文摘

肝脏功能障碍已经被频繁发生脓毒症的病例。过度的炎症和细胞凋亡是急性肝衰竭的病理特征。最近的研究表明,糖原合酶激酶的活化——(GSK) 3β参与炎症和细胞凋亡。我们旨在调查GSK-3的保护作用βsepsis-induced在幼童腹壁薄弱抑制肝损伤并探讨可能的机制。Polymicrobial脓毒症诱导了盲肠的结扎和穿刺(CLP),和SB216763被用来抑制GSK-3β在C57BL / 6小鼠。GSK-3βCLP后被激活。管理SB216763降低死亡率,改善肝损伤和肝细胞凋亡减少。GSK-3的抑制β也减少白细胞浸润,肝脏炎症细胞因子表达和释放。此外,GSK-3β抑制抑制转录活动核factor-kappa (NF - BκB),但增强的转录活动营地反应元件结合蛋白(分子)在肝脏。在体外研究中,GSK-3β抑制减少炎性细胞因子通过调制NF -生产κB在lipopolysaccharide-stimulated巨噬细胞和分子信号通路。总之,这些发现表明,GSK-3β封锁防止CLP-induced通过抑制肝脏的炎症调节NF -κB和活性分子,抑制肝细胞凋亡。

1。介绍

脓毒症定义为急性系统性炎症反应与临床感染谱从血流动力学变化多器官功能障碍综合征,甚至死亡1- - - - - -3]。据估计,有750000例脓毒症的死亡率在30%和50%之间(每年在北美4]。肝脏功能障碍已经被频繁发生脓毒症的病例。sepsis-associated肝功能异常和肝衰竭的发生率从34%到46%不等,从1.3%到22%在脓毒症患者,分别为(5]。衰减肝损伤和恢复肝功能降低发病率和死亡率在脓毒症患者5]。

sepsis-induced肝损伤的机制是多样化,包括不受控制的系统性炎症激活、肝缺血,凝血障碍,解除细胞凋亡(6- - - - - -9]。在脓毒症中,肝脏中起着重要的作用细菌吞噬和清除。与此同时,触发炎症反应在细菌性败血症的间隙。炎症介质,如肿瘤坏死因子(TNF)α白介素- 1 (IL)、白介素、干扰素(干扰素),γ引发,一氧化氮(NO)、活性氧(ROS),从肝脏释放居民和免疫细胞渗透,而调解sepsis-induced肝损伤(5]。凋亡细胞死亡有一个突出的作用在脓毒症后器官损伤的演化。动物研究已经证明,阻止细胞凋亡可以改善严重脓毒症的实验模型的结果9- - - - - -11]。

糖原合成酶激酶- (GSK) 3β广泛表达丝氨酸/苏氨酸蛋白激酶,最初被确定为糖原代谢的调节(12,13]。除了糖原代谢的作用,最近的研究已经涉及,GSK-3β起着重要的作用在调节炎症反应14- - - - - -16]。GSK-3β抑制TNF -减少了生产α和il - 6和增强il - 10在脂多糖(LPS)刺激单核细胞(14,15]。此外,GSK-3β抑制有效保护从内毒素休克小鼠和大鼠15,16)或老鼠活细菌感染(17,18]。此外,最近的研究表明,抑制GSK-3β活动阻止凋亡细胞死亡。老鼠接受GSK-3β抑制剂显示减少肾细胞凋亡对内毒素(19]。此外,GSK-3β封锁显著降低肝凋亡细胞死亡在回应D-galactosamine / LPS-induced肝损伤(20.]或缺血/再灌注(I / R)损伤(21,22),分别。尽管GSK-3的角色β内毒素休克和活细菌感染已经进行了广泛的调查,更少的信息可用GSK-3的可能影响β抑制脓毒症在幼童腹壁薄弱,更具代表性的临床状况。

因此,我们旨在调查GSK-3的保护作用βsepsis-induced在幼童腹壁薄弱抑制肝损伤小鼠盲肠的结扎和穿刺(CLP)模型,并进一步探讨可能的机制。

2。材料和方法

2.1。动物

男性天生的C57BL / 6小鼠(8 - 10周大,重量在20 ~ 22 g)购买来自武汉大学动物实验中心(武汉,中国)。所有的动物都被安置在动物护理标准条件下,有免费的水和食物。所有程序进行了根据道德准则的动物保健和使用委员会华中科技大学。

