文摘

来测试假设增加促炎细胞因子的表达高机动组盒1 (HMGB1)外层膜和玻璃液增生性糖尿病性视网膜病变患者和糖尿病大鼠视网膜的扮演一个在调解diabetes-induced视网膜神经病变发病的作用。个月糖尿病大鼠视网膜和HMGB1 intravitreally注入正常老鼠研究利用免疫印迹分析,rt - pcr和谷氨酸测定。此外,我们研究了影响diabetes-induced HMGB1抑制剂甘草甜素的生化变化在视网膜上。糖尿病和intravitreal注入HMGB1在正常大鼠诱导显著upregulation HMGB1蛋白mRNA,激活细胞外signal-regulated激酶1和2 (ERK1/2)裂解caspase-3和谷氨酸;synaptophysin的差别和重要对这些酪氨酸羟化酶、谷氨酰胺合成酶和乙二醛酶1。常数甘草甜素摄入量从糖尿病的发病并不影响糖尿病大鼠的代谢状态,但它明显减毒diabetes-induced upregulation HMGB1蛋白mRNA,激活ERK1/2, caspase-3裂解,和谷氨酸。glycyrrhizin-fed糖尿病老鼠,synaptophysin减少,造成酪氨酸羟化酶和乙二醛酶1糖尿病明显减弱。这些发现表明,早期糖尿病视网膜病变包括调节HMGB1的表达,抑制HMGB1可以改善。

1。介绍

糖尿病性视网膜病变(DR),该疾病,通常被认为是一种疾病的视网膜微脉管系统和血管细胞损伤的结果。然而,最近的研究证明,神经退化和视觉功能受损后启动早期糖尿病的发病和进展独立于血管病变(1- - - - - -4]。然而,diabetes-induced视网膜神经细胞退化和功能障碍背后的分子机制仍不清楚。

高机动组盒1 (HMGB1)是一种非组蛋白的dna结合蛋白核蛋白质,已经涉及到不同的细胞内功能,包括nucleosomal的稳定结构和基因转录的便利化。坏死细胞的死亡会导致被动HMGB1泄漏从细胞然后不再绑定到DNA的蛋白质。此外,HMGB1可以主动分泌不同的细胞类型,包括激活单核细胞和巨噬细胞,成熟的树突细胞,自然杀伤细胞和内皮细胞。细胞外HMGB1函数作为促炎细胞因子和触发炎症反应通过多个受体的激活受体等先进的糖化终端产品(愤怒),toll样受体2 (TLR2)和TLR4导致转录因子的激活细胞外signal-regulated激酶1和2 (ERK1/2)和核转录因子(NF -κBκB),这可能改变基因转录,导致upregulation促炎细胞因子、趋化因子、黏附分子和加剧细胞氧化应激(5- - - - - -10),进程可能在糖尿病的发病机制中发挥作用的视网膜神经细胞退化和功能障碍。强有力的证据表明,慢性低度炎症的发病机制涉及博士(11,12]。最近,这是表明,HMGB1的主要中介过渡性持续的神经炎症和慢性进行性多巴胺能神经退化在神经退行性疾病,如帕金森病(13]。

最近,HMGB1受到特别关注对其在脑缺血病理作用。缺血性损伤后引起的瞬态在小鼠和大鼠大脑中动脉阻塞,HMGB1被发现易位到细胞质舱从神经元细胞核和释放到细胞外空间(14- - - - - -18]。在这些研究中,细胞外HMGB1的发展中扮演着重要角色通过小胶质激活神经元损伤,诱导细胞凋亡,兴奋性氨基酸释放,诱导的促炎介质(14- - - - - -19]。Downregulation HMGB1或中和anti-HMGB1单克隆抗体治疗显著抑制梗死大小,小胶质细胞的激活,诱导炎症标记和抑制增加血脑屏障的通透性(14,18]。

在先前的研究中,我们表明,HMGB1与愤怒都是表示在维管组织的血管内皮细胞和基质细胞外层膜增生性糖尿病视网膜病变(PDR)患者。此外,我们证明了水平的提高HMGB1在玻璃PDR患者样本的玻璃水平之间存在显著的正相关性HMGB1和炎症生物标记物的水平20.- - - - - -22]。此外,我们表明,糖尿病诱导的重要upregulation HMGB1与愤怒的表达在大鼠和小鼠的视网膜,HMGB1 intravitreal管理正常大鼠诱导视网膜炎症信号通路的激活和视网膜血管通透性增加21,23]。

