文摘

客观的。探讨CD4的角色+CD25+T细胞亚群)在保护细颗粒物(PM)诱导炎症反应,及其潜在的机制。方法。人类脐静脉内皮细胞处理(通过传代形成细胞分级浓度(2、5、10、20和40µg /厘米2)的悬浮微粒的24 h。coculture实验,HUVECs孵化,CD4细胞+CD25−T细胞(画眉草),或在treg anti-CD3单克隆抗体的存在为48小时,然后是刺激有或没有悬浮微粒的24小时。粘附分子和炎性细胞因子的表达。结果。粘附分子,包括血管细胞粘附molecule-1 (VCAM-1)和细胞间粘附molecule-1 (ICAM-1)和炎性细胞因子,如白介素(IL) 6和引发,增加浓度的方式。此外,人类急性单核细胞的白血病细胞的粘附(THP-1)内皮细胞增加和NF -κ治疗后B活性调节HUVECs微粒。然而,亚治疗后,细particles-induced炎症反应和NF -κB激活明显缓解。Transwell抑制实验表明,Treg-mediated HUVECs炎症反应受损的微粒需要接触和可溶性细胞因子。结论。亚能减弱细particles-induced炎症反应和NF -κB在HUVECs激活。

1。介绍

颗粒造成的空气污染微粒与空气动力学直径2.5μ米( )是众所周知的与心血管疾病的发病率和死亡率1,2]。流行病学研究已经报道,细颗粒物是心血管疾病的死亡率的危险因素的机制可能包括肺和系统性炎症、加速动脉粥样硬化和心脏自主神经功能改变(3]。以前的动物研究还显示,长期接触低浓度 导致显著增加斑块区域和巨噬细胞浸润,可能通过血管炎症,并增加活性氧的生成(4,5]。在糖尿病、接触 被发现产生过多的活性氧和内皮功能障碍,这可能反过来提高心血管疾病的风险(6]。然而,到目前为止,潜在的病理生理机制连接微粒和心血管疾病,尤其是动脉粥样硬化,尚不清楚。

吸入不溶性 和小 已被证明迅速把肺部的血液循环,有可能发挥直接作用于体内平衡和心血管的完整性(7]。因此,内皮细胞的屏障功能受损 在循环。几个在活的有机体内以前的实验发现,气管内的滴注法与粒子导致全身性微血管功能障碍(8,9]。此外,在体外研究还表明,粒子可能会激活内皮细胞和诱导的表达粘附分子,包括血管细胞粘附molecule-1 (VCAM-1)和细胞间粘附molecule-1 (ICAM-1)和炎性细胞因子,如白介素(IL) 6和引发,在内皮细胞(10- - - - - -15]。因为内皮激活可能导致心血管事件的风险增加(16),(SRM2786粒子的影响 4μ米)用于本研究对人类脐静脉内皮细胞第一次调查(通过传代形成细胞通过检查特定的粘附分子和炎性细胞因子的表达。

调节性T细胞(Treg)属于一个独特的传承发挥重要作用的T细胞免疫反应的调制和减少有害的免疫激活由于他们的免疫调节和免疫抑制功能17]。先前的研究表明,Treg细胞能够保护促炎激活HUVECs暴露于氧化低密度脂蛋白(ox-LDL)和脂多糖(LPS)通过直接与目标交互内皮细胞,促进分泌的il - 10和转化生长因子-β1 (18]。然而,Treg细胞的作用在细颗粒matter-induced炎症反应和内皮功能尚未阐明。因此,在本研究中,我们进一步观察Treg细胞的影响好particles-induced HUVECs炎症反应和内皮功能,探讨其潜在的机制。

2。材料和方法

2.1。道德的声明

调查符合赫尔辛基宣言中概述的原则。这次审判是伦理委员会批准的华中科技大学同济医学院。和所有志愿者提供书面知情同意参与这项研究。

2.2。粒子样本

在这项研究中,城市细颗粒物(< 4μ米)(SRM2786)获得国家标准与技术研究院。用10000的颗粒治疗μg / mL悬挂在细胞培养基在每个周期为10分钟,30分钟后悬浮粒子的冷冻和储存在−20°C。每次实验之前,暂停解冻,用了15分钟,然后立即指定浓度在细胞培养基稀释。

