文摘
慢性酒精滥用是增加对感染的易感性受伤后,部分由于巨噬细胞功能的修改。几种细胞内信号机制参与炎症反应的起始,包括核因子-κB (NF -κB)途径。在这项研究中,我们调查了系统性和肝脏的影响慢性乙醇喂养在活的有机体内激活NF -κB在NF -κBEGFP报告基因的老鼠。具体地说,这项研究主要针对枯氏细胞促炎细胞因子il - 6和TNF -α和激活的NF -κB在慢性乙醇喂养紧随其后在体外刺激与脂多糖(LPS)。我们发现慢性乙醇调节NF -κB激活和增加肝和系统性的促炎细胞因子水平。同样,LPS-stimulated il - 1β释放在ethanol-fed小鼠全血明显增强。然而,有限合伙人显著增加il - 6和TNF -α的水平。这些结果说明慢性乙醇喂养可以提高巨噬细胞的响应性LPS-stimulated il - 6和TNF -α生产表明,这种效应可能导致胞内信号通过NF - ethanol-induced更改κ此外,有限合伙人和TNF -α刺激了基因表达不同的炎症介质,在某种程度上,在NF -κB-dependent方式。
1。介绍
每个第五病人在医院接受治疗有酗酒的历史(1),据估计,英国大约有1100万人经常有一个酒精中毒(2),酒精性肝病(ALD)是一个重要的创伤和选择性外科手术后结果的因素(3,4]。有趣的是,慢性但不是急性酒精滥用造成不利影响的结果至少在创伤患者(1,5),此外,约20%的酗酒者肝纤维化和随后的肝硬化发展(6]。与适度饮酒的有益作用,最重要的是红酒,即减少心血管疾病的报道7,8),这些患者应对并发症如高血压、中风和增加对感染的易感性。在这些患者普遍认为菌血症的血液是导致肝损伤的主要原因之一。
慢性酒精滥用是已知的导致肠粘膜层的破坏,导致渗透率增加gut-derived细菌(9- - - - - -13]。一旦在肝脏,内毒素(LPS)的一个组成部分革兰氏阴性细菌的墙壁上,结合toll样受体4 (TLR4)和影响一个细胞内的信号级联导致NF -κB激活,进而导致肝毒素的释放肿瘤坏死因子-α(14,15]。
另一种机制,造成肝损伤,肝固着枯氏细胞的激活。各种后续反应导致细胞损伤的存在,尤其是在这项研究中生成和释放活性氧(ROS)和促炎介质(13,16- - - - - -20.]。前者发生跨膜NADPH氧化酶的催化活性superoxideanion,乙醇代谢的中间,胞质NADPH氧化酶(9,21]。枯氏细胞不仅表达各种受体吞噬,但激活,还生产多种炎症介质(如。,interleukin-1β(il - 1β)、白介素、肿瘤坏死因子-α(肿瘤坏死因子-α),主要是由TLR4信号。TLR4通路下游导致激活转录因子,如核因子-κB (NF -κB)。
NF -κB可以作为早期转录因子通过调节基因表达不需要de novosynthesis。在大多数细胞位于细胞质中潜在的不活跃的我κB-bound复杂和p50 / p65异质二聚体(22]。NF -κB-activating代理可以引起我的磷酸化κB抑制蛋白质,针对他们通过ubiquitin-proteasome快速降解途径和释放NF -κB进入细胞核,调节基因表达(23,24]。
在目前的研究中,我们希望确定哪些角色NF -κB在ethanol-induced肝损伤激活枯否细胞中而且在慢性乙醇喂养。因此,我们使用了NF -κB增强EGFP增强型绿色荧光蛋白报告基因老鼠。第二个进球我们实验试图探讨乙醇预曝光的影响(在活的有机体内枯氏细胞的反应性在体外有限合伙人的挑战。
2。材料和方法
男性顺式NF -κ 报告基因小鼠和C57BL / 6小鼠慢性暴露EtOH摄入量。持续4周pair-feeding政权后,肝组织样本被送往测量脂肪变性、组织病理学变化,NF -κB活动,释放促炎细胞因子和炎症NF -的表情κ目标基因。血液样本被送往衡量系统性细胞因子(MCP-1, il - 6和TNF -α)、AST(天冬氨酸转氨酶)和白细胞表面标记物的表达(CD11b)和NF -κb在另一个实验方法,为枯氏细胞的隔离肝脏灌注是ethanol-fed (EtOH)和pair-fed老鼠,随后与LPS刺激或TNF -α,分别。细胞因子(il - 6、TNF -α),炎症NF -κB目标基因,CD11b受体密度和CD68(清道夫)和NF -κB在枯氏细胞数量测定。
