文摘

背景。研究表明剪切应力的大幅下降(SS)在雷帕霉素洗脱支架(RES)的冠状动脉。的作用目前尚不清楚在药物雷帕霉素支架后动脉,党卫军就低。因为mTOR(哺乳动物雷帕霉素靶)通路参与了抗氧化sestrins表达式,我们假设雷帕霉素衰减低SS (LSS)诱导内皮功能障碍通过mTOR和sestrin1氧化还原调控有关。方法和结果。模仿的影响LSS动脉支架后,平行板流室被用来观察LSS和雷帕霉素对内皮细胞的相互作用(ECs)。结果显示LSS显著诱导EC凋亡由预处理减轻雷帕霉素。雷帕霉素减毒LSS诱导活性氧(ROS)和活性氮物种(RNS)生产通过禁止。差别sestrin1对这些活动mTORC1和mTORC2发现逆调制LSS。抑制rictor表达式的目标小干扰RNA (siRNA)转染禁止由LSS差别sestrin1对这些,但抑制猛禽没有。结论。雷帕霉素通过差别可能禁止sestrin1对这些目标mTORC2安抚LSS EC氧化诱导细胞凋亡。我们的研究结果提供在体外证据来解释RES支架后动脉的病理生理学。

1。介绍

雷帕霉素,mTOR的特定抑制剂(哺乳动物雷帕霉素靶),土壤是一种天然产品无公害hygroscopicus [1]。雷帕霉素及其衍生物被广泛使用在雷帕霉素洗脱支架(RES)因为他们成功地预防支架内再狭窄2]。然而,雷帕霉素怀疑妥协内皮功能和诱导内皮细胞凋亡3),甚至牵连延迟药物(4- - - - - -7]。相反,其他研究人员发现雷帕霉素等细胞毒性,ECs没有逮捕ECs在G0 / G1期细胞周期不诱导细胞凋亡(8]。此外,据报道,雷帕霉素减弱高烈度、机械stretch-induced细胞凋亡在肺微血管内皮细胞(9]。因此,雷帕霉素在EC凋亡的潜力需要澄清。

低剪切应力(LSS)是一种行之有效的风险因素导致内皮功能障碍和动脉粥样硬化病变10,11]。我们之前的数据在活的有机体内研究表明,党卫军支架后冠状动脉的支架表面后显著降低植入物(12,13]。在平行流室的研究我们发现,LSS诱导内皮细胞凋亡和活性氧(ROS)的积累14]。但是,雷帕霉素的作用引起的内皮细胞氧化应激和细胞凋亡LSS仍然未知。

Sestrins小基因家族编码三个守恒的蛋白在哺乳动物中,sestrin1, sestrin2, sestrin3 [15]。Sestrins表现出氧化还原酶的活动,由p53成绩单和FoxO增加抗氧化对压力的反应16- - - - - -18]。Sestrins氧化聚合的侮辱,mTOR信号(19- - - - - -21];因此,我们假设雷帕霉素减毒引起的内皮细胞氧化应激和细胞凋亡LSS通过mTOR和sestrins氧化还原调控有关。

2。材料和方法

2.1。细胞培养

获得人类脐静脉内皮细胞(通过传代形成细胞从Cellbank中国科学院(中国上海)。大鼠主动脉内皮细胞(RAECs)是独立于男性Sprague-Dawley老鼠(南京医科大学实验动物中心,南京,中国)根据先前描述的方法(22]。动物材料的使用在这个研究符合国际生物医学研究指导原则涉及的动物。所有动物处理程序都由南京医科大学动物伦理委员会批准。细胞在DMEM培养(GIBICO)补充10%胎牛血清(GIBICO), 37°C的5%的股份有限公司2孵化器。通过5 - 8 RAECs被用于这项研究。

2.2。应用LSS

平行流室是由上海医疗器械学校(中国上海)所描述的23]。简而言之,一个两个不锈钢板之间的硅垫片,细胞融合在盖玻片上下盘和受到流体由相应的泵。党卫军2达因/厘米2在平行板表面可以通过调节体液的比例通过流室分流到坦克。