2.3。HUVEC的文化

HUVECs来自人类脐静脉插管,洗和汉克斯解决血擦拭,然后用1%胶原酶消化(美国σ)15分钟在37°C。胶原酶去除后,细胞被孵化在37°C gelatin-coated文化菜Ml99介质(美国Gibco)和补充20%胎牛血清(Gibco), 100年μ50 g / mL肝素(σ)μg / mL内皮细胞生长因子(Gibco), 25毫米消息灵通的缓冲区,2毫米谷酰胺,100 U /毫升青霉素、链霉素和100 U /毫升、如前所述[19]。章节2和6之间的细胞用于实验。验证了HUVECs血管性血友病的表型抗原染色。

2.4。THP-1文化

得到的单核细胞的细胞系THP-1美式文化的集合(美国马纳萨斯)和RPMI1640 10%胎牛血清的培养。

2.5。隔离和净化的亚群

外周血收集来自20个正常的志愿者,外周血单核细胞(PBMCs)被孤立使用Ficoll-Paque +(美国通用电气医疗集团)。使用人类的CD4 Treg细胞随后被孤立+CD25+调节性T细胞隔离设备(Miltenyi研究,德国)根据制造商的指示。总之,PBMCs贴上biotin-conjugated抗体的混合物和anti-biotin微,CD4细胞+获得的细胞被消极的选择。接下来,CD4+CD25+Treg细胞被孤立的两次积极的选择来实现更高的纯度。CD4细胞的纯度+CD25+细胞群所评估的流式细胞仪> 90%。

2.6。功能抑制化验

CD4+CD25−(苔麸)和CD4 T细胞+CD25+T细胞亚群)cocultured 96 -孔板涂有50 ng / mL anti-CD3马伯的密度(美国eBioscience) 104细胞/与不同的画眉草/ Treg比率(1:1,1:1/2,1:1/4,和1:1/8)。所有的井被培养在200年最后一卷μL T cell-depleted的存在和辐照抗原呈递细胞(105细胞/)。72 h后,[3 h]胸苷(1μCi /)添加了16小时前确定扩散的闪烁计数(MicroBeta1450液体闪烁计数器;美国珀金埃尔默)。增殖的抑制百分比如下:确定(1 - [3 h]胸苷吸收cocultured Treg和苔麸)/苔麸独自×100%。一式三份的井被用于所有的抑制实验。

2.7。细胞刺激

支流HUVECs增长被血清剥夺逮捕了24小时。为了探索最优粒子浓度刺激HUVECs,细胞治疗与分级浓度(2、5、10、20和40μ克/厘米2)的悬浮粒子的24 h。在一些实验中,细胞进行预处理与NF - 30分钟κB抑制剂PDTC (10μ前美国mol / L)(σ)刺激点(20μ克/厘米2为24小时)。有时,有限合伙人(1μg / mL)被选为一个积极的控制。然后,细胞收获和上层清液收集进行进一步的分析。

2.8。Coculture HUVECs和亚群

同步,HUVECs无血清培养系统在6-well板包含24 h时,细胞融合增长到80 - 90%。与PBS不依从细胞被冲洗掉,新培养基更换。接下来,HUVECs和T细胞(2:1)cocultured如前所述[20.]。简单地说,HUECVs (1×106/)单独或与CD4孵化+CD25−或CD4+CD25+T细胞48 h的50 ng / mL anti-CD3马伯,其次是增加点(20μ克/厘米2)或有限合伙人(1μ另一个24小时的g / mL)。孵化后,浮动的T细胞被丢弃,和HUVECs洗PBS和收获。最后,收集上清液,保持冻结在−80°C进行进一步的实验。

2.9。流式细胞术检测VCAM-1

coculture时期后,HUVECs与0.25%胰蛋白酶消化没有EDTA与PBS洗两次。细胞被沾PE-anti-human VCAM-1抗体(美国eBioscience) 30分钟在4°C。同形像统计图控制被用来确保抗体特异性的抗体。染色细胞探测到一个FACSAria流式细胞分析仪(美国BD生物科学),并分析了阳性细胞的百分比FlowJo 7.6.1。

2.10。酶联免疫吸附试验

上层清液来自不同群体受到特定的ELISA检测(美国所有从研发系统)根据制造商的指示。sICAM-1 sVCAM-1最低检测浓度,il - 6,引发,TGF -β1,il - 10 1.26 ng / mL, 0.254 ng / mL, 0.7 pg / mL, 7.5 pg / mL, 15.4 pg / mL,分别和3.9 pg / mL。intra-assay和interassay这些ELISA测定的变异系数< 5%,< 10%。所有测量两次。

