文摘

Nonneuronal胆碱能系统在维持内稳态中起着主要作用。已经证明,内源性神经乙酰胆碱(ACh)可以发挥抗炎作用,和外源性胆碱能受体激动剂可能会削弱巨噬细胞炎症反应对脂多糖(LPS)刺激激活7 subunit-containing烟碱乙酰胆碱受体(7乙酰胆)。我们假设nonneuronal胆碱能系统存在于巨噬细胞可以调节炎症通过自分泌ACh和表达7细胞乙酰胆。因此,我们探讨LPS连续刺激能否移植nonneuronal胆碱能活性的巨噬细胞和自分泌增加课时能否降低TNF从巨噬细胞释放。结果表明,与有限合伙人RAW264.7细胞孵化20小时,分泌ACh显著减少4 h,然后逐渐增加,伴随着的增强7乙酰表达水平。从RAW264.7细胞肿瘤坏死因子的释放是大大增加4 h和8 h接触有限合伙人;然而,它是抑制20 h。移植胆碱乙酰转移酶通过聊天(聊天)表达基因转染可以提高乙酰胆碱分泌和降低TNF RAW264释放的感染。7细胞。结果表明,LPS刺激可以调节的活动nonneuronal RAW264.7细胞的胆碱能系统。增强自分泌乙酰胆碱生产可以减弱肿瘤坏死因子释放RAW264.7细胞。

1。介绍

乙酰胆碱(ACh),传统上认为仅仅是一种神经递质,在胆碱能神经元合成和释放通过水泡机械响应的生理和药理刺激。徒通过烟碱和毒蕈碱的受体在神经和外围组织。1966年,莫里斯在胎盘和报道合成了乙酰nonneuronal ACh合成的初步描述(1]。随后,越来越多的证据表明,除了神经疼,全身多种nonneuronal细胞类型(如淋巴细胞、巨噬细胞、树突细胞,脂肪细胞,角质细胞,内皮细胞和上皮细胞)也产生和释放乙酰胆碱乙酰转移酶的表达(聊天),乙酰胆碱酯酶(疼痛)和乙酰胆碱受体(乙酰胆碱受体)2- - - - - -9]。1998年,Wessler等人提出了“nonneuronal乙酰胆碱”的概念10]。nonneuronal乙酰胆碱的广泛分布在多个组织或细胞表明ACh及其受体发挥了调节作用在维持体内平衡这些组织或细胞通过自分泌/旁分泌信号通路,或参与一些疾病的严重病态的进展(10- - - - - -13]。

Borovikova et al。14)发现,迷走神经刺激减毒的系统性炎症反应内毒素(脂多糖(LPS))的概念和发展“胆碱能抗炎通路。“这是观察到,迷走神经切断术紧随其后LPS刺激导致更高层次的血清中肿瘤坏死因子(TNF)α与对照组相比收到有限合伙人单独或虚假的迷走神经切断术(15]。这表明,在正常情况下(即。,in the absence of nicotine), the vagus nerve release of acetylcholine at sites of peripheral tissue innervations provides the source of agonist for the nAChR. The nAChR responsible for this effect was pharmacologically identified to be the7 subunit-containing烟碱乙酰胆碱受体(7乙酰)(16),后来被老鼠的研究支持7乙酰亚基基因就被消除了。王等人首次报道,尼古丁乙酰胆碱或预处理的人类外周血单核细胞通过转录后的机制采取行动减少肿瘤坏死因子存在于媒体2小时后刺激与细菌组件脂多糖(LPS) (16,17]。巨噬细胞有完整的胆碱能组件包括哦,聊天,疼痛和乙酰胆。我们想知道如果巨噬细胞自分泌ACh发挥监管作用在维护自己的体内平衡和诱导hyporesponsiveness外源性抗原刺激。

巨噬细胞在接触微量的有限合伙人导致他们成为耐火材料后续有限合伙人的挑战,这一现象称为“内毒素容忍”(18,19]。内毒素耐受的分子机制仍然是难以捉摸的。因为肿瘤坏死因子释放的抑制内毒素宽容的巨噬细胞(20.,21)是类似于巨噬细胞治疗胆碱能受体激动剂(14- - - - - -16,22),因此我们假设巨噬细胞刺激分钟有限合伙人可能调节合成和释放乙酰胆碱7乙酰表达式通过先天nonneuronal胆碱能系统,参与诱导巨噬细胞hyporesponsiveness连续或随后的有限合伙人的挑战。

