文摘

Rett综合症(RTT)是一个毁灭性的神经发育障碍,300倍增加心脏性猝死的风险。亚临床心肌双功能障碍已经被我们组最近在RTT报道,发现与一个增强氧化应激(OS)的地位。在这里,我们测试了天然抗氧化剂的影响ω3多不饱和脂肪酸(ω3欧米)超声心动图参数和系统操作系统标记在人口的RTT患者典型的临床形式。总共有66 RTT女孩进行了评估,其中半数在接受治疗12个月的膳食补充剂ω3欧米高剂量(二十二碳六烯酸~ 71.9±13.9毫克/公斤合著。/day plus eicosapentaenoic acid ~115.5 ± 22.4 mg/kg b.w./day) versus the remaining half untreated population. Echocardiographic systolic longitudinal parameters of both ventricles, but not biventricular diastolic measures, improved followingω补充3欧,并行操作系统标记水平下降。检查超声心动图参数无显著变化也在操作系统标记检测在未经处理的RTT人口。我们的数据表明,ω3欧米能够改善RTT的双心肌收缩功能,这功能得到部分介导通过氧化还原平衡的监管。

1。介绍

Rett综合症(RTT)是由基因决定的,神经发育障碍,自闭症特征(1,2]。虽然相对罕见,RTT代表第二个最常见的原因严重智力的残疾的女性。到目前为止,这种疾病被划分为一个典型的形式和三个主要的非典型变异,也就是说,保存演讲,早期癫痫,先天性。

在95%的情况下,RTT所致新创在x染色体基因突变编码MeCP2,蛋白质被几个转录激活或抑制基因(3,4]。

积累的证据表明,RTT,很长一段时间被认为是完全一种大脑的疾病,实际上是一种全身性疾病与参与的几个器官除了大脑,包括自主神经系统,肺,骨,和心脏5- - - - - -8]。女孩受到典型的RTT显示300倍增加心源性猝死的风险比一般人群(大约26%的死亡都是突然和原因不明的9协会]),尽管一个满意的解释仍然失踪。缺乏证据的先天性心脏病的患病率增加,几个作者的注意力都集中在心脏神经异常和节律异常的存在。特别是,长QT间隔,一个指标的复极化异常和心脏性猝死的危险因素(10近20%的患者),据报道Rett综合症(9,11- - - - - -13]。异常持续钠电流在心肌细胞已报告老鼠和发现规范化channel-blocking抗癫痫药苯妥英钠,强烈建议一个脑心链接作为一个可能的解释在RTT[突然死亡的风险增加13]。然而,我们最近观察亚临床心肌双功能障碍的一系列大型的典型和非典型RTT病人可能添加新的视角心脏介入这种神经发育疾病(14]。

增强氧化应激(OS)和的证据,特别是,脂质过氧化作用已经由我们组建立在患者的血液样本RTT和最近证实原发性皮肤成纤维细胞培养15- - - - - -21]。然而,分子通路连接MeCP2基因突变操作系统错乱仍有待探讨,特别是是否之间的关系的性质MeCP2基因突变和异常氧化还原体内平衡是因果或相关性目前仍不清楚22]。

同时,实验模型表明,操作系统是有害的对心肌功能(23,24]。因此,我们推测,操作系统可能会扮演一个角色在RTT的心肌功能障碍的病人。

ω- 3多不饱和脂肪酸(3多不饱和脂肪酸,与广泛的)是天然的分子生理功能在多个组织包括心脏。特别是,ω3欧米能够影响无数的分子途径,包括物理和化学性质的改变细胞膜的直接互动和调制的膜通道和蛋白质,通过核受体和转录因子调控基因表达,类二十烷酸的变化资料,和转换的ω3生物活性代谢物(欧米伽25]。

3欧米获得了越来越多的关注,预防心血管疾病,虽然他们的生物效应和分子机制是高度争论25]。

在以前的研究中,我们表明,补充ω3欧适度减少临床严重程度和水平显著降低了几个OS的生物标志物在RTT病人的血17,19,26]。

本研究的目的是评估12个月的膳食补充大剂量的影响ω3欧RTT-related亚临床心肌功能障碍。

2。方法

2.1。病人

在这项研究中,共计66 RTT患者(平均年龄年)与典型的表示和证明MeCP2突变为(表1)[27]。RTT诊断和包含/排除标准是基于最近修订的RTT命名一致(28,29日]。RTT临床严重程度评估使用临床严重程度评分(CSS),验证临床评级RTT专门设计,基于13个人顺序分类测量在RTT[临床特征普遍28]。所有的病人都承认孩子神经单元,大学医院Azienda Ospedaliera大学联盟Senese Joussef哈耶克博士(头)。在病人的血液抽样组在住院期间执行常规随访研究。抽样的对照组进行常规健康检查期间,体育,或周期期间获取的献血临床检查。批准的研究机构审查委员会和知情同意都来自父母或合法的导师招收患者。