2.11。实时聚合酶链反应

总RNA HUVECs从不同群体使用试剂盒提取试剂(豆类、日本)根据制造商的指示,然后受到互补脱氧核糖核酸合成使用RNA PCR试剂盒(豆类)。信使rna表达决心使用SYBR绿色大师(豆类)在7900年ABI棱镜组合序列检测系统(美国应用生物系统公司)。对于每一个样本,mRNA表达规范化β肌动蛋白。引物用于本研究表所示1。

表1
引物用于实时PCR和大小的产品。
2.12。THP-1细胞内皮细胞的粘附

coculture时期后,THP-1细胞用CFSE标记(美国σ)根据制造商的指示和添加到单层内皮细胞生长在24-well盘子的monocyte-to-endothelial细胞比10:1。1 h后文化37°C,悬浮细胞被三个洗PBS。随后,细胞与4%多聚甲醛固定,绿色荧光贴壁细胞的数量统计在荧光显微镜下五个随机选择的字段。

2.13。Transwell实验

Transwell 24-well板(0.4的实验μ孔隙大小,通过培养HUVECs美国康宁合演)( /毫升)在低和Treg细胞( /毫升)anti-CD3马伯的插入。文化的48 h后,插入删除和HUVECs在低刺激点(20μ克/厘米2为24小时)。中和抗体中和实验,il - 10 (5μTGF - g / mL)β1 (5μg / mL),或同形像控制(5μ从研发系统g / mL)(所有,美国)被添加的coculture下井。潜伏期后,HUVECs和上层清液进行进一步的实验。

2.14。电泳迁移率改变分析(EMSA)检测NF -κB

EMSA实验、核蛋白质提取不同群体使用核和胞质蛋白提取工具包(Beyotime生物技术研究所,中国)。使用LightShift dna蛋白质相互作用检测化学发光EMSA工具包(美国皮尔斯)根据制造商的指示。的共识序列biotin-labeled NF -κB寡核苷酸如下:向前,5′-AGTTGAGGGGACTTTCCCAGGC-3′,和反向5′-GCCTGGGAAAGTCCCCTCAACT-3′。生物素end-labeled DNA被化学发光检测。验证发现乐队转移是否特定的NF -κB,竞争进行了测试使用的200倍超额标记寡核苷酸“冷”,除了标记探针。

2.15。统计分析

数据显示为±SEM手段。差异评估使用单向方差分析进行多重比较,其次是事后Student-Newman-Keuls必要时测试。所有使用SPSS 16.0进行分析,是统计意义 。

3所示。结果

3.1。CD4细胞的识别+CD25+T细胞

通过流式细胞术,CD4细胞的纯度+CD25+亚群分离外周血单核细胞被发现(图> 90%1(一)),大多数的孤立Foxp3亚群+(图1 (b))。测试是否CD4细胞的表型+CD25+T细胞亚群的功能特点,我们cocultured CD4细胞+CD25−T细胞在不同的比率和评估他们的抑制自体CD4细胞的增殖能力+CD25−T细胞活化后anti-CD3马伯,正如预期的那样,亚群能够有效地抑制CD4细胞的增殖+CD25−T细胞在剂量依赖性的方式(图1 (c))。

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图1
隔离和CD4的识别+CD25+T细胞。(一)CD4细胞的纯度+CD25+T细胞分离外周血单核细胞(PBMCs)健康志愿者被流式细胞仪检测。(b) foxp3的百分比+人口中CD4排序+CD25+T细胞。(c)扩散被胸苷公司评估。CD4的相对效应+CD25+百分数表示抑制CD4 T细胞+CD25−T细胞。实验重复3次。
3.2。点诱发HUVECs炎症反应浓度的方式