因此,在这项研究中,我们调查了有限合伙人的挑战是否会影响nonneuronal胆碱能组件RAW264.7细胞(小鼠腹腔巨噬细胞线)和加强RAW264.7细胞自分泌ACh能否改善肿瘤坏死因子释放,使迟钝反应有限合伙人的挑战。

2。材料和方法

2.1。细胞系

RAW264.7细胞从美国购买类型文化集合(写明ATCC矿- 71,马纳萨斯,弗吉尼亚州,美国)和维护在RPMI1640补充10% heat-inactivated的边后卫,2毫米谷氨酰胺和100 U / mL青霉素,和100年g / mL链霉素(美国Gibco,卡尔斯巴德,CA)。细胞培养是维持在37°C, 5%的公司₂的气氛。

2.2。细胞培养和治疗

RAW264.7细胞被播种在12-well组织培养板10⁶每口井的细胞和10%的边后卫在RPMI1640培养过夜。添加有限合伙人或PBS之前,这些细胞被洗了,取而代之的是新鲜的RPMI1640 10%的边后卫。细胞暴露在脂多糖(LPS;内毒素)(大肠杆菌0111年,L4130: B4;σ,圣路易斯,密苏里州,美国)(100 ng / mL) 20 h或PBS(体积等于添加有限合伙人)4 h。收集细胞培养媒体《泰晤士报》表示在图中传说(PBS,有限合伙人4 h,有限合伙人8 h,有限合伙人20 h)和在1500转离心5分钟沉积物细胞碎片。离心机媒体被整除,冻结在−直到ELISA分析80°C。

2.3。决定TNF和课时

TNF和乙酰胆碱分泌到媒体RAW264.7细胞测定酶联免疫吸附试验(ELISA) (Cusabio生物技术,中国)根据制造商的指示。

2.4。在培养基测定疼痛活动

培养基是由方法的疼痛活动报道Ellman et al。23),基于黄色5-thio-2-nitrobenzoate负离子的形成产生5之间的反应,5′-dithiobis——(2-nitrobenzoic酸)(DTNB)和thiocholine AChE-mediated水解后的课时。随后的反应是spectrophotometrically吸光度的增加在412海里。疼痛的活动中被表示为摩尔每毫升。根据试验进行的相应指令分析工具提供的建成生物研究所(中国南京)。

2.5。制备的细胞溶解产物和聊天内容分析

RAW264.7细胞(10⁶/毫升)被播种在6-well组织培养菜(210⁶每一夜之间)和培养细胞,取代了媒介。那么细胞孵化与有限合伙人或PBS为不同时间在37°C和5%的公司₂的气氛。这些细胞被冲洗两次与PBS和与nonenzyme分离细胞分离的解决方案。这些细胞被收集和离心5分钟1500转4°C。这些细胞被洗两次冰冷的PBS和离心机如上所述。上层清液被丢弃和1毫升nondenatured细胞裂解缓冲被添加到每个样品溶解细胞。悬浮液是涡10年代和保存在冰浴20分钟。溶菌产物是离心机在4°C 12000 rpm 15分钟去除细胞碎片,和上层清液用于测定聊天与ELISA和TNF含量。蛋白质的溶解产物的浓度是由bicinchoninic酸(BCA)。使用的试剂制备的细胞溶解产物从Applygen购买技术公司在中国。

2.6。流仪分析7乙酰表达式

的表达的变化7乙酰对RAW264.7细胞被流式细胞术检测(流式细胞仪)。RAW264.7细胞与100 ng / mL LPS刺激4 h, 8 h,和20 h,分别和细胞孵化PBS(体积等于添加有限合伙人)4 h被用作控制。在相应的时间点,PBS的细胞被洗净,与nonenzyme分离细胞分离解决方案,转移到管子。离心5分钟后在4°C 1500 rpm和PBS洗,这些细胞被固定在4%聚甲醛/ PBS 30分钟。然后用PBS这些细胞被洗了三遍,悬浮在0.4毫升PBS。一只老鼠单克隆抗体7乙酰胆(sc - 374284,圣克鲁斯生物技术公司,美国)添加在悬架(1:100),一夜之间在4°C,孵化与PBS接着洗,沾FITC-conjugated山羊anti-mouse免疫球蛋白(H + L)(美国EarthOx)在室温下20分钟。这些细胞被洗2毫升PBS和resuspended 0.4毫升PBS。10日所有流式细胞仪数据进行了分析⁶细胞FACSCalibur四色流式细胞分析仪(BD生物科学)。表面7乙酰表达水平测定的阳性细胞百分比。