2.2。研究设计

实验设计是单中心、单盲、随机。病人被随机分配在录取(补充治疗,平均年龄在时间为零:年;如果不治疗,平均年龄在时刻0:年),口服补充ω3欧米油为12个月或没有治疗。

管理ω3欧的鱼油(挪威特隆赫姆鱼油作为挪威、产品编号HO320-6;意大利进口:Transforma意大利,Forli意大利;意大利外交部注册码:43863 - y)每天两次剂量的5毫升,对应于二十二碳六烯酸(DHA)毫克/公斤合著。/day and eicosapentaenoic acid (EPA)毫克/公斤合著。/day, with a totalω欧米伽3b.w.毫克/公斤/天。使用EPA + DHA RTT险伦理委员会批准。

所有的科目,包括患者,检查在这项研究中遵循一个标准的地中海饮食。

2.3。超声心动图

研究了使用商用超声心动图设备(飞利浦IE 33 2009年愿景,qLAB 7.0软件;5和8 MHz换能器)如前所报道(14]。简单地说,二维右和左室量化(地区和卷),左心室射血分数(辛普森的方法),和肺动脉收缩压(PASP)估计。二尖瓣流速度(波,波,比率)记录使用脉冲波多普勒(PW)二尖瓣。左和右心室纵向收缩功能的评价是由(a)飞机二尖瓣环收缩期偏移(MAPSE)和三尖瓣环平面收缩偏差(TAPSE),使用M-mode, (b)收缩压()和舒张早期()峰值速度,使用PW组织多普勒成像(TDI)的外侧(lat)和隔膜(sep)二尖瓣环三尖环的左心室(LV)和右心室(RV) four-chamber顶端的观点。的比率确定代孕的LV填充压力。

为了减少operator-dependent偏见,所有措施都由两家运营商,盲法临床和治疗RTT的数据组。

2.4。血液采样

血液样本在所有科目进行大约8.00点后一夜之间迅速。为ω欧米伽3组治疗,血液抽样进行补充和天开始的前一天结束后所选的12个月里。

血液收集肝素化管,所有操作后2小时内进行收集。血样离心机在2400 g在室温下15分钟。穷人血小板血浆得救了,淡黄色的外套被愿望移除。红细胞与生理溶液洗两次,resuspended振铃器解决方案(125毫米氯化钠,氯化钾5毫米,1毫米出来葡萄糖,消息灵通的32毫米,5毫米,1毫米CaC),pH值7.4 50%(卷/期)暂停,然后用于测定红细胞非蛋白结合的铁(NPBI)。

等离子体用于自由isoprostanes (F₂-isoprostanes F₂-IsoPs, F₄-neuroprostanes F₄-NeuroPs), 4-hydroxynonenal蛋白加合物(4-HNE PAs)和NPBI决定。对于所有isoprostane决定,丁羟甲苯(二叔丁基对甲酚)(90μ米)被添加到等离子体是一种抗氧化剂和储存在氮气−70°C到分析。

2.5。Intraerythrocyte和等离子NPBI

NPBI氧化剂因素,是与缺氧有关,血红蛋白氧化,释放和随后的血红素铁30.]。作为desferrioxamine Intraerythrocyte和等离子NPBI测定的高效液相色谱(柴油)铁复杂,正如前面报道(15]。

2.6。等离子体Isoprostanes

Isoprostanes被认为是黄金标准的操作系统在活的有机体内评价(31日,32]。具体地说,F₂-IsoPs花生四烯酸氧化的最终产品,丰富的多不饱和脂肪酸在大脑的灰色和白色物质。F₄-NeuroPs二十二碳六烯酸的最终产品,丰富的神经膜。等离子体F₂-IsoPs和F₄-NeuroPs测定气相色谱法/负离子化学电离串联质谱(GC / NICI-MS / MS)分析后固相萃取和衍生化步骤33,34]。

F₂-IsoPs,测量离子产品离子m / z 299和m / z 303来源于(m - 181)⁻前体离子(m / z 569和m / z 573)从15 -生产-IsoPs和PGF_2α- d₄分别为(34]。F₄-NeuroPs,测量离子产品离子m / z 323和m / z 303来源于(m - 181)⁻前体离子(m / z 593和m / z 573)从氧化DHA和PGF生产_2α- d₄分别为(19]。

