磷酸化的酪氨酸530244年]。应用PTP1B Src-dependent时尚招募,因为预处理PP2块应用PTP1B协会整合素。因此,应用PTP1B不仅可以激活酪氨酸激酶信号,但它也可以促进酪氨酸激酶激活。然而,很少有人知道在内皮PTP1B-Src轴是否重要。应用PTP1B显示绑定,脱去磷酸VEGFR2在体外和野生型应用PTP1B的表达,但不是一个C / S催化地不活跃的突变体,防止VEGF-induced VEGFR2磷酸化Erk,但不是p38 HUVECs [247年]。相反,应用PTP1B击倒增加VEGF-induced VEGFR2磷酸化Erk激活,不增加基底VEGFR2信号。符合VEGFR2信号的增加,阻止应用PTP1B表达活动的C / S应用PTP1B突变或应用PTP1B击倒诱导VE-cadherin酪氨酸磷酸化的增加和减少三通(247年]。应用PTP1B可以用p120共沉淀,β连环蛋白和VE-cadherin大鼠肺微血管内皮细胞以及小鼠肺(248年]。有限合伙人在老鼠身上减少应用PTP1B之间的关系和治疗β连环蛋白。更重要的是,表达的抗氧化应用PTP1B突变降低LPS-induced肺部水肿(248年]。
9。结论和观点
今年是首次发现30周年的phosphotyrosine信息连接(20.]。从最初的发现,强烈的研究旨在了解的机制adherens结磷酸化是监管和确定这种磷酸化事件的功能效果。毫无疑问现在知道钙粘蛋白和连环蛋白磷酸化是一种常见的事件,发生在多个酪氨酸残基,由于复杂的平衡的多个酪氨酸激酶和磷酸酶与联接的蛋白质(图4)。而大规模的激酶激活或磷酸酶抑制导致细胞粘附大幅下降,有一个完整的理解的细节adherens结监管与有限的细胞,调节酪氨酸激酶激活。
SFKs的能力使磷酸化VE-cadherin SFK要求激活下游的多个受体,包括VEGFR2和ICAM-1,已经证明了这一点。然而,很明显,只是观察SFK激活内皮屏障功能无法预测的损失(94年]。发现在老鼠SFKs可能活跃的小静脉的内皮细胞(90年),VE-cadherin磷酸化在缺乏促炎的刺激(88年- - - - - -91年)提示重新VE-cadherin酪氨酸磷酸化在屏障功能的作用。一种可能性是,SFK-mediated VE-cadherin磷酸化可能充当看门人允许特定血管床对促炎的代理可能会触发细胞粘附的损失通过其他并行信号通路的激活。然而,其他机制(s)的SFK信号可能与其他通路不能排除相声,ρgtpase的直接监管等观察到下游的酪氨酸激酶和磷酸酶(133年,142年,168年,177年,185年,204年]。此外,交界VE-cadherin正好的损失在活的有机体内特定的酪氨酸的钙粘着蛋白去磷酸化(90年,91年),无法使磷酸化Y685导致血管生成增加泄漏组织(92年]。这些观察提出了这样的可能性,那就是交叉的组件可能需要周期的磷酸化和去磷酸化使relocalization不同膜隔间,粘着斑的情况是营业额(249年,250年]。在这种情况下,动态变化的分子钙粘着蛋白磷酸化可能允许瞬态绑定适配器。内皮间隙形成可以配合一代所谓的焦点,粘合连接处并且招募vinculin链接钙粘蛋白和连环蛋白径向肌动蛋白纤维(149年),这一过程可能不需要本身的差距的形成,但对支持细胞粘附的恢复。然而,目前尚不清楚vinculin协会或任何其他支架蛋白在这种情况下需要一个粘合连接处并且VE-cadherin和/或连环蛋白磷酸化的变化。
的潜在机制,突出它的简单性和逻辑是VE-cadherin协会的规定由微分连环蛋白磷酸化事件。的著名角色p120防止VE-cadherin内吞作用[3,125年,126年,128年,129年]的无能phosphomimetic Y658E VE-cadherin突变绑定p120 [139年,140年VE-cadherin磷酸化)支持模型驱动的损失p120绑定和内吞作用,导致细胞粘附的影响。然而,大多数可用的生化数据不验证这个模型甚至强烈建议与戏剧性的变化在VE-cadherin磷酸化和/或损失的障碍函数至少大部分VE-cadherin仍然绑定到p120 [74年,90年,94年,143年,145年,146年]。我们应该无视这种潜在机制?我们也不应该。内皮间隙的形成需要的损失只有一小部分交界VE-cadherin / p120复合物,这将使生化方法不够敏感检测交界蛋白质协会小而重要的变化。另外,一些刺激可能需要失去p120绑定和VE-cadherin内吞作用,而另一些人可能通过离解行为之间的桥梁β连环蛋白,α连环蛋白和肌动蛋白细胞骨架。此外,它是可能的,一些磷酸化VE-cadherin事件可能是一个结果,而不是原因,连环蛋白分离。与多个粘合连接处并且酪氨酸激酶(46,65年,66年,93年,135年,169年,172年和磷酸酶119年,145年,184年,201年,204年,205年,213年),p120和β连环蛋白可以绑定和招募他们结或者,或者,争夺一个结合位点和取代激酶和磷酸酶绑定VE-cadherin,整体效果的调制交界phosphotyrosine(图的水平4)。确切的时间关系的一组事件导致细胞粘附的破坏仍在研究。最后,张力变化交界处由于ρgtpase catenin-regulated活动(251年]不仅可能影响VE-cadherin的能力转换mechanosensory刺激(68年),但也有可能调节RTK信号和VE-cadherin磷酸化的水平,和附着力。事实上,药物抑制MLCK [147年),岩(148年,149年),或肌凝蛋白II [149年]预防焦点的形成,粘合连接处并且证明actomyosin-mediated张力交界重构的内皮细胞是至关重要的。使用新的显微镜技术包括使用小说FRET-based张力传感器(68年,252年,253年)激酶以及GTPase生物传感器(254年- - - - - -257年]无疑将使我们能够评估局部和暂时的有限的程度上改变交界协会在细胞间粘附形成差距的具体地点是影响。结合这些分析与新开发phosphospecific与大大提高表位特异性抗体(81年,89年- - - - - -91年)将使我们能够在时间和空间相关的水平VE-cadherin与连环蛋白磷酸化与协会edemagenic刺激内皮细胞反应,白细胞血球渗出。
利益冲突
作者宣称没有利益冲突有关的出版。
承认
这项研究是由美国心脏协会的资助(SDG13SDG17100110)。