2.7。RNA提取、逆转录定量实时聚合酶链反应

确定肿瘤坏死因子、聊天和疼痛mRNA表达水平,总RNA隔绝PBS和LPS-treated RAW264.7细胞使用试剂盒试剂(美国Gibco BRL)根据制造商的指示。提取的RNA质量和数量决定通过测量吸收分光光度计在260/280 nm。进行反转录与2使用上标2 g总RNA逆转录系统(美国英杰公司)根据制造商的建议。Semiquantification mRNA的表达水平是由使用快速实时PCR SYBR绿色大师(美国ABI)和混合StepOne 7500快(美国ABI)。PCR引物不同的目标基因和其产品的长度显示在表1。PCR程序:1 95°C的循环20秒钟,紧随其后的是40 95°C的周期为5秒和60°C,持续30秒。肌动蛋白被用作看家基因规范化目标基因的放大信号。PCR产物的相对含量测定用标准ΔΔCT方法。分离阶段,融化曲线,定量分析的数据进行使用ABI SDS2.1工具软件。

2.8。RAW264.7细胞转染

RAW264.7细胞被播种在12-well组织培养板5×10⁴细胞每好,一夜之间长大RPMI1640补充10%胎牛血清。在第二天,细胞被感染空向量或聊天的构建慢病毒表达载体MOI20根据制造商的协议(GeneChem有限公司,中国)12小时。媒体被丢弃,细胞被洗两次,取而代之的是新鲜的RPMI1640补充10%的边后卫。被培养的72 h后,转染细胞游离和播种在24-well组织在6×10板⁵每口井的细胞和培养20 h。媒体收集确定ACh和ELISA和TNF浓度。细胞溶解、RNA隔离和rt - pcr进行如上所述。转染实验进行了三个独立的时期。

2.9。聊天中原始细胞处理有限合伙人

转染RAW264.7细胞被播种在24-well组织板5×10⁵每口井的细胞和培养过夜。这些细胞被洗了,取而代之的是新鲜的RPMI1640 10%的边后卫,然后处理有限合伙人(100 ng / mL)或PBS为4小时。媒体收集、离心和整除确定TNF和乙酰胆碱分泌。细胞溶解产物和总RNA提取进行如上所述。溶菌产物的TNF含量化验使用ELISA,细胞和肿瘤坏死因子mRNA表达水平量化了实时PCR节中描述2。6。

2.10。统计分析

数据,表示为平均值±标准偏差(SD),分析了从一个两个或三个独立的实验。显著差异进行了评估采用单向方差分析(方差分析)其次是最小显著差(LSD)测试。差异与被认为是具有统计学意义。

3所示。结果

3.1。LPS刺激诱发肿瘤坏死因子的释放和mRNA表达的增强RAW264.7细胞

RAW264.7细胞,来自小鼠巨噬细胞,可以应对内毒素和显示,生产过剩的炎性细胞因子如TNF、il - 1、il - 6和il - 12。当刺激与有限合伙人(100 ng / mL), RAW264.7细胞释放大量的肿瘤坏死因子(图1(一)(图)和调节肿瘤坏死因子mRNA的表达水平1 (b))。然而,肿瘤坏死因子释放的增加与mRNA表达水平不同步:肿瘤坏死因子释放的数量到达顶峰LPS刺激后8小时,随后下降;肿瘤坏死因子mRNA表达水平逐渐提高20 h有限合伙人孵化期间与时间的方式。