2.3。材料和试剂

雷帕霉素,DAPI 4 5-Diaminofluorescein二乙酸(DAF-2DA)和dihydroethidium(她)从Sigma-Aldrich购买。MitoSOX红色,MitoTracker红CMX ROS、试剂盒试剂获得表达载体。主要抗体phospho-mTOR (Ser2448)、mTOR phospho-p70 S6 (Thr389) p70 S6激酶,phospho-Akt (Ser473),一种蛋白激酶,Rictor,猛禽,二级抗体从细胞信号技术。反转录试剂盒和SYBR实时PCR设备来自豆类(中国大连)。终端原位缺口末端标记(TUNEL)装备购买从罗氏应用科学(印第安纳波利斯,)。

2.4。检测细胞凋亡

细胞治疗与DAPI染色的最终浓度10μg / mL显微观察前10分钟。DNA链断裂是使用TUNEL检测工具根据制造商的指示。

2.5。西方墨点法

蛋白质样品含有40μg总蛋白10% sds - page凝胶分离和转移到PVDF膜。细胞膜被化学发光孵化抗体和可视化。乐队的强度是由国家卫生研究院量化图像软件1.43 J。

2.6。检测活性氧(ROS)和活性氮物种(RNS)

RNS和活性氧的检测细胞被轻轻洗两次与PBS和哈佛商学院的解决方案包含5中孵化μmol / L DAF-2DA 30分钟,5μ摩尔/升她为20分钟,2μmol / L mitoTracker 15分钟,5μmol / L mitoSOX 10分钟37°C。图像是通过荧光显微镜和导入图像J软件固定阈值下的荧光密度和大小进行了分析。

2.7。核

Rictor和猛禽小核RNA)和控制核从Dharmacon购买。转染的ECs核(100海里)进行使用Hiperfect(试剂盒)根据制造商的指示。总之,subconfluent HUVECs被种植在盖玻片与siRNAs无血清培养基。转染24小时后,这些细胞被洗一次,与10%的边后卫在培养基培养。免疫印迹进行确认siRNA击倒的效率。

2.8。实时聚合酶链反应

核提取准备使用试剂盒试剂和量化使用Nanodrop 2000。正向和反向链的序列为人类sestrin1底漆使用转发:5′-GCATGTTCCAACATTTCGTG-3′和反向:5′-GTTCCAAATTGCCCGTCTAA-3′。对人类gapdh,引物序列5′-TGAGAAGTATGACAACAGCCTCA-3′, 5′-AGTCCTTCCACGATACCAAAGTT-3′。sestrin1基因的信使RNA水平相对于参考gapdh是由两步实时PCR。

2.9。统计数据

数据被表示为平均值±标准偏差。组织是由学生的比较 测试或单向方差分析分析。纽曼Keuls成对测试申请事后多重比较。一定程度的 被认为是显著的。一个样本 测试是用于比较mRNA表达的相对定量rt - pcr,对照组的浓度是视为一个常数1。95%置信区间不包括1被认为是显著的。

3所示。结果

3.1。雷帕霉素减轻LSS诱导内皮细胞凋亡

LSS导致HUVECs生存能力明显降低的细胞收缩和容易脱离盖玻片(图相比静态文化1(一))。雷帕霉素与100 ng / mL的浓度是30分钟前应用LSS和连续流动介质中使用120分钟。雷帕霉素保留HUVECs形状和可行性后暴露在LSS虽然雷帕霉素单独没有影响形态和HUVECs在静止状态(图的可行性1 (b))。接触流程后,凋亡RAECs DAPI染色的增加与静态和这一趋势被雷帕霉素改善。凋亡细胞并不增加了治疗的雷帕霉素在静止状态。TUNEL分析进一步证实了LSS对EC细胞凋亡和雷帕霉素(图的保护作用1 (c))。

