文摘
线粒体异常已被证明在许多肾脏疾病模型。然而,它的作用在慢性肾脏疾病的发病机制(半散装)仍然是不确定的。在本研究中,线粒体复杂我抑制剂鱼藤酮应用于小鼠接受单侧输尿管梗阻(UUO)。后7天鱼藤酮治疗,一个显著的衰减管损伤检测到PAS染色。符合改善肾脏形态学,鱼藤酮显著钝化纤维化反应的差别如图所示,对这些纤连蛋白(FN)、纤溶酶原激活物inhibitor-1 (PAI-1),胶原蛋白,胶原蛋白三世αsma,平行的TGF -的大幅减少β1。与此同时,氧化应激标志物硫代巴比土acid-reactive物质(TBARS)和血红素加氧酶1 (HO-1)和炎症标记物TNF -α,il - 1β,ICAM-1明显减少。更重要的是,线粒体DNA拷贝数的减少,线粒体NADH脱氢酶亚基1 (mtND1)表达在阻塞肾脏被鱼藤酮适度但明显恢复,表明线粒体损伤的一个改进。集体,线粒体复杂我抑制剂对阻塞性鱼藤酮保护肾脏损伤可能通过抑制线粒体氧化应激、炎症、纤维化,表明线粒体功能障碍的一个重要的角色在阻塞性肾病的发病机制。
1。介绍
肝纤维化是各种慢性肾脏疾病的常见事件(半散装)。肾纤维化的发展被认为是一个主要病理过程导致肾功能的逐渐丧失半散装(1- - - - - -3]。在这些诱发因素导致肾脏纤维化,炎症和氧化应激是最好的特征(4- - - - - -7]。在过去的几十年中,尽管许多研究都已经执行旨在开发更好的治疗策略的半散装8,9),治疗结果仍不满意由于不完整的病理机制的理解。
有趣的是,最近的报告显示异常线粒体的变化在某些慢性肾病模型包括UUO [10- - - - - -12)和5/6肾切除术(13]。线粒体不仅是能源生产的关键来源,也扮演了一个重要的角色在调节信号转导,细胞增殖和细胞周期的控制,细胞生长和细胞死亡14,15]。线粒体的功能障碍导致ATP耗竭,活性氧(ROS)生产过剩,并释放proapoptotic因素如细胞色素C和线粒体DNA,从而可能导致细胞损伤通过DNA和蛋白质的氧化损伤和凋亡反应和随后的炎症和纤维化(16,17]。同意这些观点,我们之前研究了证据表明,线粒体功能障碍是肾纤维化的早期事件发生前与醛固酮注入小鼠模型(18)和线粒体功能障碍的干预显著减弱慢性醛固酮注入引起的肾损伤。在阻塞肾脏线粒体异常也证明(10,12),表明线粒体功能障碍的干预阻塞性肾病的发病机理。
UUO是成熟的和广泛使用的模型在调查肾纤维化的机制和治疗策略19]。在阻塞肾脏线粒体异常可能是一个原因导致肾纤维化或仅仅是一个辅助肾损伤的结果。定义的角色在阻塞性肾损伤线粒体功能障碍,我们对待UUO小鼠线粒体复杂我抑制剂鱼藤酮来确定(1)是否抑制线粒体复杂我可以减弱管状损伤和肾纤维化阻塞性肾病和(2)线粒体抑制复杂的我是否能影响氧化应激和炎症在这个特定的模式。
2。方法
2.1。动物
C57BL / 6 j小鼠最初购买杰克逊实验室。这只老鼠殖民地当时传播南京医科大学。在所有研究,3 - 4雄鼠。所有老鼠都维持在12:12 h光暗周期(灯在上午6点和灯下午6点)。本研究通过南京医科大学制度动物保健和使用委员会。
2.2。建立UUO小鼠模型和鱼藤酮治疗
单侧输尿管梗阻是诱导如前所述20.]。短暂,左输尿管被曝光和随后绑定6.0丝通过腹部的小切口下和2.0%异氟烷麻醉。两层的腹部被关闭。所有小鼠接受镇痛(皮下注射50μ克/公斤丁丙诺啡(Temgesic、先灵葆雅))手术后。手术后,果冻饮食有或没有鱼藤酮剂量的500 ppm UUO老鼠。虚假的控制老鼠有果冻饮食没有鱼藤酮治疗。鱼藤酮的七天治疗后,小鼠(每组)被牺牲和肾组织收获基因和蛋白质表达和组织学评估分析。
