文摘
2009年,一个新的甲型流感(H1N1)病毒影响了世界各地的许多人。迫切需要寻找生物标记区分甲型流感(H1N1) pdm09和季节性流感病毒。我们调查这些可能的生物标志物的肺癌死亡病例的确诊甲型流感(H1N1) pdm09。细胞因子(炎症和抗炎)和细胞标记(巨噬细胞和淋巴细胞亚群标记)分析了肺组织甲型流感(H1N1) pdm09和季节性流感病毒。高水平的IL-17,干扰素-γ和肿瘤坏死因子-α阳性细胞在肺组织相同的甲型流感(H1N1) pdm09和季节性病例相比,健康的肺组织()。增加细胞il - 4 +, CD4 +和CD14 +细胞也发现高水平的甲型流感(H1N1) pdm09和季节性流感病毒()。低水平的CD206 +细胞(或者激活的标志在肺巨噬细胞标记)中发现了甲型流感(H1N1) pdm09与季节性流感病毒(相比),CD206 / CD14 +细胞的比例高出2.5倍季节性和noninfluenza组与甲型流感(H1N1) pdm09 ()。总之,CD206 +细胞区分甲型流感(H1N1) pdm09和季节性流感病毒死亡病例的肺组织。
1。介绍
流感是一种病毒性传染病全球公认的一个主要公共卫生问题导致高发病率和死亡率。季节性流感导致超过200000人住院,在美国每年大约有36000人死亡在秋季和冬季(1]。新流感病毒暴发每8-41年预计,类似于甲型流感(H1N1) pdm09 (2009)。这些疫情期间,超过50%的人口被感染的高传播性病毒。重症肺炎死亡病例的频繁甲型流感(H1N1) pdm09 [1]和弥漫性肺泡损伤(爸爸)在83%的死亡病例的报道甲型流感(H1N1) pdm09 [2]。流感病毒感染的免疫反应被广泛研究中度或严重感染患者的血液样本探索严重性标记。先前的研究显示高水平的血清或血浆炎性细胞因子,命名为“细胞因子风暴”或hypercytokinemia [3- - - - - -5]。这加剧了免疫系统的激活可能导致急性肺损伤,导致较高的死亡病例。早期免疫反应甲型流感(H1N1) pdm09从住院病人血清是Th1和Th17细胞因子、细胞免疫反应和炎症的重要中介(6]。最近,高水平的促炎细胞因子和趋化因子的肺组织中发现了甲型流感(H1N1) pdm09死亡病例;这是一些报告在探索肺免疫环境7]。
然而,对其他细胞群,肺组织淋巴细胞和巨噬细胞的死亡病例,以及细胞因子的表达。在目前的研究中,我们分析了病毒载量,组织损伤,细胞因子反应,T淋巴细胞和巨噬细胞标记在肺组织中死亡病例的甲型流感(H1N1) pdm09和季节性流感。我们的结果提出建议,没有甲型流感(H1N1) pdm09差异和季节性流感病毒载量,细胞因子反应,或T淋巴细胞标记但CD206数字区分甲型流感(H1N1) pdm09和季节性流感。
2。材料和方法
2.1。病人
对肺组织进行了回顾性研究从72年涉嫌甲型流感死亡病例感染和临死前的诊断肺炎;他们两个有一个积极的PCR大流行性流感。这些病例是注册从2005年8月到2009年12月。五个未感染样本包含在本研究;他们死亡病例的颈动脉动脉瘤患者,黑色素瘤、宫颈和肾脏和肝脏癌症,这些患者的肺组织没有炎症(图1)。本研究的生物伦理学委员会批准在新莱昂州大学医学院(UANL)号码10 - 004。
2.2。病毒检测