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图1
LSS诱导EC凋亡被雷帕霉素减毒。LSS 2达因/厘米2减少引起电子商务可行性和凋亡减毒的雷帕霉素(拉伯)100 ng / mL的浓度(a) HUVECs形状变化和超然在受到LSS各个时间点。(b) HUVECs预处理与拉伯拉伯30分钟,不断发出流研究120分钟废除LSS影响细胞形状变化和超然。(c) DAPI和TUNEL染色标记凋亡RAECs(箭头显示凋亡细胞)。增加拉伯安抚LSS诱导细胞凋亡和拉伯没有对细胞凋亡的影响。酒吧规模:100μ((一)——(b)), 25岁μm (c)。
3.2。雷帕霉素减毒LSS诱导活性氧/ HUVECs RNS生产

雷帕霉素的作用改善LSS促进HUVECs线粒体ROS生产化验mitoSOX(图2(一个))。一致的结果是与她在HUVECs(图观察2 (b))。雷帕霉素减毒LSS诱导RNS积累检测到DAF-2DA(图2 (c)),这是一个探针检测过氧亚硝基的存在超氧化物(24]。荧光强度的比较表明,雷帕霉素可以减少ROS LSS(图/ RNS生产感应2 (d))。雷帕霉素单独没有影响ROS / RNS(图生产2 (e))。

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图2
雷帕霉素减毒LSS诱导活性氧/ HUVECs RNS生产。ROS / RNS积累造成的LSS 2达因/厘米2120分钟被减毒雷帕霉素(拉伯)在100年HUVECs ng / mL的浓度。(一)拉伯改善LSS促进活性氧的影响生产由mitoSOX检查。(b)与她染色观察结果一致。(c)拉伯减毒LSS诱导RNS积累DAF-2DA化验。酒吧规模:50μ((一)——(c))。(d)线图是荧光强度的统计结果和大小固定的颜色阈值显示的显著减少ROS或拉伯RNS生产+ LSS集团* ; 。(e)拉伯没有显著增加活性氧或RNS生产与车辆DMSO溶液相比, 方差分析, 。
3.3。保护从LSS雷帕霉素诱导活性氧/ RNS RAECs

雷帕霉素的作用在安抚LSS诱导线粒体ROS生产确认RAECs化验由mitoTracker(图3(一个))。保护雷帕霉素与她在RAECs(图作证3 (b))。雷帕霉素减毒LSS诱导RNS积累检测到DAF-2DA也重申RAECs(图3 (c))。荧光强度的量化分析是在列图表(图3 (d))。

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图3
雷帕霉素减毒LSS诱导活性氧/ RAECs RNS生产。ROS / RNS积累造成的LSS 2达因/厘米2减了雷帕霉素(拉伯)在100年RAECs ng / mL的浓度。(一)拉伯改善LSS促进活性氧的影响生产由mitoTracker检查。(b)与她染色观察结果一致。(c)雷帕霉素减毒LSS诱导RNS积累DAF-2DA化验。规模的酒吧:25μ((一)——(c))。(d)列图表展示了荧光强度和规模是在拉伯+ LSS组显著降低与LSS组相比, , 。
3.4。LSS Sestrin1表达减少,造成矛盾的激活mTORC1 mTORC2

研究雷帕霉素的机制缓解LSS诱导氧化细胞凋亡,抗氧化sestrin1基因表达和两种复合物的mTOR的活动,mTORC1 mTORC2,剪切HUVECs后测定。Sestrin1转录剪切HUVECs后下降2达因/厘米2120分钟与静态细胞(图4(一))。测试mTORC1活动,mTOR磷酸化Ser2448网站及其下游S6K1 Thr389磷酸化被检查。LSS应用程序后,mTOR的磷酸化Ser2448 HUVECs网站是最大限度地激活5分钟和15分钟后拒绝(图4 (b))。S6K1的磷酸化HUVECs也逐渐被LSS后瞬时激活(图4 (c))。两个激酶的活性的下降趋势线图中成立的比例相对于总激酶磷酸化激酶是量化(图4 (d))。一种蛋白激酶的磷酸化爵士473年担任mTORC2读出激活是增加了LSS(图4 (e))。向上的趋势线图(图中显示4 (f))。