据报道,下午从不同来源导致ECs(粘附分子和细胞因子的表达10- - - - - -15]。然而,在这项研究中使用的粒子的影响在HUVECs并不确定。因此,在这项研究中,我们第一次调查的影响粒子HUVECs通过检查特定的表达粘附分子(VCAM-1和ICAM-1)和炎性细胞因子(il - 6和引发)。我们检查了PM-induced HUVECs粘附分子和炎症细胞因子表达与2 24小时的刺激后,5、10、20和40μ克/厘米2。我们发现粒子浓度的方式诱导炎症反应5点开始μ克/厘米2(图2)。最优浓度PM-induced HUVECs VCAM-1 ICAM-1, il - 6,并引发表达式是20,40岁,20日和10μ克/厘米2分别(图2)。因此,我们用20的浓度μ克/厘米2刺激细胞进行进一步的实验。

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图2
点诱发HUVECs炎症反应浓度的方式。HUVECs服用分级浓度(2、5、10、20和40μ克/厘米2)的悬浮粒子的24 h和上层的收集。sICAM-1 sVCAM-1的浓度(a) (b), il - 6 (c),并引发(d)被Elisa检测。 表示点或有限合伙人与控制。 ; 。实验重复3次。
3.3。亚群缓解VCAM-1表达PM-Exposed HUVECs

HUVECs单独或与CD4 cocultured是文化+CD25−T细胞(苔麸)或亚群在anti-CD3马伯48 h,然后处理或没有(控制)点/有限合伙人为另一个24小时。coculture时间后,VCAM-1表达HUVECs接触点被流式细胞仪检测。结果表明,VCAM-1表达显著调节后24 h点暴露在缺乏T细胞,而控制( 与 ; ;数据3(一个)和3 (b))。更重要的是,我们发现Tregs-treated HUVECs显示大幅减少VCAM-1表达式(点, ;有限合伙人, ),而该组织没有T细胞(点, ;有限合伙人, ; )或与CD4 coculture组+CD25−T细胞(点, ;有限合伙人, ; )(数据3(一个)和3 (b))。

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图3
亚群缓解VCAM-1的表达在PM-exposed HUVECs。coculture时期后,不同组的HUVECs收获,VCAM-1表达式被流式细胞仪检测。(一)点阴谋显示HUVECs VCAM-1表达式的百分比。(b)在不同组的HUVECs VCAM-1表达式。数据表示为±SEM手段。 表明你没有T, CD4细胞+CD25−或CD4+CD25+与控制; 表示没有或CD4 T+CD25−与CD4+CD25+; ; 。实验重复6次。
3.4。亚群表达下调粘附分子和炎性细胞因子在PM-Exposed HUVECs

coculture时期后,ELISA试验是用来检测粘附分子和炎性细胞因子的浓度。结果表明,悬浮微粒和有限合伙人的蛋白质含量显著提高sVCAM-1(点, ng / mL;有限合伙人, ng / mL), sICAM-1(点, ng / mL;有限合伙人, ng / mL)、il - 6(点, ng / mL;有限合伙人, ng / mL),引发(点, ng / mL;有限合伙人, ng / mL),与控制( ng / mL, ng / mL, ng / mL, ng / mL, ng / mL, resp)(所有 ;图4)。此外,集团没有T细胞相比,Tregs-treated HUVECs表现出明显减少所有粘附分子和炎性细胞因子的浓度( ),而CD4+CD25−T细胞没有影响( ;图4)。

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图4
亚群表达下调的蛋白表达粘附分子和炎性细胞因子在PM-exposed HUVECs。ELISA试验是用来检测的浓度sVCAM-1 (a), sICAM-1 (b), il - 6 (c),和引发(d)从不同的组HUVECs上层清液。数据表示为±SEM手段。 表明你没有T, CD4细胞+CD25−或CD4+CD25+与控制; 表示没有或CD4 T+CD25−与CD4+CD25+。 , , , 。实验重复5次。

VCAM-1的mRNA水平,ICAM-1、il - 6和引发也由实时聚合酶链反应(rt - PCR),结果是规范化的内生控制基因β肌动蛋白。与上述蛋白表达的结果一致,VCAM-1的mRNA水平,ICAM-1, il - 6,和引发都增加点/ LPS刺激后,和亚群能够显著减少(所有这些调节mRNA水平 ;图5)。

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图5
亚群表达下调的mRNA表达粘附分子和炎性细胞因子在PM-exposed HUVECs。利用rt - pcr检测的mRNA表达VCAM-1 (a), ICAM-1 (b), il - 6 (c),引发在不同组的HUVECs (d)。数据表示为±SEM手段。 表明你没有T, CD4细胞+CD25−或CD4+CD25+与控制; 表示没有或CD4 T+CD25−与CD4+CD25+。 , , , 。实验重复5次。
3.5。亚群减少THP-1细胞内皮细胞的粘附