2.1。动物
男性独联体nf -κ 小鼠C57BL / 6(背景)被基督教Jobin友情提供,教堂山,数控、美国、和培育在无菌条件下显示和诊断(Wendelstein,德国)。在这个基因靶向鼠标应变,EGFP表达的转录控制下NF -κB独联体元素;因此NF -κB绑定导致转录EGFP的25]。在年龄6 - 8周,体重20 - 25克,他们交付给我们的动物设施。特定的无菌野生型(WT) C57BL / 6 j小鼠(Le Genest-Saint-Isle Janvier,法国)作为控制。所有的动物都被安置在不同的个体,filter-top笼子里的空气流通,光线(12 h光/ 12 h黑暗周期),和温度控制房间免费获取食物和水。动物协议区域市政局的兽医部门批准在达姆施塔特,德国。
2.2。实验模型
慢性乙醇喂养协议:小鼠适应于我们的设备到达后7天,被随机分成,然后分配给一个四周pair-feeding政权标准Lieber-DeCarli饮食(Ssniff Spezialdiaten;所以,德国)补充与麦芽糊精(对照组)或6.3%乙醇(卷/卷)(EtOH集团)26,27]。Ethanol-fed老鼠被允许自由进入EtOH-supplemented饮食。摄入饮食的数量确定和同等体积的maltodextrin-supplemented饮食提供pair-fed动物。因此,等热量的供给每个鼠标是必要的。在选定的实验老鼠标准实验室,控制Lieber-DeCarli饮食的影响。作为对EtOH啮齿动物自然有一种厌恶,这个实验的老鼠被喂食液体饮食,逐渐增加剂量的EtOH从1.75% (v / v)为5天,然后增加剂量至2.63%,3.5%,4.38%,最后6.3% (v / v)。这个方案反映了人类的慢性酒精滥用,开始卷和增加较低。动物准备:牺牲和组织和血液样本的收集:经过28天的喂养利DeCarli饮食小鼠体重和异氟烷麻醉(久远的异氟烷,雅培公司;德国威斯巴登)1.5升/分钟的连续流一个面具。剖腹手术后进行灭菌的腹部和胸腔70% EtOH通过正中切口1到2厘米以上后腿和持续的胸骨,紧随其后的是一个水平切口在胸腔两侧的结局。 A 24-gauge needle was inserted in the IVC (inferior vena cava) and whole blood was withdrawn and collected. After disrupting portal vein, liver was perfused with Ringer’s solution, excised, and weighed to determine the liver/body ratio. After removal of the gall bladder, a section of the liver’s median lobe was embedded in Tissue-Tek O.C.T Compound (Sakura Finetek; Helsinki, Finland) for cryosections. Then the left lobe was infused and fixed with 4% buffered Zn-Formalin and subsequently embedded in paraffin, sectioned (7 μ米),沾hematoxylin-eosin(他)。剩余肝脏叶切成小块,在液态氮snap-frozen,储存在−80°C的后续检查。在另一个实验方法中,肝脏灌注了冰冷的汉克的缓冲盐溶液(哈佛商学院;Gibco;w / o Ca2 +和毫克2 +)5分钟从乙醇-枯氏细胞的隔离,一对和chow-fed老鼠。切除胆囊后,肝脏被转移到无菌培养皿中包含哈佛商学院(w / o Ca2 +和毫克2 +)放在冰直至另行准备。