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图4
LSS sestrin1表达减少,造成矛盾的激活mTORC1和HUVECs mTORC2。LSS sestrin1表达减少,造成矛盾的激活mTORC1和HUVECs mTORC2。(a)基因表达sestrin1规范化的内务gapdh基因显著降低剪切HUVECs后2达因/厘米2120分钟与静态细胞相比, ; 。(b)的免疫印迹mTORC1活动mTOR Ser2448和S6K1 Thr389磷酸化(c)的网站。(d)下面的线图表示磷酸化激酶的比率为每个剪切时间、总蛋白与静态细胞最小值设置为0。所有数据来自三个独立的实验。(e) mTORC2活动是由免疫印迹Akt Ser473磷酸化与密度分析(f) 3个独立的实验。
3.5。禁止的雷帕霉素庇护ECs LSS差别Sestrin1对这些侮辱通过mTORC2抑制

抑制rictor和猛禽表达的小干扰rna (siRNAs)被用来防止mTORC2和mTORC1组装,从而抑制其功能(图5(一个))。列图表显示由siRNAs击倒(数据的有效性5 (b)- - - - - -5 (c))。抑制mTORC2和mTORC1组装sestrin1表达式(增加数据5 (d)- - - - - -5 (e))。雷帕霉素在100 ng / mL的浓度减少LSS诱导sestrin1 HUVECs减少(图5 (f))。抑制mTORC1的猛禽siRNA不能禁止sestrin1表达式的减少暴露在LSS(图5 (g))。然而,mTORC2抑制rictor siRNA可能禁止sestrin1表达式的减少引起LSS(图5 (h))。

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图5
Upregulation sestrin1表达式的雷帕霉素通过mTORC2抑制ECs免受LSS侮辱。Upregulation sestrin1表达式的雷帕霉素通过mTORC2抑制ECs免受LSS侮辱。(一)HUVECs对待siRNA rictor,猛禽,或者炒小干扰rna (ctrl siRNA)控制。转染48 h后,细胞检测Rictor收获,猛禽,GAPDH通过免疫印迹蛋白质含量。((b) - (c))的百分比击倒rictor或相对于GAPDH“猛禽”进行了分析, ; 。((d) - (e))转染后48 h, sestrin1表达显著升高rictor siRNA或者猛禽siRNA集团, ; 。(f)雷帕霉素(拉伯)减少LSS诱导sestrin1减少, , 。小干扰rna转染(g)与猛禽mTORC1抑制后48 h, HUVECs暴露在LSS或保持静态。表达sestrin1由实时PCR减少LSS曝光后, , 。(h)与rictor siRNA mTORC2抑制后,sestrin1表达式并没有减少在HUVECs LSS与静态组相比, , 。

4所示。讨论

本研究的主要发现是,雷帕霉素保护ECs LSS氧化诱导细胞凋亡的禁止通过mTORC2差别抗氧化sestrin1基因对这些基因的抑制。

党卫军的含义变化RES植入还缺乏机械的解释(25]。后植入裸金属支架,SS与反向内膜的厚度,因为LSS诱导血管平滑肌细胞(smc)增殖26)和高SS细胞凋亡smc (27]。然而,我们以前的血流动力学研究和其他人的28)发现党卫军在部署后保持较低的RES因为雷帕霉素废除LSS对内膜的增殖的影响。根据这些观察结果,我们推测,LSS由RES和雷帕霉素支架部分本身相互作用的病理生理学的冠状动脉和参与的延迟药物支架表面。

LSS据报道,发起内皮细胞凋亡(29日]。一个在活的有机体内研究发现,细胞凋亡的ECs血管壁为特征在斑块的下游LSS发生(30.),类似于我们的先前的研究14,31日]。目前的研究提供了证据表明,当雷帕霉素交付提前30分钟,不断用于流媒体、内皮细胞凋亡诱导LSS可以改善。