的成分甘草酸(GA),甘草根,早就知道展示glucocorticoid-like通过抑制11抗炎作用β-hydroxysteroid脱氢酶。遗传算法已被证明有消炎和抗病毒效应。最近,遗传算法也已被证明能够结合并抑制化学引诱物,致有丝分裂的,cytokine-like HMGB1的活动(24]。在这项研究中,我们探讨了假设HMGB1扮演一个在调解diabetes-induced视网膜神经病变发病的作用。为了验证这个假设,我们调查的表达神经退化介质和标记caspase-3裂解,synaptophysin,酪氨酸羟化酶(TH)、谷氨酰胺合成酶(GS)、谷氨酸,乙二醛酶1(如果1)在糖尿病大鼠的视网膜和正常大鼠的视网膜后intravitreal HMGB1的政府。此外,我们分析了常数GA摄入量是否抑制大鼠糖尿病引起的视网膜病变。

2。材料和方法

2.1。动物

2.1.1。诱导糖尿病和甘草甜素治疗

与动物所有程序依法进行视觉和眼科学研究协会(下午)声明中使用的动物在眼科和视觉研究机构批准的动物保健和使用委员会药学院,沙特国王大学。成年男性的雄性sd大鼠中8 - 9周的年龄(200−220 g)是通宵禁食和链脲霉素(STZ) 55毫克/公斤10毫米柠檬酸钠缓冲,pH值4.5(σ,圣路易斯,密苏里州),腹腔内注射。相同量的柠檬酸缓冲被注入在非糖尿病的动物。老鼠被认为是糖尿病如果他们的血糖是大于250 mg / dL。与正常大鼠作为控制。

糖尿病大鼠被分为2组:大鼠在我收到组正常饮用水没有任何补充,和第二组获得饮用水和甘草酸(150毫克/公斤/天,圣克鲁斯生物技术公司,圣克鲁斯,CA)后立即建立糖尿病实验的整个过程。每组8 - 12的老鼠。糖尿病4周后,大鼠被过量的水合氯醛安乐死,眼睛被移除,视网膜是孤立的和冷冻立即在液氮和存储−80°C被免疫印迹分析或分析生化试验。

2.1.2。Intravitreal注入HMGB1

雄性sd大鼠中(200−220 g)保持在深麻醉下,和重组HMGB1消毒溶液(5 ng / 5μL;研发系统、明尼阿波利斯、MN)注入到右眼如前所述的玻璃我们(23]。控制,左眼收到5μL无菌磷酸盐缓冲盐水(PBS)。intravitreal政府动物牺牲4天后,和视网膜仔细解剖,在液态氮snap-frozen,储存在−80°C被免疫印迹分析或分析生化试验。blood-retina障碍引起的崩溃intravitreal注入HMGB1可能导致HMGB1含量也增加,血清。因此,我们决定HMGB1的水平从intravitreally等量的血清注射大鼠和正常大鼠用免疫印迹分析。

2.1.3。免疫印迹分析

视网膜是均质在西方裂解缓冲(30毫米Tris-HCl;pH值7.4,250毫米Na₃签证官₄5毫米EDTA, 250毫米蔗糖、1% Triton x - 100蛋白酶抑制剂)。溶菌产物离心机在14000 g×10分钟在4°C,和上层的收集。蛋白质含量是由直流蛋白质化验分析(Bio-Rad实验室、大力神、CA)。组织溶解产物包含40 - 50μ克蛋白质分离在10%或12% SDS-polyacrylamide凝胶转移到硝化纤维膜。这些墨迹被封锁在TBST 5%脱脂牛奶(20毫米Tris-HCl, pH值7.6,136毫米氯化钠,和0.1% Tween-20)。