组:见下表1。
2.3。枯氏细胞制备和文化
隔离从肝组织全国人大(nonparenchymal细胞):枯氏细胞的准备切除肝脏组织轻轻切成小块,约2毫米×2毫米在培养皿中冰,和洗50毫升锥形管在寒冷的哈佛商学院(w / o Ca2 +和毫克2 +),直到上层清液是清楚的。替换在培养皿中冰后,肝脏标本切碎的进一步精细使用手术刀和捣碎的10毫升注射器的柱塞。组织分为2部分;每个被C管(Miltenyi研究;Bergisch格拉德巴赫,德国),随后在15毫升resuspended酶混合(50毫克/毫升胶原酶IV, 100 u /毫升DNaseI CaCl 5毫米2和哈佛商学院96毫升(w / o Ca2 +和毫克2 +)]。tissuse是分离轻轻地用温柔的mac电脑,程序老鼠肝脏(修改:“m_liver_01.02”, 73年代),其次是孵化在37°C水浴搅拌模式设定为15分钟的最高速度。后重复机械离解如上所述紧随其后的是另一个孵化步骤15分钟在水浴搅拌模式设置在最高速度,组织是完全分离的。Homogenizate通过无菌尼龙70μm细胞过滤器(BD生物科学;德国海德堡),洗两次与冰冷的DMEM(补充20% FCS, 50μg / mL硫酸庆大霉素,20毫米玫瑰),汇集,最后在10毫升resuspended DMEM增刊。细胞悬浊液×17 - 21离心机在区间g 5分钟分离肝细胞和得到的上层清液从每个治疗组两只老鼠汇集。然后他们被分层仔细50% / 25%两步Percoll梯度(通用电气医疗集团;德国弗莱堡)50毫升锥形管和离心15分钟在1800×g, 4°C(制动)分离nonparenchymal细胞(npc)从薄壁组织的细胞。两个界面分数包含主要枯氏细胞转移到DMEM增刊。,洗两次,resuspended 1毫升DMEM增刊。确定细胞数量和生存能力通过台盼蓝排斥,并发现~ 95%。浓缩的F4 /枯氏细胞从人大部分:选择F4/80积极单核细胞分数,细胞悬浮液孵化了鼠标货代阻塞试剂(Miltenyi研究)一起PE-conjugated anti-F4/80 Ab (Biolegend;美国圣地亚哥,CA) 25分钟在4°C。洗后用mac电脑缓冲区(包含2毫米EDTA, 0.5% BSA在PBS (w / o和),细胞磁贴上anti-PE微(Miltenyi研究)在4°C和洗15分钟mac缓冲区。F4/80+细胞被分离到顺序列通过积极选择使用mac系统(Miltenyi研究)根据制造商的建议。洗出液(F4/80+细胞),流过(F4/80- - - - - -收集细胞)和纯度的磁选是由流仪分析FACSCalibur (BD生物科学;德国海德堡)。此外孤立的细胞活力评价7-AAD染色(BD生物科学)。孤立的枯氏细胞在DMEM增刊停牌。和镀到24-well文化板块。2 h后媒体被移除不依从细胞所取代。16小时后,细胞被刺激或不与有限合伙人(10μg / mL;σ;德国Deisenhofen)或TNF -α(500 ng / mL;研发系统)、2、4,分别或24小时。
2.4。测量脂肪变性乙醇喂养后和血清酶水平
检测到血清天冬氨酸转氨酶(AST)使用干化学分析仪(Spotchem EZ;Arkray、菲律宾)。脂肪含量定量确定通过索氏提取技术所描述的其他地方(28]。总之,干和粉肝组织样品称重,然后放置在一个提取顶针。石油醚作为溶剂。通过周围的水浴加热烧瓶,溶剂是煮,蒸汽通过冷凝器。而十回流周期完成,整个脂肪积累在烧瓶底部和体重。
2.5。由于慢性乙醇摄入促炎的变动分析