2.7。等离子体4-HNE不是

等离子4-hydroxynonenal蛋白加合物(4-HNE PAs)标记的蛋白质氧化是由于醛结合脂质过氧化来源(35]。免疫印迹协议进行如前所述[18]。

血浆蛋白(30μg蛋白)解决在4 - 20% sds - page凝胶(瑞士Lonza Group Ltd .)和转移到hybond ECL硝化纤维素膜(通用电气医疗集团欧洲GmbH,意大利米兰)。阻塞后3%脱脂牛奶(BioRad、大力神、钙、美国),一夜之间,细胞膜被孵化在4°C山羊多克隆抗体anti-4-HNE加合物(代码AB5605;美国密理博公司Billerica的)。洗后在TBS渐变和孵化与特定的二级抗体(鼠标抗体辣根peroxidase-conjugated,圣克鲁斯生物技术公司,CA,美国)1 h RT,细胞膜孵化了ECL试剂(BioRad、大力神、钙、美国)1分钟。乐队用放射自显影法。

量化重要的乐队是由数字化扫描amersham hyperfilm发射极耦合逻辑(通用电气医疗集团欧洲GmbH,意大利米兰)和测量免疫印迹图像密度与ImageJ软件。

2.8。统计分析

所有变量进行正态分布(D 'Agostino-Pearson测试)。使用独立样本组间差异进行评估以及(连续的正态分布数据),Mann-Whitney秩和检验(连续非正规的分布式数据),和克鲁斯卡尔-沃利斯检验。变量之间的关联被非参数单变量回归分析测试。双尾小于0.05的值被认为是重要的。12.1.4 MedCalc版本统计软件包(MedCalc软件、Mariakerke比利时)使用。

3所示。结果

3.1。12个月的效果ω3 PUFA补充心肌功能

所有的病人的ω3欧的研究完成了12个月的补充,没有观察到的副作用。表型严重、生物特征数据和骨密度估计以及血清25-OH维生素D水平被发现之间的可比性ω(表3 PUFAs-supplemented unsupplemented RTT的细胞亚群1)[27]。

后ω3 (EPA和DHA)补充欧米伽,显著改善两心室收缩期纵向参数观察(图1PASP)以及增加。另一方面,超声心动图参数无显著变化检测在未经处理的RTT的病人。

3.2。操作系统标记

12个月后ω3补充欧米伽,NPBI,血浆F₂-IsoPs, F₄-NeuroPs显著降低,而时间0′值(数据2(一个)- - - - - -2 (d))。没有显著变化观察4-HNE不是值(图2 (e))。显著差异已经观察到治疗组在6个月时间等离子NPBI intraerythrocyte NPBI,和血浆F₂-IsoPs。

操作系统标记和心肌功能变量的相关矩阵在Rett综合症ω3欧补充报告在表2。等离子体F₂-IsoPs和F₄-NeuroPs和4-HNE不被发现是左心室收缩功能逆相关参数。

另一方面,没有显著的改变操作系统标记检测在未经处理的RTT病人(数据未显示)。

在3 PUFAs-supplemented组、临床严重程度下降到30.1%和25.5在6 - 12个月,分别(CSS在时刻0:;CSS在时间6个月:;CSS时12个月:;方差分析;成对比较时间0 > = 6个月时间12个月)。相反,在临床严重程度无显著差异在unsupplemented观察组患者(CSS在时刻0:;CSS时12个月:;)。显著改善观察领域的关注,呼吸异常,肌肉紧张性,步行,自主功能障碍和躯体的增长。

4所示。讨论

第一次我们的研究结果表明,亚临床心肌功能障碍中观察到典型的RTT,至少部分,由1年期高剂量获救ω3欧米伽膳食补充。具体地说,ω3欧出现逆转所有检查纵向收缩参数(MAPSE,,TAPSE,左和右心室的)。此外,收缩期心肌功能的改善被发现与明显减少操作系统所确定的标记在等离子体中,而舒张功能无显著变化检测ω3 PUFAs-treated病人。总的来说,这些发现表明,操作系统可能发挥关键作用的RTT心肌的收缩性能,它可以至少部分获救ω3欧米伽膳食补充。

到目前为止,在潜在的分子机制ω3欧的行动有膜结构和基因表达的变化,直接与离子通道相互作用,改变类二十烷酸生物合成(36]。特别是,EPA和DHA已报告与花生四烯酸转化的细胞色素P450酶,从而导致形成的替代,生理上活跃,代谢产物(37)这可能调解他们的一些有利影响(38]。

我们当前的工作假说的有利影响ω3欧的RTT RTT isoprostanes水平不仅仅是增加欧米伽的过氧化反应前体的影响后,袭击激进的氧物种(ROS),而是一个潜在的影响调节异常的分子靶点ω3欧。与预期相反,假定的脂肪酸不进一步氧化,而实际的内生IsoPs生产减少(“脂肪酸悖论”)与改进的临床疾病严重程度39]。

