文摘
研究调查的影响醛糖还原酶(AR)抑制剂benzofuroxane导数5(6)-(苯并[d]thiazol-2-ylmethoxy) benzofuroxane(文中称为BF-5m)生化和组织变化引起的大鼠内毒素的葡萄膜炎。BF-5m直接管理到玻璃,为了评估(i)的表达和水平炎症标记物,如眼部ubiquitin-proteasome系统,NF -κB,肿瘤坏死因子-α,MCP-1;(2)prooxidant和抗氧化剂标记如硝基酪氨酸、锰超氧化物歧化酶(MnSOD)及谷胱甘肽过氧化物酶(GPX);(3)凋亡/凋亡因素还存在和Bcl-xl;(iv)标记的内皮祖细胞(epc)招聘CD34和CD117等。5μL BF-5m (0.01;0.05;和0.1μ米)到右眼减少剂量依赖性的方式LPS-induced炎症,临床报告分数1。它减少了眼泛素的水平,20年代和26 s蛋白酶体单元,NF -κB亚基,TNF -α、MCP-1和硝基酪氨酸。BF-5m改善LPS-induced MnSOD和GPX水平下降。凋亡的影响被监测的表达从BF-5m Bcl-xl,凋亡蛋白。同样,BF-5m增加眼内的内皮祖细胞的招聘,根据CD34和CD117抗体。
1。介绍
葡萄膜炎、葡萄膜炎症的眼睛是失明和视力下降的主要原因之一在世界上1- - - - - -4]。这种疾病会影响所有年龄段的人,性别和种族,尽管性优势可以观察到在某些情况下(3,4]。它还影响劳动人口20至59岁(5,6]。因为变化的原因,葡萄膜炎的病因是很难定义的。这种病理特点是中促炎细胞因子水平升高的眼部组织,涉及炎症分子和活性氧的生产(ROS) (7]。实验动物模型最接近人类的葡萄膜炎是急性的细菌内毒素脂多糖(LPS)——诱导葡萄膜炎(EIU) (3,4,8]。有限合伙人等炎症分子的表达增加系统性TNF -α、il - 6、MIF干扰素-γ,MCP-1和一氧化氮的生产。高水平的这些介质诱导,破裂后blood-ocular障碍,白细胞和单核细胞的浸润在眼部组织促进经济的发展9]。
文献报道的抑制醛糖还原酶(AR)、多元醇通路的关键酶能将多余的葡萄糖转化为山梨糖醇与随之而来的活性氧的形成,防止或减少眼部炎症的急性形式LPS诱导的大鼠,通过减少氧化应激信号(10]。各种醛糖还原酶抑制剂(阿里斯)检测对葡萄膜炎(3,4,7,11- - - - - -13]。我们最近发现了一个新类nonhydantoin noncarboxylic酸抑制剂,以benzofuroxane核心(14,15]随着新支架与所谓的基于“增大化现实”技术的阴离子网站交互。合并submicromolar AR抑制活动重要的ROS清除属性,这些化合物可能是理想的治疗治疗学人能够防止氧化应激炎症活动。
由于这些原因,记住blood-ocular屏障的存在,可能会限制这些抑制剂的治疗浓度的成就在玻璃和chorioretina系统性管理后,我们测试了整个系列的最有效的化合物,即5(6)-(苯并[d]thiazol-2-ylmethoxy) benzofuroxane(文中称为BF-5m),直接注入的玻璃,以评估是否抑制当地的基于“增大化现实”技术的改善着生化和组织变化引起的学人。我们调查的影响,化合物可能在眼部的水平(我)炎症标记物如眼部ubiquitin-proteasome系统和NF -κB通路;(2)prooxidant和抗氧化剂标记如硝基酪氨酸,MnSOD, GPX;(3)proapoptotic /凋亡因素还存在和Bcl-xl蛋白质;(iv)标记的内皮祖细胞(epc)招聘CD34和CD117等。
2。材料和方法
2.1。药物
BF-5m 5(6) -(苯并[d]thiazol-2-ylmethoxy) benzofuroxane(图1),合成的药房大学的比萨,意大利,之前报道过程(15]。简而言之,烷基化的商用4-amino-3-nitrophenol氯乙腈,在无水碳酸钾的存在,提供了2 - (4-amino-3-nitrophenoxy)乙腈,通过与o-aminothiophenol反应,给关键中间体4 -[(苯并[d]thiazol-2-yl)甲氧基]2-nitrobenzenamine。治疗亚硝酸钠在浓盐酸,然后与叠氮化钠在水里,给相应的azido-derivative,环化目标抑制剂,5(6)-(苯并[d]thiazol-2-ylmethoxy) benzofuroxane,当加热回流下醋酸溶液。
2.2。经济学人信息部的感应
