文摘

趋化因子fractalkine是独特的因为它存在包围的粘附分子,可溶性化学引诱物。这里假设测试是否可以剥离胎盘fractalkine,释放到母体血液循环。免疫组织化学染色的前三个月和术语胎盘部分本地化fractalkine在顶端microvillous合胞体滋养层的质膜。基因表达分析显示丰富upregulation在胎盘fractalkine术语,而前三个月。Fractalkine在滋养层细胞表达和释放行BeWo,滋养层主要术语和胎盘外植体。孵化BeWo细胞和胎盘外植体metalloprotease抑制剂Batimastat抑制可溶性fractalkine的释放,同时增加了膜结合的形式。这些结果说明人类胎盘源fractalkine,合胞体滋养层中表达,可以释放进入母体循环本构metalloprotease脱落的依赖。的表达和释放增加胎盘fractalkine可能导致低品位系统性炎症反应在晚期妊娠的正常。异常胎盘metalloprotease活动不仅会影响胎盘的释放派生fractalkine但可能同时影响的膜结合形式的丰富趋化因子。

1。介绍

在人类妊娠胎盘颞绒毛机关履行广泛面板怀孕的维护功能,包括气体交换和代谢产物,调节水平衡,分泌的内分泌因素。绝大多数的胎盘派生内分泌因素合成合胞体滋养层,这一层独特的epithelium-like没有侧细胞borders-covers所有胎盘绒毛状树以及部分绒膜和基板的内表面。因此,合胞体滋养层线intervillous空间,因此暴露在母体的血液(1]。身边几乎所有已知的古典下丘脑和垂体激素的类似物,人类的合胞体滋养层也能合成类固醇激素、类,adrenal-like肽,细胞因子和趋化因子2,3]。

趋化因子分为四个亚科根据前两个半胱氨酸残基的数量和间距在守恒cystein结构主题(4]。这四个子类被称为C, CC,科学家,残雪₃C, C是一种半胱氨酸和X任何氨基酸残基。残雪的₃C子类在1990年代被发现,只包含一个成员,称为fractalkine或CX3CL1 [5]。Fractalkine合成为一个373个氨基酸的跨膜分子,组成细胞外的n端结构域,mucin-like茎、跨膜α螺旋,一个简短的胞质尾(6,7]。代表趋化因子的细胞外的领域,领域和mucin-like杆,可以摆脱metalloproteases成可溶性同种型(8- - - - - -10]。因此,fractalkine既存在,膜结合和可溶性形成情况认为是独特的在群趋化因子。而可溶性形式chemoattractive单核细胞活动,自然杀伤细胞和t细胞,膜结合的形式促进耐流白细胞与内皮细胞的粘附通过其相应的G protein-coupled 7-transmembrane受体CX3CR1 [11]。基于此,fractalkine可能被认为是炎症趋化因子表达激活内皮和上皮细胞,以及在树突细胞,淋巴细胞,成骨细胞,神经元,小胶质细胞(12- - - - - -14]。根据组织分布分析fractalkine mRNA表达最丰富的大脑、心脏、肾、肺、胰腺但也可以发现在人类胎盘(5]。

然而,当前知识胎盘派生fractalkine及其对妊娠的影响是有限的和基于少量的研究。胎盘fractalkine表达最初在绒毛滋养层和羊膜上皮细胞,这是建议作为大量的资源释放的可溶性fractalkine羊水的人类第二和第三怀孕三个月(15]。汉纳等人的研究显示fractalkine表达式通过半定量rt - pcr在原发性子宫内膜上皮细胞和滋养层细胞系JEG-3, AC1M-32, ac1m - 88 (16]。迁移和粘附的研究同一组建议fractalkine参与胚胎植入过程(17]。最近,增加胎盘fractalkine表达建议有助于从妊娠胎盘组织复杂的微脉管密度增加了糖尿病(18]。

在广泛的光面板的因素从人类胎盘释放可能是假定fractalkine就是其中之一。然而,实验证据胎盘fractalkine释放到目前为止尚未提供。因此,我们旨在分析胎盘的时空表达fractalkine和测试假设是否可以摆脱和释放到intervillous空间,也就是说,产妇流通。