可以想象,过量的过氧化反应结束的产品ω6和ω3欧会意味着一个过度消费这些欧米伽的细胞膜,从而铺平了道路提供一个新的视角RTT的营养的视野。RTT女孩似乎长期遭受氧化,欧米ω3(即。,DHA/EPA) orω6(即。,AA, AdA), but, at the same time, benefit fromω3欧的补充,它可以推断,这些患者需要ω3欧替换由于持续欧米氧化在慢性系统上下文。另一方面,它也可能在RTT,内生欧米,为自己的本性,更容易操作系统与外生的。因此,管理欧可能被视为抵消这种内在的缺陷。

这还需要进一步的研究来探索这一点,尽管最近的报告表明,很有趣ω3欧补充鱼油,与非酒精性脂肪肝小鼠能够防止肝脂质积累和改善脂质代谢不会引起氧化应激(40]。本报告提供进一步支持我们的“脂肪酸悖论”理论推广到不同的脂质代谢异常条件,遗传或环境。

进一步研究表明,胆固醇合成的关键新作品受损在RTT[突变小鼠模型40]。后者工作强烈表明先天性脂质代谢错误可能发挥作用在RTT发病机制,并建议使用他汀类药物作为一种潜在有价值的替代治疗人类的疾病。符合这一假说,我们曾描述了一种不为人知的高胆固醇血症女孩综合症的影响(41),指出异常胆固醇合成的可能性与角鲨烯可能局部块分解代谢由于共存的杂合突变的CYP24A1(人类* 126065)或TM7SF2(人类* 603414),分别编码蛋白质CP24A和ERG24 [18]。

此外,最近的一个有前途的研究表明,有益的行为ω3欧(或者他们的次级代谢物)可能与识别的调制在RTT亚临床炎症状态,当然一个点需要进一步探索,但拟合的已知的抗炎作用ω3(欧米伽26,42]。

另一方面,一个可能的解释不完整的救援的RTT的心肌功能障碍可能驻留在这一事实MeCP2似乎是参与细胞分化和成熟43]。因此,MeCP2蛋白质之间的关系需要进一步评估和心脏疾病的实验模型。

5。结论

我们的数据表明,ω3欧米能够改善心肌收缩功能观察到典型的亚临床双RTT和这个功能获得部分介导通过氧化还原平衡的监管。

利益冲突

作者宣称没有利益冲突有关的出版。

确认

目前的研究项目已经资助的托斯卡纳地区[2009年也免不了敬礼,“抗氧化剂(ω3多不饱和脂肪酸,硫辛酸)补充Rett综合症:一种新型治疗方法”),意大利。作者感谢支持Associazione Italiana Rett, (A.I.R.,President Mrs. Lucia Dovigo), the Round Table 41 Club of Siena and Lucia Galluzzi from the Pharmaceutical Unit (Galenic Pharmacy) of the Azienda Ospedaliera Senese. Their thanks also go to the Norwegian Fish Oil (Trondheim, Norway) and Dr. Ezio Toni (Transforma AS Italia, Forlì, Italy) for helpful technical information on the fish oil products and access to quality control certificates. The authors sincerely thank Drs. Pierluigi Tosi, Silvia Briani, and Roberta Croci from the Administrative Direction of the Azienda Ospedaliera Universitaria Senese (AOUS) for continued support to their studies and the AOUS administration for prior purchasing of the gas spectrometry instrumentation. They are very grateful to Professor Daniel C. Tarquinio (Dept. of Neurology, Boston Children’s Hospital, Boston, MA, USA) for giving them the access to the updated RTT-specific growth charts. They also would like to thank the Medical Genetics Unit from the University of Siena (Head Professor Alessandra Renieri) for theMECP2基因突变分析,卡拉Caffarelli博士和教授斯特凡诺Gonnelli定量超声决定,和玛丽亚比阿特丽斯博士弗兰在Rett病人血清25-OH-D决定(内科1,锡耶纳大学和险,锡耶纳,意大利)。作者感谢罗伯特Faleri锡耶纳大学医学中心图书馆的持续帮助与文献研究。他们衷心地感谢专业歌手Matteo Setti (http://www.matteosetti.com/)在氧化应激引发了科学研究的意外收获,但女孩和autisticc孩子以及他的许多慈善音乐会和继续研究的科学方面的兴趣。他们把这项研究但女孩和他们的家人。西尔维亚马费伊和克劳迪奥·德·菲利斯co-first作者;罗伯特·Favilli和Joussef哈耶克co-last作者。