进一步确认增加VCAM-1粘附分子的表达和HUVECs ICAM-1点曝光后,THP-1细胞内皮细胞的粘附是评估。coculture时期后,THP-1细胞用CFSE标记被添加到HUVECs。正如所料,THP-1细胞内皮细胞的粘附是显著增加(点, ;有限合伙人, ),而控制( )( ;数据6(一)和6 (b))。相比之下,THP-1细胞的粘附Treg-treated HUVECs明显减少(点, ;有限合伙人, )( ),而CD4+CD25−T细胞只有一个小效果(点, ;有限合伙人, )( ;数据6(一)和6 (b))。

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图6
亚群减少THP-1细胞内皮细胞的粘附。(一)代表THP-1细胞的显微照片坚持内皮细胞(ECs)。THP-1细胞被绿色荧光。 nm。(b) ECs THP-1细胞的粘附是由荧光显微镜。数据表示为±SEM手段。 表明你没有T, CD4细胞+CD25−或CD4+CD25+与控制; 表示没有或CD4 T+CD25−与CD4+CD25+。 , , 。实验重复4次。
3.6。PDTC抑制PM-Induced炎症反应

NF -κB是一个转录因子调节促炎和抗凋亡基因的表达,也扮演着重要的角色在推动的炎症反应21]。测试是否NF -κB参与PM-induced炎症反应,我们使用了NF -κB特异性抑制剂PDTC治疗细胞之前点刺激。形式图7,我们证明了PM-stimulated PTDC治疗后炎症反应几乎完全抑制,表明NF -κB活动可能PM-mediated炎症反应中起着重要的作用。

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图7
PDTC抑制PM-induced炎症反应。HUVECs是预处理与NF - 30分钟κB抑制剂PDTC (10μmol / L)刺激点(100μg / mL) 24 h。炎性细胞因子和粘附分子通过流式细胞术和Elisa检测到。(一)点阴谋显示HUVECs VCAM-1表达式的百分比。(b)在不同组的HUVECs VCAM-1表达式。(c)的浓度sVCAM-1 sICAM-1, il - 6,引发HUVECs的上层清液从不同的群体。数据表示为±SEM 5独立的实验手段。
3.7。亚群表达下调PM-Induced NF -κB激活HUVECs

在我们的研究中,NF -κB活动HUVECs PM / LPS处理后由EMSA实验使用biotin-labeled特定NF -寡核苷酸探针κB-binding网站。同意上面的结果包括调节粘附分子和炎性细胞因子的水平,NF -κB活动增加HUVECs没有点或LPS刺激T细胞后,与控制( ;图8)。相比之下,减少炎症反应是由一个明显反映在转录水平降低了NF -κB upregulation PM / LPS刺激Tregs-treated HUVECs ( ),而没有区别在Teff-treated HUVECs ( ;图8)。

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图8
亚群表达下调NF -κB HUVECs受损的激活点。电泳迁移率改变分析(EMSA)与核蛋白质进行分离检测NF -不同的HUVEC文化κB的活动。(一)代表EMSA结果。(b)的dna结合活性NF -κB在不同群体由相对测量方法。数据表示为±SEM手段。 表明你没有T, CD4细胞+CD25−或CD4+CD25+与控制; 表示没有或CD4 T+CD25−与CD4+CD25+。 , , 。实验重复4次。
3.8。Treg-Mediated HUVECs的抑制炎症反应是由细胞和可溶性因素联系

探索是否抑制炎症反应的HUVECs接触点取决于细胞接触或可溶性因子,我们与Treg HUVECs没有T细胞,培养细胞的存在anti-CD3马伯coculture或太瓦系统。文化的48小时后,车厢顶部被移除,HUVECs在较低的处理点了24小时。通过阻断身体接触HUVECs和亚群之间(TW)粘附分子的抑制(VCAM-1和ICAM-1)和炎性细胞因子(il - 6和引发)产量明显下降而coculture系统(数据9 (b),9 (c),9 (d))。这部分逆转的抑制可能是由于细胞亚群之间的联系的要求和PM-exposed HUVECs。