2。方法

2.1。人类胎盘组织样本

这项研究是医学伦理委员会批准的格拉茨大学和知情同意从女性获得。前三个月胎盘(意味着妊娠周:9.4±1.7)获得女性(意味着母亲的年龄:28.1±6.2年;平均身体质量指数:24.2±5.0)接受心理妊娠终止的原因。术语胎盘分娩后获得(意味着孕龄:39.4±0.9周)从健康妇女(平均产妇年龄:34.8±3.7年;平均身体质量指数:23.4±4.4)与单例妊娠和没有感染的临床证据。妊娠并发高血压、子痫前期,代谢疾病,类固醇治疗,艾滋病、酒精滥用和/或滥用药物被排除在外。

2.2。免疫组织化学

福尔马林固定和石蜡包埋(FFPE)组织部分(5μ从一分之十米)三个月和10项胎盘被安装在Superfrost +幻灯片(门泽尔/热费希尔科学)。标准deparaffination后,组织部分受到抗原检索沸腾的幻灯片的抗原决定基检索溶液pH值9.0 (Novocostra,徕卡)7分钟C显现室(Biocare医学)。使用染色部分是应用机器人(360年Autostainer,热费希尔科学)和UltraVision大量探测系统合聚合物工具包(热费希尔科学)根据制造商的指示。总之,氢过氧化物酶块用于10分钟阻断内源性过氧化物酶。清洗步骤与TBS包括0.05%渐变20 (TBS / T;默克公司)是紧随其后的是背景与超V块阻塞5分钟。单克隆反CX3CL1 / fractalkine抗体(81513年克隆,研发系统)是稀释1:1000 (0.5μg / mL抗体工作浓度)稀释剂(Dako)和孵化后为30分钟幻灯片rt TBS / T洗涤步骤,主要抗体增强剂应用于幻灯片在rt,另一个洗后10分钟,检测是通过孵化anti-mouse /兔子UltraVision HRP-labelled聚合物系统(15分钟)和3-amino-9-ethylcarbacole (AEC, Dako),根据制造商的指示。消极的控制,幻灯片和负控制鼠标IgG1孵化(Dako)在同一浓度如上所述。此外,特异性单克隆抗体反CX3CL1 / fractalkine被抗体preadsorption评估方法。为了这个目的单克隆反CX3CL1 / fractalkine抗体(1:1000年,0.5μg / mL抗体工作浓度)混合稀释剂过量的重组体人完整fractalkine (5μg / mL工作浓度,rhCX3CL1 / Fractalkine,研发系统)和孵化与温柔的摇动1 h rt混合物完全单克隆抗体反CX3CL1 / Fractalkine并行孵化和担任控制。孵化后免疫组织化学进行如上所述。核沾染了hemalaun,幻灯片安装与凯撒的甘油明胶。

2.3。文化BeWo细胞

BeWo细胞从欧洲购买的细胞培养(ECACC)和培养在DMEM / F12 (1: 1, Gibco),补充10% FCS、青霉素、链霉素、两性霉素B、谷酰胺C在湿润的气氛中含有5%的股份有限公司₂在空气中。细胞通过10至20被用于在体外实验。与forskolin BeWo细胞的分化诱导,是补充培养基最终浓度为20μ米(10毫米股票在DMSO)。实验测试不同浓度的metalloprotease抑制剂Batimastat (Tocris生物科学),1×10⁵BeWo细胞被播种在24-well文化菜(Nunc热费希尔科学)和1毫升/以上所述培养基。对于所有其他BeWo细胞实验,细胞被播种在12-well文化菜(2×10⁵细胞/)和2毫升/培养基。播种后的一天,细胞被孵化与培养基补充有或没有forskolin (20μM)和Batimastat (10μ米)。细胞培养在培养基含有相同量的DMSO溶液作为溶剂的控制。年底的孵化条件培养基收集后续免疫测定测量。细胞与缓冲盐水洗和细胞溶解里帕缓冲区(Sigma-Aldrich)包括蛋白酶抑制剂鸡尾酒(美国罗氏诊断,印第安纳波利斯,IA)。

2.4。分析细胞生存能力

的影响Batimastat BeWo细胞的可行性进行了分析,基于甲基四唑盐(MTS)的细胞生存能力分析(CellTiter 96细胞增殖测定水一个解决方案,Promega),根据制造商的协议。总之,2.5×10⁴100年BeWo细胞被播种μ每在96 - L培养基好菜。播种后的一天,细胞培养在培养基补充Batimastat (10μ米)或溶剂控制DMSO溶液(0.1%)48 h。孵化后,20μL MTS溶液试剂添加到每个好和盘子孵化1 h。使用板之后吸光度被记录在492 nm读者和DMSO溶液的吸光度值控制设置为100%。