3.2。LPS刺激调制ACh生产和调节7乙酰RAW264.7细胞的表达水平

巨噬细胞已经知道之前接触微量内毒素的18 - 20 h可能使他们成为耐火材料后续内毒素挑战,这种现象称为“内毒素宽容。“我们认为先天nonneuronal胆碱能在巨噬细胞可能参与诱导LPS过度刺激的耐受性。所以,我们分析的变化ACh生产及其配体7乙酰表达的原始细胞刺激有限合伙人20 h。我们观察到,在RAW264.7细胞乙酰胆碱分泌明显下降后4 h有限合伙人暴露,然后逐渐增加时间时尚(图2(一个))。7乙酰RAW264.7细胞的表达水平极大地增强了LPS刺激后,一直保持在高水平的时期20 h有限合伙人孵化(图2 (b))。结果表明,乙酰胆碱分泌和增加7乙酰表达与肿瘤坏死因子释放减少当RAW264.7细胞被孵化与LPS 20 h肿瘤坏死因子mRNA表达时尚但是没有关系。

3.3。LPS刺激的效果在溶菌产物的聊天内容,疼痛活动文化上层清液,RAW264.7细胞的信使rna表达水平

哦,聊天(一种酶催化乙酰胆碱合成),疼痛(一种酶催化ACh退化)和乙酰胆碱受体构成一个集成nonneuronal胆碱能系统在RAW264.7细胞。基于改变ACh生产和调节7乙酰表达原始细胞治疗的有限合伙人,我们进一步分析了聊天内容的变化和疼痛活动LPS刺激的原始细胞。一般来说,乙酰胆碱浓度的增加伴随着聊天内容的扩充或疼痛活动的弱点。奇怪的是,我们观察到一个意想不到的现象:聊天内容在原始细胞是极大地增强了在有限合伙人挑战4 h,其次是逐步减少,呈负变化自分泌乙酰胆碱生产。聊天信使rna表达水平在RAW264.7细胞调节20 h LPS刺激。疼痛活动培养基和RAW264.7细胞信使rna表达水平没有显著改变在8 h有限合伙人孵化。但在20 h LPS刺激后,疼痛的活动浮在表面的明显降低,信使rna表达水平升高明显(图3)。

3.4。调节表达使转染慢病毒携带基因聊天的聊天可以促进自分泌乙酰胆碱合成和抑制肿瘤坏死因子释放RAW264.7细胞

探索从RAW264.7细胞自分泌ACh能否改善肿瘤坏死因子释放,我们采用的方法使转染慢病毒携带基因进入聊天RAW264.7细胞的感染细胞overexpressing聊天和高产课时。图中的数据4表明,细胞转染和表达载体聊天(聊天)聊天信使rna和过表达会产生更多的ACh比控制细胞转染空向量(EV)(数据4 (c)和4 (d))。乙酰胆碱生产的转染细胞溶解产物()大大提高;然而,没有显著差异的乙酰胆碱分泌在文化之间的上层清液中细胞和控制细胞聊天。

3.5。增加自分泌ACh RAW264.7细胞抑制肿瘤坏死因子释放,但移植肿瘤坏死因子mRNA的表达

我们下一个观察增加自分泌ACh产量的影响TNF RAW264.7细胞的释放。图5展示了文化上层清液和溶解产物,TNF含量以及肿瘤坏死因子mRNA表达水平聊天向量和空载体转染RAW264.7细胞。有限合伙人的存在与否,TNF在上层清液的数量少聊天转染RAW264.7细胞比控制细胞。然而,很困惑为什么TNF含量溶菌产物和肿瘤坏死因子mRNA表达丰度时增强ACh生产增加聊天超表达RAW264.7细胞(图5 (c))。结果表明,自分泌ACh生产的增加可以抑制肿瘤坏死因子释放而不是减少肿瘤坏死因子mRNA表达和蛋白质合成。

4所示。讨论

目前的研究表明,连续LPS刺激可以调节nonneuronal胆碱能的原始细胞自分泌活动。证明是由乙酰胆碱分泌的变化和调节表达式的胆碱能配体7乙酰LPS刺激小鼠巨噬细胞(RAW264.7细胞)。此外,增加自分泌ACh生产通过上调聊天RAW264.7细胞基因表达可以抑制肿瘤坏死因子释放有限合伙人的存在与否。结果表明,巨噬细胞可以建立适应LPS刺激部分通过先天nonneuronal胆碱能自分泌循环。