HMGB1的检测,phospho-ERK1/2、synaptophysin caspase-3裂解,TH, GLO1, GS,膜是孵化一夜之间在4°C兔多克隆anti-HMGB1(1: 1000年,猫。英国ab18256数量,Abcam),兔单克隆anti-phospho-ERK1/2 (0.5μg / mL,猫。MAB1018数量、研发系统),鼠标单克隆anti-ERK1/2 (0.5μg / mL,猫。MAB1576数量、研发系统),山羊多克隆anti-synaptophysin (1μg / mL,猫。号码af - 5555、研发系统),兔多克隆anti-cleaved caspase-3(1: 300年,猫。号码sc - 7148, Santa Cruz),鼠标单克隆anti-TH (0.5μg / mL,猫。MAB7566数量、研发系统),兔多克隆anti-GLO1(1: 200年,猫。数量ab96032 Abcam),和山羊多克隆anti-GS (sc - 6640 1: 500年,Santa Cruz)。隔夜孵化与初级抗体后,膜与TBS-T洗4次(每5分钟)。synaptophysin和GS,膜在室温下孵化为1.5 h抗体中等辣根peroxidase-conjugated抗体(sc - 2768 1: 2000年,Santa Cruz), HMGB1, phospo-ERK1/2裂解caspase-3 GLO1,与anti-rabbit中等辣根peroxidase-conjugated抗体(sc - 2004 1: 2000年,Santa Cruz),和ERK1/2和TH anti-mouse中等辣根peroxidase-conjugated抗体(sc - 2005 1: 2000年,Santa Cruz)。与二次孵化项目后抗体,膜与TBS-T洗4次(每5分钟)和乐队的免疫反应性是可视化高性能化学发光机器上(G:盒子从Syngene Chemi-XX8,综观有限公司剑桥,英国)通过使用增强化学发光+鲁米诺(sc - 2048,圣克鲁斯)和量化的光密度分析使用图像处理和分析GeneTools (Syngene由天气有限公司剑桥,英国)。加载控制,屁股被检测到鼠标单克隆抗-β肌动蛋白(sc - 2048 1: 2000年,圣克鲁斯)抗体。总ERK1/2 phosphor-ERK1/2的加载控制。所有三个独立实验的数据被表示为一个比光密度。

2.1.4。实时逆转录聚合酶链反应(rt - pcr)

总RNA提取视网膜使用三试剂(Ambion TX),根据制造商的协议。1的互补脱氧核糖核酸合成μg RNA,使用高容量cDNA逆转录工具包(应用生物系统,CA)制造商的指令。rt - PCR进行使用SYBR绿色PCR掌握混合。老鼠的PCR引物HMGB1向前5′-TGATTAATGAATGAGTTCGGGC-3反向′5′- TGCTCAGGAAACTTGACTGTTT-3′β肌动蛋白向前5′-CCTCTATGCCAACACAGTGC-3反向′5′-CATCGTACTCCTGCTTGCTG-3′。标准PCR条件包括2分钟50°C和10分钟在95°C紧随其后40周期在95°C扩展了15秒,一分钟60°C。阈值线是自动调整放大相交线放大曲线的线性部分和周期阈值(Ct)自动记录。数据归一化,β肌动蛋白mRNA水平(管家基因)和基因表达的褶皱变化相对于正常使用ddCt方法计算。

2.1.5节讨论。测量大鼠视网膜的谷氨酸

谷氨酸水平测量视网膜匀浆通过谷氨酸测定工具包(猫。数量ab83389 Abcam),根据制造商的指示。简单地说,50μL标准与视网膜匀浆(等量)装载在一个清晰的96孔板,其次是增加100μL反应混合解决方案在分析缓冲区,谷氨酸开发人员,和谷氨酸酶混合。板是孵化30分钟37°C(受光照),阅读在标450海里(统计传真4200标、感知技术、棕榈城,FL)。谷氨酸的浓度测量是表示为nmol /μ信用证μ克蛋白质。

2.1.6。统计分析

Mann-Whitney测试是用来比较意味着两个独立的团体。一个值小于0.05显示统计学意义。SPSS 12.0版是用于统计分析。

3所示。结果

3.1。高血糖大鼠的严重性

糖尿病老鼠的身体重量低,他们的血糖水平高出四倍与同龄正常控制老鼠(178±22和287±28 g和475±32和111±12 mg / dL,职责)。治疗糖尿病大鼠的遗传算法一个月并没有改变这些代谢变量在糖尿病大鼠(167±25和178±22 g和449±36和475±32 mg / dL,职责)。