2.5。隔离和主要的文化滋养层

主要滋养层分离得到的四项胎盘绒毛膜绒毛酶消化和Percoll密度梯度离心法如前所述[19]。细胞被播种在6-well文化菜(3×10⁶/)和2毫升/ DMEM (Gibco)补充10% FCS和培养缺氧工作站(BioSpherix) 8%的氧气c .一天后播种培养基与循证医学DMEM /交换(1:1,Gibco / Lonza)补充7.5% FCS和细胞培养48 h下8%的氧气C。

2.6。胎盘外植体培养

从人类早期妊娠绒毛组织(妊娠7周和12之间)和术语胎盘(妊娠38周和40)之间在缓冲盐水清洗彻底,切割成小块大约5毫克潮湿的质量。胎盘外植体培养在DMEM / F12 (1: 1, Gibco)补充10% FCS、青霉素、链霉素、两性霉素B、谷酰胺有或没有Batimastat (10μ米)在缺氧工作站(BioSpherix)低于2.5%(第一学期外植体)和8%氧(术语外植体)为5天c .胎盘外植体培养在培养基含有同样体积的DMSO作为控制。孵化后,收集条件培养基和胎盘外植体均质与蛋白酶抑制剂鸡尾酒里帕缓冲区使用组织均质器(IKA TA10基本Ultra-Turrax)。

2.7。分析胎盘外植体的可行性

胎盘外植体的可行性评估后文化扩散的免疫组织化学染色标记Ki67(克隆MIB-1, 1μg / mL, DAKO)和β人类绒毛膜促性腺(克隆h - 298 - 12, 1: 10, bioprime / biologo)免疫组织化学部分中所述。Batimastat治疗和控制外植体显示增殖的细胞滋养层和合成β人类绒毛膜促性腺合胞体滋养层。此外,Batimastat治疗效应进行了分析并与DMSO控制测量乳酸脱氢酶(LDH)释放活动文化的上层清液用LDH细胞毒性检测设备(豆类生物公司,eubio,维也纳;奥地利)根据制造商的协议。得到吸光度值归一化总蛋白质的各自的外植体匀浆和DMSO控制设置为1。

2.8。基因表达分析

滋养层和胎盘组织的总RNA分离使用基于列的RNA隔离设备(SV总RNA隔离系统、Promega)包括一个列DNase治疗的步骤。质量检查后,总RNA进行基因表达定量分析使用一步法rt - pcr试剂盒(试剂盒)和预先设计表达式分析fractalkine (Hs_CX3CL1_QF_1 QuantiFast探测试验,试剂盒)根据制造商的指示。总之,100 ng总RNA样本混合反应总额的20个套件组件μl . 96 -孔板样品进行了分析一式三份(罗氏诊断)和Bio-Rad CXF96实时PCR系统。循环条件包括逆转录20分钟C,一个初始PCR激活步骤为5分钟C,和随后的两步骑自行车与变性为15秒C和退火/扩展为30年代C总共40周期。Ct值被大型经理CFX 2.0软件自动生成(Bio-Rad)和基因表达的相对量化计算标准ΔΔCt法使用的表达beta-2-microglobulin (Hs_B2M_QF_2 QuantiFast探测试验,试剂盒)作为参考。B2M验证与其他参考基因的表达相比,核糖体蛋白翻译(Hs_RPL30_QF_1 QuantiFast探针测定),次黄嘌呤phosphoribosyltransferase 1 (Hs_HPRT1_QF_2 QuantiFast探针测定),和18 s rRNA (Hs_RN18S1_QF_2 QuantiFast探针测定)和显示没有明显的发育和细胞分化相关的变化。