全血刺激试验:单核细胞活动是由全血刺激试验与评估10μg / mL内毒素(LPS)大肠杆菌0127:B8(σ)RPMI 1640中(σ)和孵化24小时37°C和5%股份有限公司2。消极的控制缺乏执行有限合伙人为每一个分析。后来,血细胞被离心沉淀(2000×g, 10分钟)和上层的收集和储存在−80°C。的il - 1β使用Quantikine鼠il - 1浓度监测β酶联免疫试剂盒制造商的指令(研发系统)。细胞因子水平的量化:释放il - 6, MCP-1, TNF -α在等离子体或文化上层清液用流式细胞术测定FACSCalibur (BD生物科学;MCP-1,德国海德堡)和小鼠il - 6和TNF -αFlex集按照制造商的指示仪珠阵列(BD生物科学)。肝il - 6的浓度的蛋白质溶解产物提取snap-frozen肝组织样本测定使用Quantikine Mouse-IL-6按照制造商的指示酶联免疫试剂盒(研发系统)。分析了ELISA 96孔微量滴定板使用标Bio-Tek谷神星UV900C (Bio-Tek;美国佛蒙特Winooski)。测定EGFP在循环中性粒细胞和CD11b细胞表面表达:流式细胞仪进行检测NF -κB表面增强型GFP和CD11b表达白细胞,其他地方的详细描述(29日]。简而言之,RBC-depleted外周血细胞沾anti-CD11b-PerCP-Cy5.5 (BD生物科学)。洗后用PBS包含0.5%的牛血清白蛋白,细胞分析FACSCalibur (BD生物科学)。多形核中性粒细胞(PMNLs)被确定向前/散射特性(R2,图1(一))。EGFP (FL-1)与CD11b (FL-3)同形像控制算法(图1 (b):pair-fed;图1 (c):EtOH-fed)。数据分析是使用CellQuest Pro (BD生物科学)。
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2.6。的可视化独联体nf -κBEGFP转录诱导肝组织
EGFP在组织标本独联体nf -κ 老鼠被显微数字化检测。组织样本固定10% Zinc-Formalin 24 h和石蜡包埋。部分被削减5μm和EGFP表达可视化的FITC反射器通过使用Axio观察者Z1(卡尔蔡司缩微成像;德国耶拿),为每个数据点相同的曝光时间。本地化和NF -细胞表达模式的激活κB / GFP被免疫细胞化学进一步评估。肝脏部分是固定的,切,然后用anti-GFP孵化所述抗体(1:400年,60分钟,RT;Abcam;英国剑桥大学)。一个anti-rabbit辣根过氧化物酶连接二次抗体(RT 30分钟;Histofine;Nichirei、东京、日本)和diaminobenzidine(过氧化物酶想象装备,DakoCytomation;德国汉堡)是用于检测特定的绑定,其次是与苏木精复染色。
2.7。检测NF -κB激活枯氏细胞
石蜡包埋的肝脏部分(5μ米)是deparaffinized和水化。巨噬细胞是可视化使用anti-F4/80-PE单克隆抗体(Biolegend;美国圣地亚哥,CA)稀释1:100年磷酸盐(pH值7.4)包含1%的牛血清白蛋白1 h。与PBS洗涤后,核与安装中包含1.5复染色μg / mL DAPI(向量实验室;伯林盖姆、钙、美国)。荧光可视化使用多通道荧光捕获与反射镜DAPI-DNA(核),FITC (EGFP),和若丹明(F4/80) Axio观察者Z1显微镜(卡尔蔡司缩微成像;德国耶拿)。代表图像捕获从10个随机领域相同的曝光时间为每个数据点(×400)。
2.8。分析枯氏细胞亚型Coreceptors染色的特点
与Percoll等密度的离心后,收集细胞悬浮液的一部分(~细胞)是沾的组合fluorochrome-conjugated抗体CD11b、CD68、和F4/80: F4/80-PE (Biolegend) CD11b-PerCP-Cy5.5 (BD生物科学)和CD68-Alexa萤石684 (AbD Serotec)。Fluorochrome-labeled同形像相同的抗体作为控制。在4°C 25分钟的孵化后,细胞被洗了,枯氏细胞亚型的比例和数量的NF -κB激活(EGFP FITC通道)测定使用FACSCalibur流式细胞分析仪(BD生物科学)。