2.2。CLP脓毒症模型

脓毒症诱导的小鼠使用CLP方法。老鼠完全与戊巴比妥麻醉(60毫克/公斤,i.p。)和中线腹部切口。暴露后盲肠和操纵凳子盲肠的尖端,盲肠结扎从1厘米,被一个地地道道的穿刺穿孔(两个洞),20量度针腹膜炎诱导幼童腹壁薄弱。在两层腹壁被关闭。Sham-operated动物没有结扎和操纵进行了剖腹手术和肠穿孔。所有小鼠自由获取食物和水从麻醉后复苏。调查GSK-3的角色β在CLP-induced肝损伤,老鼠接受SB216763(25毫克/公斤,i.p。Sigma-Aldrich,圣路易斯,密苏里州)或车辆(10%二甲亚砜,DMSO, Sigma-Aldrich) 1 h, CLP后6 h, 12 h。SB216763治疗的剂量被选中后,先前的研究[22,23]。老鼠被杀死在再灌注6 h和20 h。肝损伤、肝细胞凋亡、炎症细胞因子、转录因子核因子-κB (NF -κB)激活,营地反应元件结合蛋白(分子)活化进行了分析。

2.3。肝损伤评估

评估肝细胞损伤CLP后,血清丙氨酸转氨酶(ALT)和天冬氨酸转氨酶(AST)使用一个自动化学分析仪(日立有限公司日本东京)。

2.4。组织病理学

肝组织缓冲福尔马林固定在4.5%至少24小时。石蜡包埋了使用标准技术。部分(4μ米)与hematoxylin-eosin染色。

2.5。MPO免疫组织化学

deparaffinization之后,补液,抗原检索,部分被孵化与髓过氧物酶(MPO)抗体(1:50;Abcam,剑桥,英国)在室温下1 h,其次是孵化与山羊anti-rabbit二级抗体,然后用一个diaminobenzidine工具包。MPO-positive细胞数在5大功率领域(HPFs分区)/在显微镜下部分(×400),和细胞的数量/字段显示。

2.6。RAW264.7细胞培养

小鼠巨噬细胞的细胞株RAW264.7购买类型文化收藏的中国科学院(中国上海)。细胞在DMEM培养基培养(表达载体,卡尔斯巴德,CA)补充10%胎牛血清,2毫米谷氨酰胺,青霉素(100国际单位/毫升),和链霉素(100μg / mL)在37°C下空气/气体有限公司2(95:5)。细胞被镀的密度5×105细胞/在细胞因子测定的24-well板或2×106细胞/在西方墨点法6-well板。有限合伙人(10 ng / mL)被用来激活细胞。SB216763 (10μ米)被用来抑制GSK-3β。

2.7。Caspase-3活动分析

相对caspase-3活动在发现肝脏caspase-3比色测定试剂盒(Abcam)根据制造商的指示。

2.8。NF -κB和活动分子分析

核和胞质提取设备从皮尔斯(热刺穿,罗克福德,IL)。核蛋白质从肝组织或RAW264.7细胞被孤立的根据制造商的指示。水平的NF -κB p65和活动分子核提取物被TransAM NF -量化κB p65 TransAM分子分析工具(活动主题,卡尔斯巴德,CA)根据制造商的指示。

2.9。酶联免疫吸附试验

肿瘤坏死因子的水平α血清中il - 6和培养介质进行了分析使用商用酶联免疫吸附试验(ELISA)试剂盒(研发系统、明尼阿波利斯、MN)。

2.10。凝胶电泳和免疫印迹

执行检测的蛋白质免疫印迹像前面描述的那样21]。等量的蛋白质分离12%由钠十二烷基sulfate-polyacrylamide凝胶电泳和凝胶转移至polyvinyldifluoride膜(通用电气医疗集团,白金汉郡,英国)。阻塞后,膜是孵化主要抗体:兔子anti-phospho-GSK-3β(Ser9) (1: 1000;细胞信号技术,贝弗利,MA),兔子anti-GSK-3β(1:1000年,细胞信号技术),兔子anti-phospho-glycogen合酶(1:1000年,细胞信号技术),兔子anti-cleaved caspase-3(1: 1000年,细胞信号技术),兔子anti-cleaved caspase-7(1: 1000年,细胞信号技术)和anti-glyceraldehyde-3-phosphate脱氢酶(GAPDH) (1: 20000;Sigma-Aldrich),在4°C温柔一夜之间晃动。检测进行了使用辣根peroxidase-conjugated山羊anti-rabbit IgG抗体(1:3000年,Abcam),其次是ECL免疫印迹检测试剂(通用电气医疗集团,白金汉郡,英国)。西方的屁股可视化柯达形象站(纽约罗切斯特Carestream健康Inc .)。