男性Sprague-Dawley老鼠(哈伦,意大利)(420 - 450 gr)皮下注入与200年拦路贼μ克的脂多糖(LPS,明尼苏达州沙门氏菌σ圣路易斯,密苏里州,美国)在0.1毫升无菌pyrogen-free盐水学人的感应。1 h有限合伙人注射后,在戊巴比妥麻醉(45毫克/公斤ip盐水),学生们被一滴的滴注法扩张tropicamide 5%;然后用一滴盐酸丁卡因局部麻醉诱导是1%其次是intravitreal注入测试化合物的右眼。这是通过使用无菌注射器安装执行30-gauge针(划痕、BD、意大利)和5μL (16的三个不同BF-5m浓度,0.01,0.05和0.1μ米,在以往的研究中使用的范围15]。复合重组在1%二甲亚砜(DMSO,σ,意大利)有限合伙人之前2 h后注入和注入玻璃1 h有限合伙人。以下6个实验小组被认为是(为每个组):车辆(生理盐水);车辆(1% DMSO);有限合伙人+生理盐水;有限合伙人+ BF-5m (0.01;0.05;0.1μ米/鼠)。老鼠被杀死后24 h治疗和评估临床症状和生化标记。所有的程序都是经当地伦理委员会批准数量2108/12。
2.3。临床评分归因于经济
葡萄膜炎的发展确定后24 h后复合的管理方法报道罗西et al。17]。葡萄膜炎的临床症状得分从0到4,和葡萄膜炎被认为是积极的分数分配> 1时。
2.4。眼睛样品
收获的眼睛是切成两半,一半是立即在液态氮冷冻生化指标,而另一半立即被浸泡在10%缓冲福尔马林固定,石蜡包埋,免疫组织化学,如前所述[17]。
2.5。免疫印迹分析
免疫印迹技术与我们之前的工作中执行协议(17]。主要的抗体使用antiproteasome单元(fl - 76、anti-20S anti-26S), anti-NF -κB p65 (C-20) anti-NF -κB p50 (h - 119)和施敏原著(h - 119), anti-glutathione过氧化物酶(GPX) anti-manganese-superoxide歧化酶(Mn-SOD)和anti-Bcl-xl。这些主要抗体购自圣克鲁斯研究(美国)。二次抗体与合结合辣根过氧化物酶,驴多克隆兔免疫球蛋白,山羊anti-mouse,和山羊anti-rabbit,都从圣克鲁兹购买研究(美国)。结果表示在密度测量单位。
2.6。ELISA试验
商业比色酶联免疫试剂盒(研发系统、美国)被用来定量分析眼部肿瘤坏死的水平α(TNF -α)和单核细胞化学引诱物蛋白1 (MCP-1)根据制造商的指示。200年μL使用眼匀浆。短暂,冷冻组织均质在PBS蛋白酶抑制剂,特里同x - 100添加到最终的浓度1%,离心5分钟在10000×g在4°C。
2.7。免疫组织化学
Antinitrotyrosine抗体被用于评估氧化应激和CD117和CD34抗体招聘epc(美国圣克鲁斯研究)。眼部组织主要孵化与特定的抗体,在PBS洗,孵化与二级抗体。眼样本分析专家病理学家(可变性6%);每个样本在200 x放大可视化。CD34的数量+,CD117+,硝基酪氨酸积极粒子分析了单位面积在20 200 x下微观领域。
2.8。RNA提取和rt - pcr
从均质眼睛使用RNA提取的总RNA Tri-Reagent(分子研究中心有限公司、辛辛那提、哦)根据制造商的协议。提取的RNA受到DNase我在37°C治疗了30分钟。总RNA浓度是由紫外分光光度计。mRNA水平衡量rt - pcr扩增,之前报道(18]。RT -控制进行检查潜在的基因组DNA污染。这些RT -控制进行不使用逆转录酶酶在反应中混合。序列的老鼠mrna资源库(DNASTAR INC .,麦迪逊,WI)被用来设计引物对rt - pcr(益生元4.05软件,国家生物科学公司,普利茅斯,MN)。每个rt - pcr是至少重复三次,以实现最好的再现性数据。测量的mRNA水平正常化对hypoxanthine-guanine phosphoribosyl转移酶(产生HPRT)选为看家基因。产生HPRT基因表达并没有改变在一些实验条件(18]。我们没有知识分子证据变化产生HPRT mrna水平在这个模型。基因表达值被表示为任意单位±SE。扩增的基因和产生HPRT同时进行。PCR产品解决2.0%琼脂糖凝胶。半定量的分析mRNA水平是由凝胶Doc EZ紫外线系统(Bio-Rad大力神,CA)。总RNA提取车辆的眼睛,有限合伙人,BF-5m-treated老鼠和反向转录成cDNA使用上标逆转录酶系统。半胱天冬酶3和半胱天冬酶8的表达被qPCR量化使用商用老鼠引物。产生HPRT作为内部控制。结果表示为基于计算任意单位方法。相对数量的目标基因规范化产生HPRT和车辆。