3.2。影响糖尿病视网膜的表达介质和神经退化的标志

免疫印迹分析表明显著upregulation HMGB1表达比非糖尿病患者视网膜糖尿病视网膜。HMGB1蛋白的表达在糖尿病大鼠视网膜的调节66%比非糖尿病患者的视网膜老鼠(图1(一))。糖尿病显著增加ERK1/2激活视网膜的77%相比,非糖尿病患者控制(图1 (b))。细胞凋亡实行酶,裂解caspase-3显著调节糖尿病视网膜比非糖尿病的控制。裂解caspase-3水平在糖尿病大鼠视网膜的非糖尿病患者控制(图相比增加了70%1 (c))。突触囊泡蛋白synaptophysin和多巴胺能无长突细胞标记TH水平在糖尿病动物获得显著低于非糖尿病的动物。水平下降了约68%和46%,分别为(数字1 (d)和1 (e))。GS、谷氨酸转换成谷氨酰胺酶,蛋白表达显著降低糖尿病视网膜而非糖尿病患者的视网膜。(图g的水平下降了约75%1 (f))。GLO1,解毒酶至关重要的先进的糖化终端产品(年龄),蛋白表达显著减少糖尿病患者比非糖尿病的大鼠视网膜。GLO1表达糖尿病视网膜下降了约51%(图1 (g))。谷氨酸测定显示,谷氨酸水平在糖尿病动物的视网膜(nmol /μ信用证μg蛋白)明显高于非糖尿病患者控制(nmol /μ信用证μg蛋白)()(图1 (h))。

3.3。Intravitreal HMGB1管理局对视网膜的表达介质和正常大鼠神经退化的标志

血清水平没有显著差异之间的HMGB1老鼠intravitreally注射HMGB1 ()和正常大鼠()()。Intravitreal注入HMGB1导致HMGB1表达增加了约72%相比,侧眼接受PBS中获取的值(图2(一个))。视网膜在同一样本,HMGB1注射导致增加76% ERK1/2激活(图2 (b)),增长31%,裂解caspase-3表达式(图2 (c)),65%减少synaptophysin表达式(图2 (d)在表达式(图),下降65%2 (e)(图),降低70% GS表达式2 (f)),并减少71%(图GLO1表达式2 (g))。注入HMGB1倾向于增加视网膜谷氨酸表达,但这是不重要的(与nmol /μ信用证μg蛋白;)(图2 (h))。

3.4。HMGB1抑制剂甘草甜素对抗糖尿病的效果

免疫印迹分析用于评估HMGB1的GA对diabetes-induced改变的影响,ERK1/2激活,caspase-3裂解,synaptophysin, TH, GS, GLO1。常数GA摄入量从糖尿病的发病明显减毒diabetes-induced upregulation HMGB1的ERK1/2激活,和裂解caspase-3约73%,55%和78%,分别为(数字1(一),1 (b),1 (c))。GA-fed糖尿病老鼠,synaptophysin减少,TH, GS,和GLO1糖尿病引起的衰减58%,55%,79%,和53%,分别为(数字1 (d),1 (e),1 (f),1 (g))。的谷氨酸水平GA-treated糖尿病大鼠(nmol /μ信用证μg蛋白)明显低于那些在未经治疗的糖尿病大鼠(nmol /μ信用证μg蛋白)()(图1 (h))。

3.5。视网膜HMGB1 mRNA的表达

HMGB1 mRNA的表达在糖尿病大鼠的视网膜是增加了4倍相比,非糖尿病的大鼠的视网膜。Intravitreal注入HMGB1导致HMGB1 mRNA表达增加了大约5倍相比,获得的值仅接受PBS的侧眼。GA摄入量显著减毒diabetes-induced upregulation HMGB1 mRNA的约3.5倍而未经治疗的糖尿病大鼠(图3)。

4所示。讨论

在目前的研究中,我们调查了diabetes-induced HMGB1的视网膜神经病变病理作用。我们先前的研究显示,糖尿病患者移植HMGB1表达在玻璃液和前膜膜PDR患者及其表达与活动相关的疾病和炎症生物标记物的水平20.- - - - - -22]。此外,我们表明,HMGB1表达调节在糖尿病小鼠和大鼠的视网膜21,23]。在目前的研究中,我们表明,糖尿病诱导的重要upregulation裂解caspase-3和谷氨酸表达在老鼠的视网膜。另一方面,糖尿病引起的差别明显对这些synaptophysin, TH, GS, GLO1老鼠的视网膜。此外,我们的数据表明,intravitreal注入HMGB1在正常大鼠模拟糖尿病的效果。HMGB1抑制剂GA减毒diabetes-induced upregulation HMGB1蛋白mRNA;裂解caspase-3和谷氨酸;的差别,对这些synaptophysin TH, GS, GLO1老鼠的视网膜。总的来说,这些发现表明,HMGB1有助于糖尿病引起的视网膜病变。