2.11。定量聚合酶链反应

实时聚合酶链反应(PCR)进行如前所述[24]。总RNA分离试剂盒试剂(英杰公司)根据制造商的指示。互补脱氧核糖核酸的合成进行了使用合成第一链cDNA工具包(表达载体)。定量PCR进行使用罗氏光周期系统(罗氏、Rotkreuz、瑞士)SYBR绿色主人混合(试剂盒、希尔登,德国)和引物。放大条件95°C(10分钟)其次是50周期95°C(30岁)和60°C(20岁)。引物用于放大特定的老鼠基因片段如下:TNF -α转发:5′-TGCTGGGAAGCCTAAAAGG-3′;反向:5′-CGAATTTTGAGAAGATGATCCTG-3′, il - 6: 5′-TCAATTCCAGAAACCGCTATGA-3′;反向:5′-CACCAGCATCAGTCCCAAGA-3, il - 1β转发:5′-CAGGTCGCTCAGGGTCACA-3′;反向:5′-CAGAGGCAAGGAGGAAACACA-3, il - 10: 5′-CACAAAGCAGCCTTGCAGAA-3′;反向:5′-AGAGCAGGCAGCATAGCAGTG-3,β肌动蛋白转发:5′-AGAGGGAAATCGTGCGTGAC-3′;反向:5′-CAATAGTGATGACCTGGCCGT-3′。相对量化的目标mRNA表达计算和进一步规范化看家基因β肌动蛋白。

2.12。统计分析

数据表示为±SD方法。组之间的差异进行评估的意义通过一维方差分析分析结合Bonferroni事后测试(比较类型:与vehicle-treated集团)。执行使用kaplan - meier生存分析日志等级测试。所有测试都使用SigmaStat v3.5执行(Systat-Software, Erkrath,德国)。一个 值低于0.05被认为是具有统计学意义。

3所示。结果

3.1。抑制GSK-3β改善CLP-Induced肝损伤和改善生存

确定GSK-3β抑制可能减弱肝损伤在脓毒症,GSK-3β抑制剂SB216763管理老鼠1 h, CLP后6 h, 12 h。如图1(一),而虚假的控制,磷酸化丝氨酸(9)GSK-3β水平在肝组织减少CLP后6 h,暗示GSK-3β激活了CLP的侮辱。抑制肝脏GSK-3β活动显示了体内糖原合酶的磷酸化,GSK-3下游底物β。如图1 (b)与vehicle-treated组相比,CLP导致显著增加血清ALT和AST水平。然而,SB216763政府明显减毒CLP造成的肝损伤。组织学检查显示显著的CLP后肝组织损伤,表明肝细胞肿大和白细胞浸润。GSK-3的抑制β导致这些变化的显著衰减(图1 (c))。地址是否GSK-3β抑制是脓毒性引起的小鼠CLP的好处,生存是评估在CLP后48 h。如图1 (d),GSK-3β抑制剂SB216763治疗显著增加小鼠的存活率。Vehicle-treated老鼠48小时存活率为27%。相比之下,与SB216763治疗组小鼠的存活率为53%。

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图1
GSK-3β抑制提高生存和防止CLP-induced肝损伤。化粪池的老鼠接受SB216763(25毫克/公斤,i.p。)或车辆(DMSO)在1 h, CLP后6 h, 12 h。(一)肝脏样本收获在CLP后6 h和受到磷酸化蛋白免疫印迹分析(丝氨酸9)GSK-3β磷酸化和糖原合成酶(GS)。(b) ALT和AST水平进行分析来衡量肝细胞损伤。数据显示为平均数±标准差。 ,# 相比之下,vehicle-treated集团。(c)肝脏标本采样20 h CLP后与苏木精和伊红染色法染色(原始放大×400)。代表图像从6小鼠/组。(d) kaplan meier方法用于确定CLP后存活率的差异。 分析了价值日志等级测试。 相比之下,vehicle-treated集团。
3.2。抑制GSK-3β调节促炎细胞因子的表达和CLP后中性粒细胞浸润