总RNA隔绝formaldehyde-fixed石蜡包埋(FFPE)肺组织。八10μm幻灯片被放置在一个超小型电子管RNases-free,并使用RecoverAll总RNA提取核酸隔离设备(Ambion、奥斯汀、TX)根据制造商的指示。最后,本文用分光光度法测定RNA在每个样品的浓度。甲型流感(季节性或(H1N1) pdm09)样本中检测到使用CDC的存在协议或PrimerDesign genesig工具包人类大流行株猪H1N1流感(H1N1猪)(引物设计、英国)制造商的协议。PrimerDesign genesig工具包人类大流行株猪H1N1流感(H1N1猪)也被用来量化的病毒载量如下:55°C 10分钟,95°C 8分钟,和50周期在95°C的变性10秒,退火,在60年代60°C扩展。与2反应进行μ总RNA的L (400 ng)提取和才华横溢的三世超高速中存在主混合(安捷伦科技,拉霍亚,CA)在CFX96 thermocycler (Bio-Rad大力神,CA)。内部控制(ACTB)包含在实时中存在在每个样本来验证RNA隔离和存在在最好的条件下进行。RNA浓度范围从145.8μ1881.2 g / mLμg / mL;与此同时,RNA纯度在260/280 nm从1.72到1.99。内部控制放大在所有样本分析。
2.3。组织病理学分析
使用标准的组织学协议样本处理。组织病理学评价是组织完成的部分从每个样本与苏木精和伊红染色())和肺损伤评分是注册如前所述8]。两个盲专家病理学家十个不同的领域的分析每个样本在40 x和得分的平均值得到从每个样本。
2.4。原位检测细胞因子和细胞标记
石蜡包埋块肺癌死亡病例的甲型流感患者和未感染组5 - 7μ米的部分。准备的部分免疫组织化学(包含IHC)使用标准协议。一夜之间,幻灯片被孵化在4°C主要抗体人类细胞因子(il - 4、il - 10 IL-17,干扰素-γ和肿瘤坏死因子-α)或巨噬细胞(巨噬细胞CD14用于一般人口标记和CD206或者激活巨噬细胞“麦”)和淋巴细胞数量(用于辅助T细胞CD4, CD8 T细胞毒性细胞,和FOXP3 T监管)标记;抗体呈现在表的列表1。此后,与另一个生物素化的二次抗体,样本在1 h rt,孵化的特定抗体绑定反应放大了孵化与ABC开发系统(向量实验室,伯林盖姆,CA)在30分钟在rt,放大后一步,幻灯片再次清洗和孵化3分钟的发色体衬底合3 3-diaminobenzidine (DAB)(向量实验室,伯林盖姆,CA)。最后,幻灯片是用苏木精复染色和安装使用VectaMount(向量实验室,伯林盖姆,CA)。总阳性细胞数在10个不同的观察领域40 x。然后,阳性细胞的平均每个样本计算每个字段。
2.5。统计分析
克鲁斯卡尔-沃利斯检验是用于统计比较多个数据组。的Mann-Whitney双尾未配对以及用于统计比较的两个数据。计算使用GraphPad棱镜进行5.0版本Windows(美国圣地亚哥,CA)。值< 0.05或更少被认为是重要的。
3所示。结果与讨论
3.1。学习小组和病毒检测
分析了72例致命病例中存在的季节性和甲型流感(H1N1) pdm09。10例甲型流感患者检测到存在;四人甲型流感(H1N1) pdm09。女性代表25%的死亡病例甲型流感(H1N1) pdm09, 83%的季节性流感和未感染组的20%。年龄中位数是年(范围、23-37年)甲型流感(H1N1) pdm09集团年(范围,24 - 72年)在季节性流感的一个群体,和年(范围、30 - 65年)未感染组。吸烟是最频繁的疾病死亡病例由甲型流感病毒其次是肥胖和糖尿病在同一百分比;见表2。吸烟,糖尿病和肥胖的风险因素之前报道流感病毒易感性(9,10]。最近的研究显示了强有力的证据,香烟烟雾提取物抑制rig - i,干扰素-β,IP-10;他们所有人参与先天免疫反应生产流感在人类肺癌和流感易感性(这可能是参与11]。
病毒RNA的加载范围从2到138册;M1或N1记录标准曲线用于定量检测甲型流感(H1N1) pdm09和季节性流感病毒,分别。最近,研究人员发现流感病毒RNA从尸检FFPE组织获得了使用实时rt - pcr (7]。在我们的研究中,我们还发现流感病毒RNA使用类似FFPE组织总RNA提取设备和协议获得从死亡病例尸检甲型流感感染的嫌疑。这些发现打开一个新的方法来研究流感病毒疑似样本,以及发病机理和感染生物标记在人类的肺部组织。研究报告在外周血病毒载量,单核细胞,或从流感病毒感染患者肺部吸入物;然而,没有一个包括肺组织(12,13]。