2.9。免疫印迹

胎盘绒毛组织彻底清洗PBS和均质里帕缓冲区使用组织均质器包括蛋白酶抑制剂的鸡尾酒。蛋白质浓度测定后根据Lowry et al ., 60μ应用g总蛋白和分离预制10% Bis-Tris凝胶(NuPAGE Novex;英杰公司)。100 ng重组人类完整fractalkine (rhCX3CL1 / fractalkine、研发系统)应用积极的控制。电泳之后,半干的蛋白质0.2的印迹μ硝化纤维素膜(Trans-Blot Bio-Rad实验室)。印迹效率取决于染色膜与朱红色年代的解决方案(西格玛奥德里奇)。Immunodetection进行化学发光Immunodetection工具包(西方的微风;英杰公司)根据制造商的指示。单克隆反CX3CL1 / fractalkine抗体(81513年克隆,研发系统)被稀释在屏蔽解决方案1:500 (1)μg / mL工作浓度)和应用于膜在一夜之间c .标准化膜被孵化的单克隆anti-beta肌动蛋白抗体(1:20.000;克隆AC-15 Abcam,剑桥,英国)。图像获取FluorChem Q系统(αInnotech细胞Bioscienes,圣克拉拉,CA,美国)和带密度进行了分析SA软件3.4.0α视图。每个组织匀浆在三个独立的免疫印迹实验进行了分析。结果给出的比例相对fractalkine和beta-actin乐队密度,与前三个月样本集。

2.10。Fractalkine ELISA

Fractalkine测定细胞培养上清液和细胞溶解产物以及组织匀浆使用定量夹心酶免疫分析法(人类CX3CL1 / Fractalkine Quantikine ELISA,研发系统)。细胞培养上清液在×1.500 g和离心机C为5分钟。细胞溶解产物和胎盘外植体匀浆在×8.000 g和离心机C 10分钟。100年离心后μL清晰的浮层受到分析根据制造商的指示。完全培养基培养没有细胞里帕缓冲区作为空白fractalkine测量条件上层清液和细胞溶解产物,分别。样品重复测量,获得fractalkine浓度归一化总细胞蛋白质或总组织蛋白,分别在溶菌产物决定根据洛瑞的方法。

2.11。统计分析

数据分析使用SigmaPlot 12.5±SEM和提出了手段。数据受到正常测试(Shapiro-Wilk测试)和方差相等测试。正态分布的数据组之间的差异使用双尾进行了测试t以及。否则Mann-Whitney等级和测试应用。一个小于0.05被认为是具有统计学意义的价值。

3所示。结果

3.1。时空Fractalkine表达在人类胎盘

免疫组织化学染色的人类早期妊娠胎盘部分本地化fractalkine顶端microvillous等离子体膜的合胞体滋养层(图1(一))。胎儿的内皮、绒毛细胞滋养层和extravillous滋养层细胞不表达fractalkine(数据列1(一)和1 (b))。在早期妊娠蜕膜fractalkine顶端质膜的检测子宫腺上皮细胞(图1 (c))。子宫螺旋动脉和静脉显示内皮染色(数字1 (c)和1 (d))。在人类术语发现胎盘fractalkine顶端质膜的合胞体滋养层(图1 (e))。没有染色观察胎儿血管内皮的终端绒毛,绒毛(数字1 (e)和1 (f))。

了解假定的变化在妊娠的胎盘fractalkine表达,胎盘组织分析了在妊娠前三个月和术语。定量基因表达分析显示(±0.9)15.1倍增加胎盘fractalkine mRNA表达术语,相比前三个月(图2(一个))。在蛋白质水平,胎盘fractalkine免疫印迹检测到的前三个月和术语胎盘组织匀浆,与重组90 kDa全长fractalkine,担任积极控制(图2 (b))。与定量基因表达分析相比,免疫印迹的半定量的乐队微显示只有1.7倍(±0.1)增加胎盘fractalkine到期,前三个月相比(图2 (c))。

3.2。Fractalkine表达式在滋养层细胞行BeWo滋养层和基本术语

免疫组织化学显示胎盘的主要来源的合胞体滋养层fractalkine表达式。为了证实这一发现滋养层细胞行BeWo,绒毛滋养层人口接受模型,显示怀孕特有的荷尔蒙的分泌以及syncytialization好,也就是说,滋养层的形成合胞体在体外(20.),检测其表达和释放趋化因子的能力。当基底fractalkine mRNA的表达很低但在未经处理的BeWo细胞检测,与forskolin孵化,已知试剂诱导BeWo细胞分化和syncytialization21),导致了与时间有关的增加随着时间的22.1倍(±1.6)upregulation相比,车辆控制后48 h(图3(一个))。Forskolin诱导fractalkine BeWo细胞表达伴随着释放可溶性fractalkine增长9.8倍,占2.91 (±0.34)ng / mg细胞蛋白质48 h后孵化(图3 (b))。