测试是否GSK-3β抑制可以减弱肝损伤在脓毒症通过抑制炎症,肿瘤坏死因子-的生产α、il - 6、il - 1β,分析了il - 10在CLP后6 h。如图2(一个),CLP导致显著增加的mRNA水平TNF -α、il - 6、il - 1β,il - 10。肝脏肿瘤坏死因子-α、il - 6和il - 1β信使rna SB216763管理水平明显较低。相比之下,il - 10 SB216763 mRNA水平显著增加的管理。此外,GSK-3的抑制β显著降低血清TNF - CLP-induced生产α和il - 6水平(图2 (b))。MPO染色的数量正渗透到肝脏测定中性粒细胞。肝脏嗜中性粒细胞浸润在20 h CLP后显著增加。然而,SB216763政府显著降低CLP-induced增加中性粒细胞的浸润(图3)。这些结果表明,抑制GSK-3β缓解CLP后肝脏的炎症。

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图2
GSK-3β抑制变弱CLP后炎性细胞因子的生产。(一)GSK-3β抑制TNF -的mRNA表达改变α、il - 6、il - 1β,il - 10在脓毒性小鼠的肝脏。(b)血清TNF -α通过ELISA和il - 6水平进行评估。数据显示为平均数±标准差。 每组。 ,# 相比之下,vehicle-treated集团。
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图3
GSK-3β抑制减少肝脏CLP后的中性粒细胞浸润。(a) MPO染色进行肝脏部分从CLP后小鼠20 h。(b) MPO-positive中性粒细胞的数量,渗透到肝脏测定(原始放大×400)。代表图像从6小鼠/组。数据显示为平均数±标准差。 每组。# 相比之下,vehicle-treated集团。
3.3。抑制GSK-3βCLP后调节转录因子的活动

获得洞察潜在机制负责GSK-3的抗炎效果β抑制,GSK-3的效果β抑制NF -κB和分子活动评估。NF -的活性κB和分子是CLP后显著增加。然而,NF -κB活性显著抑制SB216763-treated动物在CLP侮辱vehicle-injected动物相比。相反,激活核分子增强后的肝脏GSK-3的抑制β(图4)。

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图4
GSK-3β抑制NF -调节κB和分子CLP后激活。老鼠受到CLP和对待SB216763(25毫克/公斤,i.p。)或车辆(DMSO)。CLP后肝脏样本收获20 h。NF -κ活动,以及活动分子,是评估。数据显示为平均数±标准差。 每组。 ,# 相比之下,vehicle-treated集团。
3.4。抑制GSK-3β调节巨噬细胞中的转录因子活动

进一步了解底层信号转导途径参与炎症反应的调节由GSK-3 CLPβ,GSK-3的效果β抑制促炎细胞因子的生产在巨噬细胞在体外评估。RAW264.7细胞与LPS刺激的缺席或SB216763的存在。如图5(一个),GSK-3β抑制显著降低TNF -的生产α、il - 6和il - 1β但是增加了il - 10基因诱导6 h(文化。同样,肿瘤坏死因子-α在培养介质和il - 6蛋白水平急剧增加与有限合伙人在治疗后6 h;GSK-3β抑制TNF -减少了生产α和il - 6水平。调查是否GSK-3的抗炎效果β是通过介导的抑制NF -κB和分子途径,我们检查了GSK-3的效果β抑制核活动的NF -κB和分子。如图5,GSK-3β抑制显著抑制NF -κB活动,但增加分子的活动。

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图5
GSK-3β抑制减少促炎细胞因子刺激培养的巨噬细胞表达有限合伙人。(一)RAW264.7细胞与LPS刺激6 h在没有或SB216763 (10μ米),TNF -α、il - 6、il - 1β,il - 10 mRNA表达水平是衡量定量PCR。(b) TNF -α和il - 6浓度培养介质通过ELISA测定。(c) RAW264.7细胞被刺激与1 h在没有或有限合伙人SB216763 (10μ米)。NF -κ活动,以及活动分子,是评估。数据显示为平均数±标准差。 每组。 ,# 相比之下,vehicle-treated集团。
3.5。抑制GSK-3β减少肝细胞凋亡