2.9。量化的NF -κB在LPS刺激激活枯氏细胞
确定的比例NF -κB激活枯氏细胞,2 h, 4 h,或24 h,分别LPS刺激后,EGFP+(绿色),F4/80+(红色),colabeled(橙色)细胞数。荧光是使用多通道荧光可视化。图片拍摄与反射镜FITC (EGFP)和罗丹明(F4/80) Axio观察者Z1(卡尔蔡司缩微成像)。代表图像捕获从10个随机领域相同的曝光时间为每个数据点(×400)。
2.10。调查的炎症基因表达NF -κB目标基因Ethanol-Fed枯氏细胞的小鼠在有限合伙人和TNF -α挑战
检查TNF的表达αil - 6,矩阵metalloproteinase-9 (MMP-9) CXCL-1, NOS2,总RNA提取使用RNeasy-system(试剂盒;希尔登,德国)根据制造商的指示,在收集的上层清液LPS刺激枯氏细胞。剩下的残留大量的DNA被使用RNase-Free DNase根据制造商的指令集(试剂盒)。质量和数量的RNA测定光度计的使用NanoVue +设备(通用电气医疗集团;德国慕尼黑)。随后进行逆转录Omniscript(试剂盒;希尔登,德国)使用AffinityScript PCR cDNA合成装备(Stratagene;美国拉霍亚,CA)。qRT PCR反应进行使用Stratagene MX3005p QPCR系统(Stratagene)与特定的目标基因的引物(表2)和18 s核糖体RNA基因作为参考,所有从公司购买生物科学(SuperArray;美国马里兰州弗雷德里克)。PCR反应混合物(25μ使用1 x L)进行RT2SYBR绿/火箭qPCR大师混合(SA)生物科学)根据制造商的指示。放大的cDNA开始10分钟的变性在95°C紧随其后40周期15变性在95°C和60年代退火/扩展60°C。熔化曲线分析应用于控制放大产品的特异性。每个目标的相对表达基因的mRNA水平然后使用比较threshold-cycle计算(CT)方法(方法)。总之,目标mRNA在每个样本的数量第一次被规范化的18 s核糖体信使rna给ΔCT然后校准器从stimulation-Ctrl获得样本组组成。相对目标基因的mRNA表达了褶皱增加计算与刺激控制正常化后(媒介)18岁核糖体RNA。
2.11。统计分析
数据提出了均值±SEM(平均数标准误差)。一个值小于0.05被认为是显著的。差异意味着是由单向方差分析(方差分析)其次是Student-Newman-Keuls测试作为一种事后测试多个比较。
3所示。结果
3.1。由于乙醇喂养肝损伤
喂养的乙醇包含利DeCarli饮食28天增加了肝脏相对重量(肝/体重比值与,;图2(一个))。量化干整个肝组织透露的脂肪含量与对照组相比增加(,图2 (b))。EtOH喂养导致血清AST海拔U / L pair-fed老鼠相比,(,图2 (c))。喂麦芽糊精含有Lieber-DeCarli饮食同样揭示了影响上述生理肝脏标记作为常规食物饮食喂养。这些结果证明的有效性对喂食的方法来研究乙醇的影响而equicaloric条件是维护和没有肝引起的变化包含饮食的麦芽糊精。
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3.2。乙醇的影响饮食在本地和系统性炎症反应
慢性EtOH喂养系统性炎症反应引起的,由循环的il - 6水平,MCP-1, TNF -α。il - 6的浓度上升明显EtOH-fed组相比,对照组(与pg / mL,分别;图2 (f))。同样的效果观察MCP-1水平(与pg / mL,;数据未显示)以及TNF -α(与pg / mL,;数据未显示)。有趣的是,慢性EtOH摄入引起了当地肝il - 6版本相比pair-fed小鼠EtOH-free饮食(与(pg / mL) /毫克的蛋白质,;图2 (g)性脂肪肝(图),但没有组织病理学证据2 (e))。