因为滋养层细胞系可能在某些方面不同相比,他们的主要对手(22),主要自发形成合胞体滋养层显示在体外(23)被孤立词胎盘释放可溶性fractalkine和测试的能力。分析主要术语滋养层的浮层显示连续释放可溶性fractalkine,这增加了39.5%的孵化24小时和48小时之间(图3 (c))。

3.3。抑制胎盘Fractalkine Metalloprotease抑制剂Batimastat释放

数据从滋养层文化提供了强有力的证据,fractalkine不仅是表达也释放绒毛滋养层。胎盘fractalkine数据发布以来几乎没有描述到目前为止,它是容易测试如果前面描述metalloprotease机制介导的跨膜形式也适用于人类的胎盘,也就是说,人类的滋养层。为此释放可溶性fractalkine首次分析了forskolin BeWo细胞治疗存在和缺乏metalloprotease抑制剂Batimastat,曾被证明能够有效地阻止fractalkine脱落等其他细胞的平滑肌细胞和肝星状细胞(24,25]。孵化与5μ米和10μM Batimastat释放可溶性fractalkine下降67.1%和91.6%,分别比细胞没有抑制剂治疗后48 h(图4(一))。分析细胞溶解产物从forskolin刺激BeWo细胞孵化有或没有Batimastat透露,抑制可溶性fractalkine释放伴随着增加3.1倍fractalkine相关的细胞相比,控制48 h后(图4 (b))。以确保观察影响不是由于细胞生存能力的变化,Batimastat治疗和控制细胞进行了分析使用一个基于MTS的可行性分析。因此,Batimastat治疗轻微但不显著下降的相对数量可行的控制相比BeWo细胞增殖4.3%后48 h(图4 (c))。

形势BeWo细胞中观察到的是至少部分反映在外植体培养人类的前三个月和胎盘。在妊娠前三个月胎盘外植体,Batimastat释放可溶性fractalkine下降17.8%后5天文化,没有达到统计学意义。然而,分析各自的组织匀浆显示显著增长了1.6倍的组织相关fractalkine外植体与Batimastat孵化,相比控制(图5天之后5(一个))。外植体在人类胎盘,孵化与Batimastat显示大量可溶性fractalkine释放减少56.3%,同时组织相关的分数fractalkine增加1.5倍相比,控制(图5 (b))。比较控制从怀孕前期和术语外植体实验显示增加5.0倍fractalkine发布的组织以及相关术语。然而,发布和组织相关的比率fractalkine保持不变,为2.1在妊娠前三个月和胎盘外植体,建议本构胎盘fractalkine脱落。

为了确定任何细胞毒性Batimastat对胎盘外植体的影响,LDH的释放到培养基进行了分析文化和显示轻微但无意义的增加8.5%和10.4% Batimastat治疗后的前三个月和外植体,分别相比,控制(图5 (c))。

4所示。讨论

fractalkine的双重特性的概念,作为可溶性chemoattractive因素和跨膜粘附分子,可以申请fractalkine表达在人类胎盘。数据从胎盘外植体和滋养层文化提供了强有力的证据表明胎盘fractalkine由释放观察合胞体滋养层进入母体循环通过metalloprotease脱落的依赖。当推测一个假定的角色的剥离胎盘fractalkine母婴相声,影响胎盘开发应考虑的重要方面。在怀孕早期灌注intervillous空间与母体血液尚未完全建立,从而剥离胎盘fractalkine不得上本地产妇CX3CR1表达细胞,而是以一种内分泌的方式。在这一过程中,胎盘派生fractalkine描述的低品位系统性炎症反应可能导致发生在怀孕第三阶段(26- - - - - -28]。这种假设是在良好的协议与提高表达和释放胎盘fractalkine术语。

轻度炎症反应提出了促进孕产妇代谢变化,导致胰岛素抵抗和hyperlipidaemia容纳胎儿日益增长的能源需求增加。贡献的胎盘fractalkine孕产妇妊娠期间可溶性fractalkine池很难估计,应该包括整个表面的胎盘绒毛在学期大约12 - 15米²相比只占一个很小的区域约4000 - 7000米²血管内皮的孕产妇(1,29日]。表达分析其他促炎细胞因子,如肿瘤坏死因子-α、il - 6、il - 1α,il - 1βpreeclamptic和正常胎盘外植体,显示没有区别,暗示,而边际贡献的胎盘细胞因子系统性炎症(30.]。