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Tregs-mediated抑制的机制HUVECs接触点。HUVECs培养没有T细胞(T)或亚群在anti-CD3马伯在coculture (CC)或TW系统。经过48小时的文化,插入删除和HUVECs在低刺激点。在一些实验中,il - 10, TGF -β1,il - 10 + TGF -β1,或者同形像马伯添加到低。粘附分子和细胞因子通过流式细胞术和Elisa检测到。(一)il - 10和TGF -的浓度β1在上层清液从不同的群体。数据表示为±SEM手段3个独立的实验。 。(b)点阴谋显示HUVECs VCAM-1表达式的百分比。(c)在不同组的HUVECs VCAM-1表达式。(d)的浓度sVCAM-1 sICAM-1, il - 6,引发HUVECs的上层清液从不同的群体。数据表示为±SEM 4个独立的实验手段。 表明CC或TW和没有T; 表明TW和CC; 显示和TW;&表明同形像与太瓦。 , , , , , , 。

据报道,激活亚可能产生抗炎细胞因子,如il - 10和TGF -β1 (22]。更重要的是,我们也发现,il - 10的浓度和TGF -β1亚系统是高于其他系统( ;图9(一个))。调查是否il - 10或TGF -β1可能参与了镇压的亚群,中和实验。Anti-IL-10 anti-TGF -β1,或者同形像马伯TW的低添加到系统。治疗后与anti-IL-10马伯或anti-TGF -β1、抑制效果明显下降;此外,炎症反应的抑制HUVECs anti-IL-10和anti-TGF——时完全废除β1添加了马伯,同形像马伯(数据没有影响9 (b),9 (c),9 (d))。

4所示。讨论

大量的流行病学证据表明,点,特别是 与严重的后果,是一个主要的风险因素在心血管系统(3,23- - - - - -26]。因为它的体积小, 可以被吸入肺部并把到循环,与潜在的直接作用于血管内皮细胞,躺在里面的。在目前的研究中,HUVECs被用来探索微粒在内皮炎症反应的影响,以及干预研究Treg细胞与健康志愿者工作。与之前的研究一致,我们的结果表明,微粒不仅诱导粘附分子的表达和HUVECs炎性细胞因子浓度的方式,但也增加了THP-1细胞内皮细胞的粘附主要通过NF -κB激活。重要的是,Treg细胞能够保护好particles-induced炎症反应和表达下调NF -κ通过细胞接触B激活HUVECs PM-impaired HUVECs和可溶性因素(主要是il - 10和TGF -β1)。

内皮屏障功能起着重要的作用在调节血管张力,细胞粘附,血管壁炎症(27]。ICAM-1的表达水平和VCAM-1内皮细胞的膜是激活的内皮细胞的重要标志28]。这些细胞粘附分子调节白细胞的绑定ECs,从而招募白细胞的间质组织(29日]。招聘的炎症细胞被认为是动脉粥样硬化的发展的第一步。在此之前, 和 已报告诱导的表达ICAM-1和VCAM-1内皮细胞(10,12,13]。在我们的研究中,城市细颗粒物(< 4μm;SRM2786)而不是 被用来刺激HUVECs。我们发现微粒明显诱导mRNA和蛋白表达VCAM-1和HUVECs ICAM-1,这可能导致PM-accelerated动脉粥样硬化。一些动物实验表明Treg细胞数量和功能的增加与减少动脉粥样硬化斑块(30.- - - - - -35]。此外,还发现了亚群保护ox-LDL / LPS-induced表达VCAM-1 HUVECs [18]。与之前的研究一致,我们的结果表明,Treg细胞,但不是画眉草细胞,显著降低PM-induced表达粘附分子(HUVECs VCAM-1和ICAM-1)。

接下来,确定微粒诱导的表达粘附分子治疗24小时后,THP-1细胞内皮细胞的粘附。我们发现与控制相比,THP-1细胞的粘附PM-treated HUVECs明显增加,与以前报道的结果一致(10,12]。相比之下,coculture Treg细胞能够减少粘连,而画眉草细胞只有一个小的效果。白细胞的粘附ECs和随后的轮回的单核细胞在内皮细胞被认为是动脉粥样硬化的起始的重要步骤。太阳等人表明,长期接触的ApoE−−老鼠的低浓度 增加斑块面积和巨噬细胞浸润4]。在一起,这些结果不仅表明微粒诱导HUVECs的激活,导致单核细胞粘附由于增加粘附分子的表达,也意味着微粒可能参与动脉粥样硬化的发展。更重要的是,我们的研究表明,Treg细胞中发挥作用衰减细particles-mediated血管炎症和动脉粥样硬化。