LPS-stimulated单核细胞因子生产:在体外生产的il - 1β在全血在ethanol-fed更高独联体nf -老鼠相比pair-fed控制LPS刺激后,与普通食物饮食的老鼠(与pg / mL;;数据未显示)。
乙醇喂养影射外周血中性粒细胞:慢性EtOH摄入量多形核白细胞(PMNLs)激活循环的流式细胞仪分析。先决条件的表达通过内皮细胞表面标记迁移,整合素的Mac-1 (CD11b / CD18),代表NF - EGFP的表达κ激活,在采集外周血样本进行调查慢性乙醇喂养。对喂养后,只有0.3%的PMNLs显示coexpression CD11b / CD18和EGFP这部分乙醇预处理后显著上升到7.7%。总EGFP表达增加ethanol-primed CD11b+PMNL(图3 (c))。
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3.3。加剧的表达独联体nf -κBEGFP在肝组织中
评估的时间和地点具体代表站点的NF - EGFP的表达κB激活后慢性酒精滥用,石蜡包埋显微数字化肝脏部分进行了分析。增加了NF -κB转录活动存在于EtOH治疗小鼠(图4 (b)比pair-fed老鼠(图)4(一))。偏见消除了从肝自体荧光免疫染色肝部分再次anti-GFP抗体和乙醇喂养后GFP在场(数字4 (c)- - - - - -4 (f))。此外,组织与F4/80应用识别老鼠巨噬细胞,主要是肝固着枯氏细胞。对喂养后,只有F4/80积极枯氏细胞被发现而乙醇喂养后,细胞的比例coexpressing EGFP和F4 /导致一个黄色荧光主要是高架(数据类型4 (g)和4 (h))。有趣的是,在ethanol-fed老鼠,EGFP-positive枯氏细胞主要位于门静脉周的和midzonal地区,而EGFP-positive肝细胞可以发现主要在中心周围的和midzonal区域。这些观察表明,ethanol-containing饮食影响的数量和NF -地形κB活化肝细胞和巨噬细胞。
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3.4。表达CD11b和CD68 F4/80+枯氏细胞
新孤立枯氏细胞表现出显著的表面表达CD11b和CD68表达的受体小鼠巨噬细胞从ethanol-fed(表更明显3)。
3.5。NF -κB在枯氏细胞是由乙醇喂养和激活在体外LPS刺激
NF -κB在孤立的KC激活增强后慢性乙醇喂养相比,pair-fed老鼠(如果Ctrl:图5(一个),如果EtOH:图5 (b))。两对饮食喂养和乙醇后,激活KC的比例在很大程度上增强在LPS刺激后4 h (Ctrl:图5 (c)EtOH:图5 (d))。有趣的是,与激活NF - KC的百分比κB不进一步增加在LPS刺激后24 h(图5 (e))。
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3.6。NF -κB在枯氏细胞活化与释放促炎细胞因子有关
分析枯氏细胞的炎症可能获得ethanol-fed老鼠和一对chow-fed控制,我们测量几种细胞因子的浓度,在上层清液2 h, 4 h, 24小时后内毒素刺激。il - 6发布最高24 h后有限合伙人和EtOH饮食(图6(一));肿瘤坏死因子-α有限合伙人治疗后升至最高级别2 h和EtOH喂养(图6 (b))。再一次,细胞因子的生产枯氏细胞与麦芽糊精增强利DeCarli饮食的老鼠没有什么区别与普通食物饮食的老鼠。这些结果表明,增加NF -κB激活KC是增加生产的炎性细胞因子,对喂养的Lieber-DeCarli饮食是一个有价值的工具来分析甚至单个细胞细微变化结果子集,可以转移到动物与标准粮食品。观察控制两组无显著差异。