3.2。肺损伤评分不是两个不同的甲型流感(H1N1) pdm09和季节性流感病毒
肺损伤存在于流感感染(14),和类似的结果中发现了流感组数据的可视化2 (b)- - - - - -2 (c)。我们质疑如果肺损伤水平可能区分甲型流感(H1N1) pdm09和季节性流感病毒感染。出血、间质浸润和血管周的总量进行了分析研究小组完成损伤分数。高肺损伤评分发现甲型流感(H1N1) pdm09和季节性流感病毒;样本与未感染肺();然而,流感组之间没有差异被发现()(图2 (d))。
(一)
(b)
(c)
(d)
3.3。肺组织炎性细胞因子检测
高水平的细胞因子的生产已经在严重病例血清之前报道甲型流感(11,12];如果类似的发现我们的问题是发生在肺组织甲型流感死亡病例的如果它可能在流感类似的组织。我们评估了炎症和抗炎细胞因子水平。高水平的IL-17,干扰素-γ和肿瘤坏死因子-α被发现在流感样本相比未感染肺(,,,分别地。,Kruskal-Wallis test). No differences were found between those cytokines levels between influenza A (H1N1)pdm09 and seasonal influenza A virus samples ()(图3)。IL-17和IL-17RA在急性肺损伤中的作用,甲型流感病毒引起的发病率和死亡率已报道(2,13]。在这项研究中,IL-17A流感组升高,这些数据表明,IL-17由本地和招募细胞释放到肺可能导致急性肺损伤和病人的结果。在巴西,研究人员发现强烈的表达干扰素-γ和肿瘤坏死因子-α肺癌死亡病例的甲型流感(H1N1) pdm09 [15]。同意我们的结果,高水平的肿瘤坏死因子-α血液在三个死亡病例中发现了甲型流感(H1N1) pdm09;同样的现象反映在肺组织(15]。IL-17干扰素-γ和肿瘤坏死因子-α高水平的强烈的炎症反应是一个确凿的证据从流感感染患者肺;所有这些发现可能与致命的结果。
相关细胞因子il - 4是一个麦和Th2反应(16];在我们的研究中,我们发现,细胞因子升高甲型流感(H1N1) pdm09和季节性流感病毒(克鲁斯卡尔-沃利斯检验)(图3)。类似的结果在等离子体的患者被发现感染了甲型流感(H1N1) pdm09和季节性流感(17,18]。这些结果的差异可能与使用样本(血清、血浆和肺组织)和样本大小。此外,肺组织环境反映了真实环境的流感感染。il - 10是一种免疫调节细胞因子,会使炎症反应(19];然而,没有发现差异在il - 10水平组包括在这项研究(克鲁斯卡尔-沃利斯检验)(图3)。我们的研究结果表明,强烈的炎症反应并不是由il - 10在肺流感患者和可能导致肺损伤和致命的结果。
3.4。CD4 +和CD14 +招募病人的肺组织与甲型流感(H1N1) pdm09和季节性流感病毒
虽然招募中性粒细胞在肺在流感感染被描述,其他报告发现淋巴细胞的人口(20.]。我们的问题如果有差异在流感组淋巴细胞和巨噬细胞亚群号码,为了回答这个问题,我们分析了巨噬细胞和淋巴细胞标记研究团体。CD8 +干扰素-γ+淋巴细胞保护涉及大流行性流感症状(21]。没有差异被发现CD8 +细胞死亡病例数量的甲型流感(H1N1) pdm09,季节性流感病毒和未感染样本(克鲁斯卡尔-沃利斯检验)(图4)。这些发现可能解释部分患者死于流感感染的原因。