2.3。管损伤分数
肾组织被直接浸泡在10%福尔马林固定16 h。在石蜡包埋后,4μ米部分准备和沾过碘酸希夫(PAS)和光学显微镜分析。管状上皮的损伤参数的百分比的扁平化、管状扩张,和刷状缘脱落被一位病理学家盲估计的身份使用分制评分在10个随机选择的样本,不重叠的领域(200 x放大)。程度的损伤分级到一个范围从0到4:0 =正常;1 =温和,只有不到25%的大脑皮层的参与;2 =温和,25 - 50%的大脑皮层的参与;3 =严重,50 - 75%的大脑皮层的参与;4 =广泛损害涉及>皮层的75%。
2.4。免疫组织化学
肾脏与10%福尔马林固定石蜡和嵌入。肾脏部分(4μ米厚度)在3% H孵化2O2在室温下15分钟阻断内源性过氧化物酶活性。沸腾后抗原检索解决方案(1更易与L tris-HCl, 0.1 L更易与EDTA, pH = 8.0) 15分钟在高功率微波烤箱,一夜之间被孵化的部分在4°C兔子anti-collagen我抗体(猫数量:sc - 8784, Santa Cruz)。与PBS洗涤后,二级抗体应用和信号使用ABC可视化工具包(圣克鲁斯生物技术)。
2.5。免疫印迹
整个肾脏细胞溶解和蛋白质浓度是由Coomassie试剂。蛋白质(60μg)从整个肾脏溶菌产物变性煮10分钟,由SDS-polyacrylamide凝胶电泳分离,转移到硝化纤维膜。这些墨迹被封锁在一夜之间有5%的脱脂奶粉在tris-buffered盐水(TBS),其次是孵化1 h和兔子anti-collagen我(猫数量:sc - 8784, Santa Cruz), anti-fibronectin(猫数量:sc - 9068, Santa Cruz),反α光滑的肌肉肌动蛋白(猫数量:sc - 32251, Santa Cruz),或anti-HO-1(猫数量:ab13248 Abcam)的稀释1:1000。与TBS洗后,墨迹孵化了一种山羊anti-horseradish peroxidase-conjugated二级抗体与发射极耦合逻辑(1:1000稀释)和可视化工具包(美国新泽西州Amersham,皮斯卡塔韦)。
2.6。中存在
总RNA进行了隔离和逆转录如前所述[21]。总DNA肾脏孤立使用DNeasy组织工具包(表达载体,卡尔斯巴德,CA)。信使rna和mtDNA复制数据被存在。寡核苷酸的设计使用Primer3软件(可用http://frodo.wi.mit.edu/primer3/)和序列如表所示1。执行中存在放大使用SYBR绿色主人混合(应用生物系统公司、沃灵顿、英国)和棱镜7500实时PCR检测系统(美国应用生物系统公司,培育城市,CA)。循环条件95°C 10分钟,其次是40 95°C的重复1分钟15秒和60°C。
2.7。硫代巴比土Acid-Reactive测量物质
测量等离子体硫代巴比土acid-reactive物质(TBARS)是基于丙二醛的形成通过使用商用TBARS分析工具包(猫号码:10009055;开曼群岛化学)根据制造商的指示。
2.8。酶免疫分析法
肾脏组织中均质磷酸盐,然后离心5分钟10000 r.p.m。上层清液的稀释1:50与酶免疫分析法缓冲区。TGF -的浓度β1按照制造商的指示酶免疫分析法测定(猫数量:ab119557 Abcam)。肾脏肿瘤坏死因子-内容α和il - 1β测量使用ELISA试剂盒(TNF -α:猫数量:559732、BD OptEIA BD生物科学;il - 1β:猫数量:ab100704 Abcam)。