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3.7。有限合伙人,Ethanol-Induced NF -改变表达式κB和促炎基因控制
LPS刺激巨噬细胞诱导等TNF -α通过激活规范NF - mRNA的表达κB通路(22]。调查是否TNF的表达-α和其他的NF -κB ethanol-primed枯否细胞中增加相关的基因,基因表达被RT PCR进行评估。几乎所有分析基因,要么LPS刺激后(图7后)或TNF -α刺激(图8),仅显示更高的表情后乙醇喂养,结合刺激。有趣的是,与LPS刺激和TNF -α导致不同的激活模式。2 h后LPS刺激白细胞介素6和TNF -的生产α在很大程度上提升相比pair-fed控件(白介素mRNA:与肿瘤坏死因子mRNA:与,;数据7(一)和7 (b))。
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4所示。讨论
NF -κB在肝损伤和炎症中扮演不可或缺的角色为主要的结果急性和慢性乙醇消费(12,16,18,19,30.- - - - - -33]。我们的研究表明,慢性酒精滥用后的炎症反应的特点是肝巨噬细胞的活化(枯氏细胞,数字4- - - - - -8)、单核细胞(数据未显示)和PMNL(图3)和促炎介质合成的upregulation(数字2和6)。使用转基因NF -κ 小鼠模型我们存在一个强大的协会这些观察到激活的NF -κB在活的有机体内(数据3- - - - - -5)。此外,枯氏细胞(KC)激活的百分比NF -κB LPS刺激后会增加在体外ethanol-fed老鼠,这表明慢性乙醇喂养并至少在一定程度上提高KC二次刺激作出反应的能力,如孵化有限合伙人(图5)。
调查慢性酒精滥用的肝毒素的效果,我们使用一个自愿的,EtOH食饵饲养模式,在1967年第一次描述了由利和DeCarli。这种随意模型会导致脂肪变性的迹象和温和性脂肪肝10,34- - - - - -38)后,密切模拟人类慢性乙醇消费(39]。最后一个剂量的6.3% (v / v)在我们的模型中对应于35%卡路里摄入的碳水化合物35,36]。优势相比,胃内的强饲法(IG)模型是由更好的模拟慢性EtOH消费后自愿喂养,避免重复手术或胃插管,和保存连续代谢率的啮齿动物(40]。因此在我们的研究中,慢性EtOH摄入导致脂肪肝,肝体重比率增加ethanol-fed老鼠(图2)。脂肪肝也是乙醇诱导肝损伤的标志与EtOH代谢在人类肝细胞导致增生的游离脂肪酸的积累在胞质和间质空间(数字2(一个)和2 (e))。肝脏脂肪含量(图2 (b))与C57BL / 6小鼠研究[10,35]。他的肝实质染色(图2 (e))以及血清转氨酶释放(图2 (c))显示标记脂肪变性和肝细胞损伤的迹象。
增加系统释放促炎介质如il - 6、TNF和巨噬细胞化学引诱物蛋白- 1 (MCP),激活循环中性粒细胞的粘附分子如CD11b增加肝il - 6水平存在于ethanol-fed动物,明显反映肝病;然而histomorphological后遗症不在符合先前的报道使用利DeCarli-ethanol饮食(图2 (e)对比图2 (g))[34,37]。此外,乙醇喂养后激活循环白细胞的数量,coexpressed EGFP和绑定受体CD11b / CD18 (Mac1)升高(图3)。有趣的是,这些增强的EGFP表达相关的病理生理变化也反映了NF -κB激活ethanol-fed小鼠肝脏(数字4 (b),4 (d),4 (f),4 (h))。因此,NF -κB激活乙醇预处理后也出现在循环中性粒细胞,似乎与当地和系统性的NF -合成κB-dependent介质。