糖尿病诱发视网膜神经退化就是明证凋亡细胞的存在在所有视网膜层(4,25]。激活caspase-3是细胞凋亡的机制的一部分25]。几项研究表明,caspase-3表达活跃,表明细胞凋亡,调节人体的糖尿病视网膜(4)和大鼠(25]。在STZ-diabetic鼠视网膜,caspase-3后调节免疫反应性2,8,16周的糖尿病(25]。然而,Feit-Leichman et al。26)证明,STZ-diabetic老鼠,upregulation视网膜caspase-3活动在1个月后诱导糖尿病、减少正常,大约6个月后重新开始增长。他们得出的结论是,diabetes-induced变性的视网膜毛细血管可以开发独立于神经元的损失。Synaptophysin的突触囊泡蛋白是一个积分。它可能提供多种功能在突触囊泡的形成和胞外分泌,神经递质传递中起着重要的作用。广泛用作突触功能的标志之一,也被认为是密切相关的突触发生和突触可塑性在神经组织的发展。Synaptophysin基因敲除小鼠表现出显著减少突触囊泡在视杆光感受器扰乱神经递质释放和突触网络活动27]。先前的研究表明,1个月糖尿病视网膜的表达减少synaptophysin [3,28- - - - - -30.]。是多巴胺合成的病原生物合成的酶。因此,TH蛋白质水平是多巴胺能无长突细胞在视网膜上的标记(1,25,31日]。几项研究显示糖尿病视网膜TH蛋白质含量下降,反映出减少多巴胺能无长突细胞的密度(1,31日- - - - - -33]。synaptically释放谷氨酸被Muller细胞g转换成谷氨酰胺。一些研究发现,GS的表达明显减少在糖尿病大鼠视网膜34,35]。这些障碍导致谷氨酸水平升高糖尿病视网膜(34,36,37),这可能通过谷氨酸会诱导视网膜神经退化。在糖尿病、年龄积累前体甲基乙二醛(毫克)。在糖尿病性视网膜病变,视网膜MG-derived年龄升高,被认为是诱发视网膜损伤和神经退行性变的(38- - - - - -40]。通常,MG解毒的乙二醛酶(如果)酶系统,由GLO1和GLO2 [41]。以前的报告表明,GLO1表达式是减少在糖尿病大鼠视网膜42]。也表明GLO1过度MG-derived年龄的糖尿病大鼠防止高血糖诱导形成神经视网膜,穆勒阻止神经胶细胞功能障碍,防止毛细管退行性病理学(43]。