动物使用低剂量的内毒素的死亡率明显下降,当重新与一般“致命剂量的内毒素(24,25),这种现象称为“内毒素容忍。“在人类,内毒素耐受了在连续5有限合伙人政府证明了减毒释放促炎细胞因子在第五天,少与白细胞和内皮细胞激活26]。这耐火度有限合伙人被认为是一种适应性,以防止过度刺激持续暴露在有限合伙人(27,28]。不过,显然,现在是脓毒症的促炎的早期阶段,马上又用抗炎反应,迅速的结果处于免疫抑制状态。免疫抑制的关键因素被认为是患者继发感染和增加死亡率的风险(29日- - - - - -31日]。免疫抑制的发展与负反馈调节和所谓的内毒素或微生物宽容。各种机制提出了内毒素宽容。其中的差别是对这些LPS-receptor TLR4 [32),酪氨酸磷酸化的TLR4 [33],降低招聘的适配器蛋白质MyD88 TLR4或抑制MyD88之间的交互和激酶IRAK-1 [34,35]。此外,从转录主管NF-kB形成(p50 / p65)活动为(p50 / p50)与宽容的状态(36]。抑制蛋白质的upregulation(如IRAK-M SOCS-1, SHIP1) (37- - - - - -39和抗炎细胞因子(il - 10和TGF)40微生物刺激)引起的低剂量也参与hyporesponsive状态的生成。最近,LPS-induced的microrna基因重组敦促内毒素耐受的重新评估41]。特蕾西的小组提出,加剧了释放肿瘤坏死因子等促炎细胞因子可以通过传出迷走神经的抑制胆碱能抗炎通路(14,17),进一步证明7乙酰胆是一个重要的组件的抗炎功效[16]。胆碱能抗炎通路的发现不仅提供了一个新的战略目标过度的炎性疾病,但也为探索小说的线索对LPS刺激诱导巨噬细胞耐受的机制。

在这项研究中,我们观察到有哦,7乙酰胆,聊天,和疼痛RAW264.7细胞,构成一个完整的nonneuronal胆碱能系统。乙酰胆碱分泌的上层清液急剧下降,当孵化RAW264.7细胞与LPS 4 h随后时间的方式增加4 h-20 h有限合伙人期间曝光。相比之下,7乙酰表情RAW264.7细胞,胆碱能的一个成员,是调节显著和保持在一个高水平4 h-20 h有限合伙人孵化。相对增加自分泌ACh和调节的表达7乙酰胆可以增强胆碱能活性有限合伙人挑战通过促进互动Ach和RAW264.7细胞7乙酰胆。已被确认,之前曝光的巨噬细胞为12分钟有限合伙人h-29 h可能导致hyporesponsiveness后续有限合伙人的挑战(20.,42];同时内源性乙酰胆碱和外源性胆碱能受体激动剂可以降低炎性细胞因子释放LPS刺激巨噬细胞(14,15,22]。我们推断持续LPS刺激可以移植nonneuronal胆碱能挑战RAW264.7细胞的活动,可能会扮演一个角色在限制影射RAW264.7细胞的过度的炎症。这种负面的反馈监管将有助于恢复体内平衡的细胞。然而,持续的负面反馈的效果在活的有机体内可能是脓毒症介导免疫抑制的机制之一。

生理、合成和降解的ACh取决于之间的平衡协调聊天和疼痛的表情。我们假设乙酰胆碱分泌的变化引起的有限合伙人的差别应该与upregulation聊天表达或对这些疼痛的活动。然而,我们意外发现聊天内容是改变消极自分泌ACh生产期间20 h有限合伙人孵化和疼痛活动期间显然没有改变8 h LPS刺激。有趣的是,在20 h LPS刺激后,中间有协同ACh分泌,聊天内容,和疼痛活动,提出了增加乙酰胆碱释放和减少疼痛的活动浮层,增强RAW264.7细胞溶解产物的聊天内容。疼痛和聊天的水平之间的相关性被Kaufer观察et al。43]。他们发现ACh增加由于强迫游泳应激或acetylcholine-hydrolysing酶的抑制剂疼痛可能导致显著调节疼痛mRNA的表达,以及聊天信使rna的表达下调表达在皮层或矢状corticohippocampal片老鼠。他们的研究结果表明,急性胆碱能刺激促进选择性双向基因的表达调节乙酰胆碱代谢的变化。在目前的研究中,疼痛和聊天的协调监管持续暴露在有限合伙人可以支持平衡ACh RAW264.7细胞合成和降解,因此使细胞适应有限合伙人的挑战。疼痛的表情是复杂和多的监管。Waiskopf等人报道,作为抗抑郁药氟西汀能够拦截LPS-induced减少细胞内疼痛(44]。LPS诱导过度曝光的AChE-targeted微rna - 132 (45,46)和疼痛反义ODN mEN101 [47)也发现了抑制疼痛的表情。的诱导表达疼痛具有双重影响。一方面,压力直接水解乙酰胆碱促进炎症引起的疼痛。另一方面,细胞内疼痛可能与核转录因子交互kappa B-activating胞内受体激活C激酶1参加抗炎(44]。此外,诱发疼痛可以选择性地通过其非催化的特性导致细胞凋亡(48,49]。治疗药物因此可以针对疼痛的蛋白质,其编码mRNA转录,或监管机构,开设新场馆治疗干扰免疫系统疾病。