CD4 (+) CD25 (+) Foxp3 +调节性T (Treg)淋巴细胞数量能够产生il - 10 (22];然而,在这项研究中,il - 10水平没有差异流感和未感染组(克鲁斯卡尔-沃利斯检验)。我们评估Foxp3标记从流感患者和肺组织没有差异被发现Foxp3标记流感的肺组()(图4)。高水平的外围CD4 (+) CD25 (+) Foxp3 +调节性T (Treg)细胞中发现了甲型流感(H1N1) pdm09 [23),但在我们的研究结果,在肺组织中,这些淋巴细胞数量不增加(图4)。病毒特异性CD4 +淋巴细胞可能在肺组织招募(24];在目前的研究中,高水平的招募CD4 +细胞被发现流感组与未感染组织(克鲁斯卡尔-沃利斯检验),但没有流感死亡病例之间的差异被发现()(图4)。CD4 +淋巴细胞(Th1、Th2和Th17)是干扰素-的生产商γ分别、il - 4和IL-17 [25]。增加CD4 +和高水平的细胞因子在肺的流感患者支持强大的炎症反应,Th1、Th2, TH17可能参与肺损伤。严重的甲型流感(H1N1) pdm09感染患者Th1和Th17 hypercytokinemia血清(6];然而,这项研究表明Th2反应存在于肺一起Th1和Th17。高水平的CD14 +流感死亡病例的肺巨噬细胞被招募组(克鲁斯卡尔-沃利斯检验);但是,没有死亡病例之间的差异被发现甲型流感(H1N1) pdm09和季节性流感病毒()(图4)。一份报告表明,CD14作用有限流感病毒感染的宿主免疫反应;然而,这里CD14 +细胞被招募的肺感染患者表明CD14 +细胞可能产生炎性细胞因子,以这种方式导致组织损伤所描述的Pauligk et al。26]。
3.5。CD206 +细胞分化甲型流感(H1N1) pdm09从季节性流感病毒
肺泡巨噬细胞主要表达一个平方米表型(27];CD206 M2巨噬细胞的表面标志特征,已报道在肺泡巨噬细胞(28]。有趣的是,CD206 +细胞被发现在低水平甲型流感(H1N1) pdm09比季节性流感死亡病例(克鲁斯卡尔-沃利斯检验)(图5)。巨噬细胞M2生产商等细胞因子il - 4 / IL-13或il - 10 / TGFβ;尽管缺乏差异中发现il - 10水平,报告描述,il - 10和转化生长因子β是必要的,能够提高小鼠的结果(29日]。损耗的肺泡巨噬细胞可以导致一个加剧炎症过程和认识到的主要机制是这一过程的缺乏控制30.]。
(一)
(b)
(c)
(d)
(e)
3.6。失衡的CD206和CD14细胞死亡病例的肺组织中发现了甲型流感(H1N1) pdm09
在不同的研究中,不平衡M1和M2巨噬细胞的数量一直在与预后差相关动物模型(31日]。失衡CD206 +和CD14 +细胞评估评估他们比流感死亡病例的肺。CD206 / CD14 +细胞比率为2.5倍的季节性和未感染组高于甲型流感(H1N1) pdm09 (克鲁斯卡尔-沃利斯检验)(图6)。这些数据表明,没有足够的招募巨噬细胞治疗甲型流感(H1N1) pdm09患者的肺组织,这可能有利于炎症反应和肺损伤。
4所示。结论
在这项研究中,我们首次展示,招募了CD4 +和CD14 +细胞存在于肺组织和许多可能导致肺损伤的细胞因子的生产和结果在甲型流感(H1N1) pdm09和季节性流感死亡病例的病毒。CD206表达只在减少甲型流感(H1N1) pdm09;我们建议,它可能被用来作为潜在的大流行性流感和其他细胞因子生物标记物可能为未来工作治疗甲型流感的严重病例。
利益冲突
作者宣称没有利益冲突有关的出版。
确认
这个项目得到了CONACYT 126595和PAICYT-UANL赠款SA319-10 SA667-11格兰特。海蒂·g·Rodriguez-Ramirez感谢CONACYT研究拨款251547。这些结果海蒂·g·Rodriguez-Ramirez博士论文的一部分。