在目前的研究中,我们表明,类似于糖尿病、intravitreal注入引起的HMGB1的重要upregulation HMGB1蛋白mRNA和激活裂解caspase-3在正常大鼠的视网膜。此外,注入HMGB1倾向于增加视网膜谷氨酸表达,但这不是重要的。在这方面,最近发现HMGB1促进谷氨酸释放gliosomes [19]表明其介导的神经毒性,至少部分由谷氨酸释放的增加和增强excitotoxic神经元死亡。另一方面,在体外研究表明,从神经细胞谷氨酸能引起HMGB1的释放(14,15]。此外,intravitreal管理HMGB1的差别引起对这些synaptophysin, TH, GS, GLO1。这些发现表明,早期糖尿病视网膜病变包括调节HMGB1的表情。几项研究表明,HMGB1大规模缺血性侮辱后立即释放,随后可以诱发脑缺血后的神经炎症(14,15,17]。对这些活动,HMGB1必须从细胞核转运,通过细胞质,细胞外部。几项研究表明,炎症标志物c反应蛋白(44)和促炎细胞因子肿瘤坏死因子-α(肿瘤坏死因子-α)[45)和interleukin-1β(il - 1β)[46)诱导易位HMGB1的核细胞的细胞质和随后的细胞外释放。在体外研究表明,细胞外HMGB1诱导的炎性标志物TNF -α,il - 1β干扰素-γ,细胞间粘附molecule-1 (ICAM-1),诱导一氧化氮合酶(间接宾语),和cyclooxgenase-2培养神经元,星形胶质细胞、小胶质细胞、内皮细胞(14,15,17]。此外,脑缺血后显微镜下注射外源性HMGB1的增加脑损伤和调节伊诺和il - 1的表达β(17]。这些发现表明,HMGB1作为小说促炎cytokine-like因素连接脑缺血性损伤的早期阶段和局部神经炎症反应在脑缺血后的激活(14,15]。此外,它也表明,细胞外释放HMGB1受损的大脑神经元细胞凋亡神经元,这涉及HMGB1-RAGE交互作用(16]。在我们的实验室,我们最近表明,糖尿病引起的视网膜的重要upregulation HMGB1表达,愤怒,激活NF -κB活性ERK1/2和ICAM-1 intravitreal管理HMGB1在正常大鼠模拟糖尿病的影响(23]。我们还表明,GA HMGB1抑制剂有效预防diabetes-induced NF -κB激活。在目前的研究中,GA减毒diabetes-induced ERK1/2激活。此外,coimmunoprecipitation研究显示,糖尿病增加HMGB1之间的交互和愤怒在视网膜上23]。这些发现表明,激活HMGB1 /愤怒信号与随后激活NF -轴κB和ERK1/2促进diabetes-induced视网膜神经病变是很重要的。最近,据报道,慢性神经炎症可能是一个进步的神经退化的驱动力,HMGB1提供慢性神经炎症和进步之间的联系神经退化在神经退行性疾病,如帕金森病(13]。

确认神经病理学的影响HMGB1在糖尿病性视网膜病变,HMGB1抑制剂GA后口服药物诱导糖尿病大鼠。GA被直接绑定到HMGB1和抑制其化学引诱物和促有丝分裂的活动24]。有趣的是,不断摄取GA显著降低糖尿病引起的视网膜HMGB1蛋白和mRNA表达。此外,GA减毒diabetes-induced upregulation劈裂caspase-3 synaptophysin的差别和谷氨酸中和对这些TH, GS, GLO1诱导糖尿病没有改变体重和血糖水平。我们的结果与先前的报道是一致的,证明了遗传算法在脑缺血动物模型的神经保护作用[47颅内出血),(48),和脊髓缺血(49]。GA具有glucocorticoid-like消炎物质,由于其抑制11日活动β-hydroxysteroid脱氢酶(24]。吴建et al。48]表明,GA的神经保护效应对颅内hemorrhage-related致病事件并非由糖皮质激素受体或调制的一氧化氮产量和逆转了外生HMGB1的应用程序。这些发现表明,GA的保护作用是由其anti-HMGB1活动和糖皮质激素系统无关。这是表明,GA的神经保护效应在一定程度上归因于HMGB1释放的抑制作用[47- - - - - -49]。此外,结果表明,遗传算法可以保护大脑和脊髓缺血后通过其抗炎、抗凋亡、antiexcitotoxic和抗氧化效果(47,49]。在一起,这些发现表明,糖尿病引起的视网膜病变早期,至少部分归因于diabetes-induced upregulation HMGB1表达,抑制HMGB1的释放与不断摄入GA结果在diabetes-induced视网膜神经病变。重要的是要注意,甘草的过度摄入可能会导致hypermineralocorticoidism-like综合征的特点是钠和水的潴留,钾的损失,水肿、血压升高、代谢性碱中毒,抑郁rennin-angiotensin-aldosterone系统(50,51]。

总之,我们的数据指出潜在的小说和关键作用HMGB1作为中介的diabetes-induced视网膜神经病变。HMGB1抑制剂GA减毒diabetes-induced upregulation HMGB1和diabetes-induced视网膜神经病变。因此,GA和其他代理针对HMGB1可能对糖尿病性视网膜病变提供新的治疗选项。

利益冲突

所有的作者没有任何利益冲突与任何商标中提到。

确认

作者感谢康妮b . Unisa-Marfil女士和女士米歇尔·b·Rasonabe秘书工作。这项工作得到了纳赛尔Al-Rasheed博士研究椅子眼科(Abu El-Asrar点)和国家科技计划(NPST),沙特国王大学,在项目12-MED2604-02。