这是表明,雷帕霉素诱导血管功能障碍通过增加超氧化物生产和减少一氧化氮(NO)合成(32]。尽管如此,另一组报道,雷帕霉素安抚氧化应激与衰减的结果衰老内皮功能障碍(33]。这是合理的因为衰老是一种疾病的氧化应激和雷帕霉素药物延长寿命(34,35]。在角膜ECs,雷帕霉素在25 - 50 nM的浓度降低了叔丁基氢过氧化物诱导细胞凋亡(36]。雷帕霉素也据报道,保护血管,保留一氧化氮(NO)介导的血管反应性(37),通过抑制过氧化氢诱导血管收缩性的损失(38),甚至降低内皮细胞凋亡面对机械应力(9]。这些结果与我们的数据是一致的,雷帕霉素保护ECs免受氧化LSS诱导细胞凋亡。

mTOR函数两种复合物的形成,mTORC1 mTORC2。阻塞复合物组装可以抑制mTOR的活动。mTORC1 mTOR-raptor复杂,雷帕霉素敏感。mTORC2包含rictor雷帕霉素可以抑制的ECs在长期的时间进程39]。最近据报道生物物理信号激活细胞mTOR通路(40]。时间进程研究表明mTORC1瞬时激活后抑制了LSS虽然mTORC2激活。mTORC2的矛盾的活动和mTORC1可能使mTORC2 mTORC1以外的优先候选人被雷帕霉素。程等。41]报道雷帕霉素调制以挪士表达高低党卫军的条件,这意味着mTOR监管被激活以挪士表达暴露在高和低党卫军。此外,他们发现灯是离散的,雷帕霉素降低高SS推动以挪士表达虽然减毒LSS减少以挪士表达式。然而,他们未能提出矛盾的调制的基本原理以挪士的雷帕霉素的党卫军。提供LSS激活mTOR复杂一样高SS,雷帕霉素应该有一致的其他比离散效应以挪士表达式党卫军暴露在高和低。通过特定的抑制mTORC1和mTORC2 siRNAs,本研究发现mTORC2,雷帕霉素的敏感行动网站,雷帕霉素的实际目标在LSS暴露ECs。

本研究还发现抗氧化sestrin1在LSS暴露ECs表达下调,意味着LSS诱导活性氧/ RNS积累可能部分是由于减少sestrin1表达式。考虑没有报告关于sestrins posttranscription监管的表情,本研究未来调查sestrin1基因表达的抑制mTORC1 mTORC2。Sestrin1表达受到抑制mTORC1 mTORC2。在LSS的存在,我们进一步确定抑制雷帕霉素在剪切mTORC2 ECs。Upregulation sestrin1的罗格列酮减少ROS和保护视网膜细胞凋亡(42),一致的这项研究,提升sestrin1表达式的雷帕霉素介导氧化还原依赖凋亡效应。

在当前的研究中我们选择2达因/厘米2随着LSS应用ECs从0到4达因/厘米2通常是用作LSS平行流室的研究。这是明显不同于SS映射重建冠状动脉腔内支架后的表面,在LSS被定义为小于12达因/厘米2(43]甚至更高13]。因此,本研究的结果必须被谨慎地考虑不同的条件在体外和在活的有机体内。

总之,我们的结果很好地适应一个模型,雷帕霉素缓解LSS诱导氧化被禁止通过mTORC2差别sestrin1对这些基因的抑制细胞凋亡。我们的研究结果提供了一个在体外证据解释RES的病理生理学冠状动脉支架的部分。

利益冲突

作者宣称没有利益冲突有关的出版。

确认

Shaoliang陈要感谢玉林Gu (NatureThink公司、上海、中国)技术支持的并行流室的机制。这项工作得到了国家自然科学基金批准号81270191和江苏省自然科学基金项目。BK2009044。