微粒可能诱发炎症反应在人类巨噬细胞(36,人类肺上皮细胞37),和人类内皮细胞(11,15]。在这项研究中,增加mRNA和蛋白表达的il - 6和引发表明微粒在HUVECs引起炎症反应。另一方面,Treg细胞HUVECs显示显著减少mRNA和蛋白表达的il - 6和引发,这表明亚可以保护好particles-induced炎症反应。基于这些结果,我们得出这样的结论:微粒诱导粘附分子的表达和HUVECs炎性细胞因子,这些影响被亚治疗缓解。

NF -κB信号是一个重要的途径介导促炎反应(38,39]。NF -的作用κB在PM-induced炎症反应是由新兴的证据。具体来说,微粒来自柴油发动机(柴油机排气微粒)显示激活NF -κB在人类支气管上皮细胞(40- - - - - -42]。研究表明,NF -κB柴油机排气微粒引起的激活炎症趋化因子的表达有关,如引发,单核细胞化学引诱物蛋白1,和粘附分子(43]。此外,柴油超细颗粒(UFPs)也可能通过NF -调节炎性反应κB激活内皮细胞(43]。相反,在人类抗免疫,NF -κB活性抑制了柴油机排气微粒,因此抗免疫受损(44]。因此,微粒可能改变NF -κB在microenvironment-dependent时尚活动。在我们的研究中,治疗后与NF -κB特定抑制剂PDTC、精细particles-induced炎症反应几乎完全废除。此外,在同意增加粘附分子和炎性细胞因子的表达,EMSA结果还表明,微粒诱导NF -κB在HUVECs激活。此外,他等人先前报道,亚群表达下调ox-LDL / LPS-induced NF -κB激活HUVECs [18];同样,我们的研究表明,亚群显著下降PM-induced NF -κB在HUVECs激活。在一起,这些发现暗示Treg细胞可能会降低细particles-induced粘附分子的表达和炎性细胞因子主要是通过下调NF -κB激活。

发现了一些关于Treg-mediated抑制机制,包括抗炎细胞因子分泌Treg细胞或细胞contact-dependent抑制(45]。在我们的研究中,TW实验和中和抗体被用来探索HUVECs Treg-mediated抑制的机制。通过阻断亚群之间的身体接触和HUVECs (TW),炎症反应的抑制是只有部分逆转,表明细胞接触Treg-mediated抑制中扮演了一个角色。此外,在coculture系统的上层清液,il - 10和TGF -的浓度β1是显著增加,表明抗炎细胞因子可能需要在Treg-mediated抑制。因此,减少了NF -κB激活Treg-treated HUVECs可能部分由于il - 10浓度的增加,因为il - 10可能抑制NF -κB激活(46]。治疗后anti-IL-10和TGF -β1马伯,炎症反应的抑制TW系统被废除。因此,推测机制包括细胞接触和抗炎细胞因子有助于抑制由亚群。

总之,微粒(SRM2786)可能刺激粘附分子的表达和炎性细胞因子通过NF -κB在HUVECs激活。更重要的是,本研究对我们所知,这是第一个表明Treg细胞可以保护PM-induced炎症反应和表达下调NF -κB在HUEVCs通过细胞接触和抗炎细胞因子激活在体外。这些发现可能为治疗提供新靶点PM-induced不良健康效应,尤其是心血管疾病。未来的研究需要调查在活的有机体内Treg细胞对细particles-induced心血管疾病,如动脉粥样硬化动物模型。

缩写

下午: 可吸入颗粒物
HUVECs: 人类脐静脉内皮细胞
VCAM-1: 血管细胞粘附molecule-1
ICAM-1: 细胞间粘附molecule-1
THP-1: 人类急性单核细胞的白血病细胞
EMSA: 电泳迁移率改变分析。

利益冲突

作者宣称没有利益冲突。

作者的贡献

Wen-cai张、王Yan-ge和朱Zheng-feng贡献同样这项工作。

确认

这项工作是支持由中国国家基础研究计划(973计划:2011 cb503806 Long-xian Cheng)和中国国家自然科学基金(81172750和81172750号Long-xian Cheng)。