根据胎盘外植体实验,棚膜结合fractalkine似乎之间的比率保持不变的前三个月,直到术语,但是这可能是受到基因表达等参数的影响,半衰期的变体,metalloprotease脱落的依赖。在细胞治疗的现象增加膜结合fractalkine Batimastat解释为是一个积累的膜结合形式由于受损脱落活动在细胞表面(24,25]。由于脱落是由disintegrin和metalloprotease(亚当)10和ADAM17 [8,9),都能被探测到的合胞体滋养层,人们很容易推测这些metalloproteases的异常活动及其结果在病理妊娠胎盘fractalkine的释放。有趣的是,表达式的metalloproteases已被证明是在增加从妊娠并发子痫前期胎盘31日,32),建议增加胎盘fractalkine的脱落和释放。这种假设是符合最近的一个病例对照研究,显示升高血浆浓度的可溶性fractalkine与子痫前期(女性33]。然而,子痫前期是否伴随着释放增加胎盘fractalkine依然开放,需要进一步深入研究。

检测fractalkine表达在子宫腺上皮细胞是在良好的协议与以前的研究显示fractalkine顶端区域的主动分泌腺的腺上皮非孕子宫内膜蜕膜(月初以及34]。当推测fractalkine释放通过子宫腺的生理功能应考虑早期植入过程,扩大合胞体滋养层的入侵不仅子宫毛细血管,而且子宫腺体,导致后者和intervillous空间之间的连接。这种情况下可以观察到从大约一天17怀孕后在妊娠前三个月,表明腺分泌产品的交付,包括营养、生长因子、免疫调节细胞因子到intervillous空间在第一和第二学期初(35,36]。最近,腺上皮细胞的替代所谓endoglandular滋养层被建议作为额外的开放机制和子宫腺向intervillous空间的连接(37]。因此,子宫腺体与日益增长的合胞体滋养层可能导致胎儿的连续版本fractalkine intervillous空间,也就是说,母亲的等离子体。在这个阶段怀孕的自分泌信号通过胎盘fractalkine可能不会完全被排除在外,因为汉纳等人的一项研究显示弱CX3CR1染色在人类妊娠早期胎盘绒毛滋养层的一层(16]。然而,正在进行的派生fractalkine妊娠胎盘自分泌的影响可能会被忽视,CX3CR1只能发现在胎儿内皮而不是绒毛滋养层舱在术语18,38]。

虽然胎盘fractalkine贡献作为可溶性因子低品位的系统性炎症反应,母亲,其作为膜结合趋化因子位于胎盘绒毛的表面很不清楚。孕产妇白细胞的粘附合胞体滋养层可能会考虑为所有人-是非常罕见的事件在正常怀孕。然而,机制防止CX3CR1表达母性白细胞绑定合胞体滋养层仍然投机。具体聚糖,如sialyl路易斯X和刘易斯在糖基化的蛋白质,如hCG,最近建议发挥作用在防止孕产妇白细胞粘附滋养层39]。然而,在病理条件下膜结合fractalkine可以促进粘附和轮回的孕产妇白细胞通过绒毛滋养层层引起孕产妇免疫细胞内积累绒毛发炎,被描述为传染性villitis和villitis病因不明的40- - - - - -42]。

5。结论

人类胎盘来源的趋化因子fractalkine合胞体滋养层中表达和释放进入母体循环依赖metalloprotease脱落。的表达和释放增加胎盘fractalkine可能导致低品位系统性炎症反应在怀孕后期的正常怀孕。异常胎盘metalloprotease活动不仅会影响胎盘的释放派生fractalkine但可能同时影响的膜结合形式的丰富趋化因子。

利益冲突

作者宣称没有利益冲突有关的出版。

确认

作者感谢莫妮卡Sundl(研究所细胞生物学、组织学和胚胎学、格拉茨医科大学的奥地利)和wallfisch Michelmayr海蒂Miedl(格拉茨医科大学的妇产科学系,奥地利)为他们的优秀的技术援助在细胞分离和细胞培养工作。早期妊娠胎盘组织是由Andreas Glasner博士提供。支持m . Gauster奥地利科学基金(FWF): P23859-B19。j . Kremshofer和j·比利奇在分子医学博士项目资助的格拉茨医科大学的。