我们的研究结果还表明NF -κ饮食对F4/80 B-dependent启动效应的乙醇阳性巨噬细胞在肝脏(枯氏细胞);孵化有限合伙人和TNF -α很大程度上导致了夸张的炎性介质的释放和表达NF -κB-dependent目标基因(数字6- - - - - -8)。然而,差异的NF -κB积极KC是只看到4 h LPS刺激后(图5 (e))。因此,本研究提出的证据表明,枯氏细胞是一个重要的球员开始压倒性的促炎症免疫反应后慢性乙醇喂养。
尽管NF -κB是广泛接受的一个关键因素后的细胞内机制的调节慢性酒精滥用,据我们所知,没有研究直接可视化NF -κB在空间和时间上都能激活模式在肝脏和循环免疫细胞和肝。然而,功能和NF -的参与κB在不同肝细胞的数量可能会完全不同。使用NF -κ 转基因老鼠,我们可视化空间NF -κB肝nonparenchymal细胞激活这深刻而不同地形激活NF -κB在肝细胞中。EGFP表达肝细胞通常是midzonal和ethanol-fed小鼠肝脏(数据中心周围的地区4 (b),4 (d),4 (f))。肝细胞在肝脏叶的中心周围的区域参与乙醇代谢。相比之下,表现出强烈的NF -肝枯氏细胞κB后的肝门静脉周的活动和midzonal地区慢性乙醇摄入(图4 (h)),它们形成其为病原体的第一道防御细菌的分子模式(pamp),进入门户电路通过gut-liver轴,内生有关分子模式(抑制)在网站生成的无菌炎症(41- - - - - -44]。
肿瘤坏死因子- LPS刺激枯氏细胞的增加α释放,导致肝细胞细胞死亡和局部炎性介质的合成增加,如il - 6、il - 1、TNF -α(13,20.,45- - - - - -47]。在我们的研究中,从乙醇枯氏细胞预处理的峰值释放il - 6在KC刺激后24小时,而峰值TNF -α版本已经发生在2 h后刺激乙醇预处理KC(图6)。并行检测早期炎症孤立KC (mRNA表达:数据的变化7(一)- - - - - -7 (e)乙醇预处理后)也升高。这些细胞因子的表达和生产的差异可能是由于,在某种程度上,NF -激活κB在枯氏细胞自4 h (LPS刺激更大比例的EGFP积极枯氏细胞ethanol-fed老鼠都在场,一个减毒效果在LPS刺激后24 h(图5 (e))。因此,乙醇预处理KC影响细胞因子的表达和生产资料相比,控制喂动物,这种效应可能是由于激活NF -κB在枯氏细胞。有趣的是,急性乙醇中毒产生抗炎作用在复苏失血的设置19,31日,48,49]。当然是需要进一步的研究来更具体地剖析各种细胞类型的贡献后炎症反应的调节乙醇暴露。
酗酒扮演一个特定角色的病人承认紧急服务,例如,遭受创伤性损伤或大量出血,手术后或干预措施。结果和多个器官功能衰竭(MOF)的发病率或脓毒症急性乙醇中毒个人不同的慢性酒精滥用史的患者,主要是由于受损宿主反应(1,16,50- - - - - -53]。因此,创伤后24 h生存和住院死亡率在慢性酒精滥用,更糟糕的是,个人的比例,因多器官功能衰竭(MOF), 2倍的受害者是肝硬化肝脏严重醉酒的病人相比,(1]。binge-like乙醇消费后更好的结果可能是由于先天免疫细胞的激活状态。然而,慢性乙醇影响PMNL的响应性的刺激后,第二个挑战,因此导致绝大多因子的免疫反应(19]。
5。结论
综上所述NF -κB激活枯氏细胞似乎是至关重要的先天免疫系统的反应在慢性乙醇喂养。有越来越多的证据表明ethanol-primed巨噬细胞显示额外的刺激后细胞因子和趋化因子表达的改变,如外伤或内毒素。我们的数据表明,慢性乙醇喂养枯氏细胞肿瘤坏死因子-增加α发布敏感有限合伙人。这也许可以解释创伤受害者的增加对感染的易感性与慢性酒精滥用的历史。
利益冲突
作者都没有任何利益冲突有关材料。
确认
作者感谢Kerstin威廉优秀的技术援助,萨米尔El穆萨维Birgit内格尔,亚历山大Schaible, Min-Hong王。他们感谢巴克教授论文的批判阅读。独联体nf -κ 育种对基督教Jobin提供的是基于材料转让协议(美国北卡罗莱纳大学教堂山分校)。本研究由德意志Forschungsgemeinschaft LE 1346/2-1 (DFG)。