肿瘤坏死因子是一个有效的促炎细胞因子诱导的有限合伙人的挑战[50),以及最有可能的最佳标志内毒素耐受后,评估其极大地降低了生产一个有限合伙人的挑战在宽容的动物和巨噬细胞51,52]。我们检查了TNF生产的动力学和信使rna表达水平有限合伙人RAW264.7细胞治疗。在期间发现,20 h有限合伙人,肿瘤坏死因子mRNA表达水平逐渐增加时间的方式。然而,肿瘤坏死因子释放的数量大大提高4 h和到达最大8 h,紧随其后的是降低LPS刺激后在20 h。肿瘤坏死因子mRNA表达的增加并没有同步与肿瘤坏死因子的释放。由于胆碱能抗炎通路抑制TNF表达在转录后的级别(14,52),我们推断削弱肿瘤坏死因子释放20 h (LPS刺激与内在释放和自分泌增加7乙酰表达式。Nahid等人也报告说,在上层清液培养LPS-stimulated THP-1细胞,肿瘤坏死因子开始出现在2 h和达到最大水平4 h的刺激之后,逐渐开始下降8 h。他们发现,肿瘤坏死因子逐渐增加到4 h,然后减少暗示mir - 146 a的负相关进展(41]。Hamano等人发现,尼古丁抑制CD14表达的toll样受体4、细胞间粘附分子1,B7.1和CD40在单核细胞和肿瘤坏死因子通过的生产7乙酰胆(53]。这些数据表明,多个调节通路,包括nonneuronal胆碱能系统,可能参与改善LPS过度刺激的RAW264.7细胞的反应。很可能自分泌ACh介导巨噬细胞通过下调有限合伙人的hyporesponsiveness连续LPS刺激信号分子。

为了探索自分泌的影响ACh从RAW264.7细胞肿瘤坏死因子释放,聊天慢病毒表达载体的构建和转染到RAW264.7细胞。受感染的RAW264.7细胞移植聊天表情,导致增加乙酰胆碱生产和减少肿瘤坏死因子释放LPS-stimulated和如果RAW264.7细胞。出乎意料,蛋白质含量和mRNA的TNF水平都高于聊天表达载体比空向量感染细胞感染细胞。这意味着增加乙酰胆碱能够抑制肿瘤坏死因子释放,但不能抑制肿瘤坏死因子mRNA表达和蛋白质合成。这些数据同意Borovikova等人发现,胆碱能受体激动剂的抗炎是在转录后的水平(14]。

总之,我们这里描述第一次连续LPS刺激可以上调自分泌乙酰胆碱生产7乙酰RAW264.7细胞的表达,发挥主要作用,诱导巨噬细胞的hyporesponsiveness LPS刺激。增加自分泌乙酰胆碱能有效地改善肿瘤坏死因子释放RAW264.7细胞。这些研究结果建立的自动调整的效果nonneuronal胆碱能系统264.7原始细胞。

利益冲突

作者宣称没有利益冲突有关的出版。

作者的贡献

易Lv和陆Jiangyang研究、分析和解释数据;易Lv和森胡写论文;宁,钱氏,明华Du,惠普张协助研究和分析。

承认

这项研究支持经济由国家自然科学基金(项目没有。中国的30770844)。