2.9。统计分析
所有值都呈现意味着±SE。使用学生的统计分析以及或双向方差分析。差异被认为是重要的时候。
3所示。结果
3.1。鱼藤酮治疗对肾的影响阻碍肾脏结构变化
7天输尿管梗阻后,PAS染色显示显著的管状结构如图所示的损害刷状缘的损失,上皮细胞萎缩和压扁,管腔扩张(图1(一))。引人注目的是,7天鱼藤酮治疗显著减弱这些形态异常(图1(一))。管损伤评分分析还演示了一个健壮的改善管损伤图所示1 (b)。
(一)
(b)
3.2。鱼藤酮治疗对阻塞肾脏的氧化应激水平
不正常的线粒体作为活性氧产量的重要来源。封锁的线粒体复合体I, upregulation氧化应激的标记HO-1阻塞肾脏明显阻塞(数字3(一个)和3 (b))。进一步验证这种抗氧化效应的鱼藤酮在这个模型中,我们检查了TBARS级别使用商业套装。正如所料,增加TBARS内容阻塞肾脏被鱼藤酮管理局(图明显减少2)。
(一)
(b)
3.3。鱼藤酮治疗效果在阻塞肾脏炎症反应
UUO也是一个炎症性肾脏疾病模型显著增强炎症细胞浸润细胞和居民。存在,我们发现炎症标记物TNF -α,il - 1β,ICAM-1明显升高7天输尿管梗阻后,和这样的增量强劲废除或减毒鱼藤酮政府(图4(一))。通过ELISA,我们进一步证实了蛋白质的监管TNF -α和il - 1β鱼藤酮治疗后的数字4 (b)和4 (c))。
(一)
(b)
(c)
3.4。鱼藤酮治疗效果在阻塞肾脏纤维化的标记
纤维化是已知的病理现象,UUO动物模型。在纤维化评估鱼藤酮治疗的效果在这个模型中,我们检查了蛋白质和mRNA的表达细胞矩阵组件包括胶原蛋白,胶原蛋白三世,FN, PAI-1,成纤维细胞的细胞标记αsma。引人注目的是,这两个蛋白(数字5(一个)- - - - - -5 (c))和信使rna(数字6(一)和6 (b)这些标记)的表达被鱼藤酮治疗坚定表达下调。这些发现证明在慢性阻塞性肾病antifibrotic鱼藤酮的作用。
(一)
(b)
(c)
(一)
(b)
3.5。鱼藤酮治疗效果TGF -表达阻塞肾脏
TGF -β是一种已知的profibrotic因素协调阻塞性肾病的纤维化的进程。探讨鱼藤酮影响这个重要的纤维变性的因素在这个UUO模型中,我们检查了信使rna和蛋白质水平的TGF -分别使用中存在和ELISA。如图所示的数据,信使rna和蛋白质水平的TGF -明显削弱了鱼藤酮(数据7(一)和7 (b))。
(一)
(b)
3.6。鱼藤酮治疗对线粒体DNA拷贝数的影响和mtND1表达式
线粒体异常评价,我们测量mtDNA拷贝数和mtND1表达式。如数据所示8(一个)和8 (b)、肾梗阻显著降低这两个指标,表明线粒体异常严重。后7天鱼藤酮管理,减少mtDNA拷贝数和mtND1表达适度但明显恢复(数字8(一个)和8 (b)),建议改善线粒体异常。
(一)
(b)
4所示。讨论
CKD患病率迅速上升,各种侮辱的增加导致肾损伤。那些侮辱,糖尿病和高血压已成为主要的导致CKD [22,23]。CKD患者的肾脏的炎症,氧化应激,和纤维化是常见的病态表现,形成一个正反馈循环,促进进步的肾损伤和功能损失(4- - - - - -7]。在过去的几十年中,尽管研究人员和研究者做出了大量努力理解半散装的发病机制,目前的管理策略在阻止疾病进展仍然是无效的。这种情况下提出了迫切的要求,更好地理解半散装的致病机制。