2.9。统计分析
数据表示为意味着±标准平均误差(SEM)。学生的以及(当只有两组比较)或单向方差分析Dunnett紧随其后的测试使用(超过两个实验小组)。被认为是具有统计学意义。
3所示。结果
3.1。临床评分BF-5m对经济的影响
LPS-injected老鼠都出现血管改变眼睛的中间膜的临床评分4(图2)。BF-5m注入玻璃在三个不同浓度(0.01;0.05;和0.1μM)这只眼睛的LPS-induced炎症减少剂量依赖性的方式报告临床评分1.1(图2)。
3.2。BF-5m EIU炎症标记物
免疫印迹分析显示最高的炎症标志物的表达如泛素,20多岁和26 s蛋白酶体单元,NF -κB亚基在LPS处理后的眼睛。这些标记被BF-5m显著和剂量依赖性降低。最大的行动表达的测试化合物的浓度0.1μ(数据3和4)。0.01和0.05μM BF-5m对蛋白酶体和NF -没有影响κB(数据3和4)。
(一)
(b)
(c)
(一)
(b)
(c)
此外,ELISA显示剂量依赖性降低眼部水平的细胞因子TNF -α和趋化因子后MCP-1 intravitreal BF-5m相比水平表达的眼部组织LPS-treated动物(图5)。
(一)
(b)
3.3。BF-5m影响氧化应激诱导的学人
调查的老鼠眼组织匀浆EIU显示水平显著降低MnSOD(−44%)和GPX(−40%)由有限合伙人对车辆(生理盐水)组(图6)。这些减少被intravitreal注入BF-5m几乎完全废除,最大影响MnSOD(42%)和GPX 0.1(36%)表达式μM浓度(图6)。
(一)
(b)
定义的眼睛内氧化损伤EIU老鼠BF-5m处理,免疫组织化学是用来评估硝基酪氨酸表达有限合伙人注射后24小时,所需时间为发展中炎症的急性期。硝基酪氨酸的表达主要是本地化到纤毛的身体和脉络膜大幅增强LPS组(人物的眼睛7和8)。BF-5m治疗显著降低这个标记的表达对车辆单独(数字7和8)。有趣的是,这引起的减少BF-5m不是CD34的表达增加,CD117标记的内皮祖细胞招聘到眼睛(数字7和8)。
(一)
(b)
(c)
3.4。BF-5m凋亡的影响
Bcl-xl、凋亡蛋白显示略明显的表达眼睛匀浆EIU老鼠,而其表达在眼部组织更强的老鼠接受BF-5m(图9)。相比之下,mrna半胱天冬酶3和半胱天冬酶减少BF-5m(图810)。
(一)
(b)
4所示。讨论
在这里,我们表明,AR抑制剂BF-5m能够减少内毒素的葡萄膜炎的临床症状,影响有关硝基酪氨酸的减少和增加抗氧化蛋白的表达MnSOD和GPX眼睛。此外,BF-5m泛素的表达减少,20岁和26 s蛋白酶体亚基在uveitic眼中,高亮显示,除了压力降低活动,BF-5m还可能降低有害的影响,促炎ubiquitin-proteasome系统可能眼结构的完整性。作为主要系统nonlysosomal胞内蛋白在真核细胞退化,是参与的生物学过程,包括炎症、增殖,凋亡,负责疾病进展和与不良预后19]。ubiquitin-proteasome系统需要激活核转录因子(NF -κBκB),一个中央调节炎症基因的转录因子,通过抑制κB(我的退化κ(B)蛋白质20.)和下游一系列事件导致炎症反应在器官和组织的发展。这里,减少ubiquitin-proteasome BF-5m伴随着减少表达子单元的NF -κB在EIU老鼠的眼睛。因此,促炎因子TNF -的水平α和MCP-1 proapoptotic [21半胱天冬酶3和半胱天冬酶8被削弱。因此,抑制当地的AR BF-5m减少压力诱导炎症组件的葡萄膜炎。复合也增加了两个细胞生存和增殖标记的表达,CD117和CD34在眼部组织。CD117是跨膜受体酪氨酸激酶,也称为c - kit,包括造血干细胞的发展和生存,黑色素细胞,生殖细胞,肥大细胞,卡哈尔间质细胞[22]。CD34标记的干细胞;这是一个家庭的成员的单程跨膜蛋白的功能是信息的一个因素粘连(23]。文献报道,这些标记物的表达数据刺激经过无数侮辱包括氧化应激和炎症(24,25),旨在使著名开始修复受损组织的EPC招募到侮辱站点。因此,虽然还需要进一步的见解,BF-5m增加内皮祖细胞的招募到眼睛可以促进经济的起始的决议。
总之,这项研究表明,benzofuroxane导数BF-5m代表了一个新的机会,药物干预旨在防止经济发展。它提高了免疫炎症的老鼠的眼睛。
利益冲突
作者宣称没有利益冲突有关的出版。
作者的贡献
罗西和m D中保分享最后的作者。