线粒体是细胞细胞器在决定细胞命运的钥匙。线粒体的功能障碍起着致病的作用在慢性心力衰竭(24,25和一些中枢神经疾病26]。在肾脏,最近的报告显示一个潜在的线粒体功能异常参与调停的开发和发展半散装(10- - - - - -13]。在本研究中,我们应用一个线粒体复杂我抑制剂的老鼠受到UUO,观察肾损伤的显著改善。
线粒体损伤不仅导致ATP水平的降低也会导致活性氧的过量生产,这直接导致细胞损伤,随后促进线粒体功能障碍(27,28]。因为在UUO肾脏线粒体异常是一个已知的现象(10,12,29日),在本研究中,我们测试了线粒体复杂的功效我抑制剂鱼藤酮在阻塞肾脏的氧化应激,发现鱼藤酮治疗明显减少肾TBARS内容和HO-1表达式。这些结果表明,抑制线粒体功能失调的活动肯定抑制ROS生产过剩,表明线粒体功能障碍的一个关键的角色在梗阻性肾中介ROS生产过剩。更重要的是,与mitochondria-originated氧化应激的封锁,肾小管损伤也显著改善由PAS染色,这表明,线粒体氧化应激作为致病因素在这个病理过程。
炎症的发生和发展中起着不利的作用在各种肾脏疾病包括半散装肾损伤。细胞浸润炎症细胞和肾居民造成炎症反应在阻塞性肾病19,30.- - - - - -32]。然而,详细的机制导致炎症在这个模型仍然知之甚少。在目前的研究中,抑制线粒体复杂我的鱼藤酮导致显著改善炎症显著抑制促炎细胞因子,如肿瘤坏死因子-α,il - 1β,ICAM-1。这些结果表明,线粒体功能障碍可能扮演重要的角色在调解阻塞肾脏的炎症反应。同时,大量的证据表明,氧化应激可能引发炎症反应在许多病理过程33,34]。在目前的研究中,与鱼藤酮的抑制氧化应激,炎症反应也有效地减弱,这表明mitochondria-derived氧化应激可能是一个诱发因素在阻塞性肾病引发炎症。
纤维化是一种常见的各种形式的肾损伤的结果。纤维化,细胞外基质(ECM)的积累(3)和细胞表型改变,被认为作为一个关键球员肾功能丧失。纤维化不仅是由于各种侮辱,如炎症和氧化应激反应,也有利于炎症和氧化应激的感应,形成一个正反馈循环。同意这一观点,封锁线粒体氧化应激和炎症的鱼藤酮的衰减是平行的纤维化。进一步调查这antifibrotic行动的潜在机制,我们研究了TGF -β1纤维化的关键贡献者UUO [35,36和许多其他CDK模型37),发现TGF -β1减少了鱼藤酮在信使rna和蛋白质含量。这些数据表明,鱼藤酮的antifibrotic作用可能是通过其封锁TGF -β1,至少在某种程度上。减少TGF -β1可以二次氧化应激和炎症的衰减,因为两个ROS (38和炎性细胞因子39)已被证明负责TGF -β1归纳。
总之,本研究表明,抑制线粒体功能失调的活动在阻塞肾脏线粒体复杂我抑制剂显著减毒肾损伤与氧化应激的封锁,炎症和纤维化反应。这些结果暗示诱发的作用在调节阻塞性肾损伤的线粒体功能障碍。和致病性循环由线粒体氧化应激,炎症和纤维化可能存在在这个病理过程。针对线粒体功能障碍可能作为一种新的治疗策略治疗阻塞性肾病和其他半散装。
利益冲突
没有利益冲突披露。
作者的贡献
应太阳和岳张同样这项工作做出了贡献。
确认
这项工作是支持由中国国家自然科学基金(81370802和81370802号),中国国家基础研究计划(973计划)(没有。2012 cb517602),江苏省自然科学基金(没有。BK2012001)。