测试是否GSK-3β可以减弱肝细胞凋亡,抑制肝脏caspase-3活动评估在20 h后CLP的侮辱。虚假的经营活动的动物相比,vehicle-treated caspase-3活动显著增加的动物。GSK-3的抑制β显著降低caspase-3活动CLP(图的感应6(一))。此外,vehicle-treated动物表达高水平的裂解caspase-3和裂解caspase-7蛋白质,由GSK-3显著降低β抑制(图6 (b))。这一发现表明,抑制GSK-3β可以减弱CLP-induced细胞凋亡。

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图6
GSK-3β防止CLP-induced抑制肝细胞凋亡。(a)小鼠受到CLP和对待SB216763(25毫克/公斤,i.p。)或车辆(DMSO)。CLP后肝脏样本收获20 h。caspase-3活动测量。数据显示为平均数±标准差。 每组。# 相比之下,vehicle-treated集团。(b)的表达水平裂解caspase-3和裂解caspase-7被西方墨点法分析检查。

4所示。讨论

最近的研究表明,GSK-3β抑制在LPS-induced感染性休克保护特性。然而,GSK-3的角色β抑制住败血症引起的损伤幼童腹壁薄弱的发病机理及其调节机制仍知之甚少。在目前的研究中,我们记录GSK-3β通过抑制炎症反应抑制防止CLP-induced肝损伤和肝细胞凋亡。我们的数据也表明NF -κB和调控的分子机制是著名的途径参与GSK-3的保护作用β在CLP-induced抑制肝损伤。

抑制GSK-3β抑制全身炎症和授予保护CLP-induced肝损伤。GSK-3β参与许多细胞内功能包括调节细胞活化、分化、和生存12,13]。在由GSK-3多样化的功能β、炎症最近成为有趣的一个主要重点。最近的研究表明,GSK-3β是一个至关重要的因素在炎症过程中(14- - - - - -16]。GSK-3β抑制已经成功测试了在脓毒症作为一种保护策略。Dugo等人首先证明了GSK-3β抑制不仅抑制促炎细胞因子的生产,还增加了抗炎细胞因子表达式,它提供了一种生存优势和减毒器官损伤LPS-induced脓毒症模型16]。GSK-3的保护作用β抑制住细菌感染的进一步证明。张等人证明,GSK-3的抑制β抑制炎症反应和授予感染的小鼠的生存优势土拉杆菌内(18]。最近,使用SB216763作为抑制剂,常和他的同事们发现GSK-3β抑制促炎细胞因子的表达减少,提高了生存率streptococcus-infected老鼠(组17]。我们之前证明GSK-3β抑制由锂降低肝脏I / R损伤,至少部分通过抑制炎症大鼠(21]。在协议与这些研究中,我们表明,抑制GSK-3β减少炎症,CLP后减毒肝损伤,改善生存。这些发现表明GSK-3β抑制在脓毒症可以保护肝脏免受炎症反应热烈。

GSK-3β众所周知,调节NF -κB信号,在脓毒症的病理生理学中起着举足轻重的作用25]。转录的促炎介质,包括细胞因子、趋化因子,不,发生主要是通过激活NF -κb .败血症患者促炎介质循环增加,与疾病严重程度(26,27]。NF的活动——的封锁κB利用基因或药物的方法成功地减少了NF -κB-mediated细胞因子和抑制多个器官炎症和损伤在脓毒症和/或内毒素,表明抑制NF -κB可以在脓毒症(一种很有前途的治疗目标28- - - - - -30.]。GSK-3β能够影响NF -κ活动由几个不同的机制。Dugo GSK-3等人了β抑制减少Ser536磷酸化p65对NF -但没有影响κB / DNA结合的活动增加肺癌和减少了NF -κ由于il - 1 B p65活动在人类胚胎肾细胞体外16]。马丁等人发现GSK-3β监管促炎和抗炎细胞因子的生产LPS-stimulated单核细胞通过增加核活动,提高其与CREB-binding蛋白质分子同时减少NF -之间的交互κB p65和CBP (15]。lithium-treated肝细胞、施瓦贝和布兰诺GSK3证明,抑制NF -受损κB的活动,但我κ退化和NF - BκB DNA结合活性没有影响(31日]。在这项研究中,我们发现GSK-3β监管CLP-induced炎性细胞因子生产的不同影响激活NF -κB和分子。

有越来越多的证据表明,细胞凋亡也参与sepsis-induced肝功能异常。最近的研究表明,GSK-3β从内毒素抑制保护肾细胞19)和减弱肝脏I / R损伤(22通过抑制细胞凋亡。我们的研究结果表明,GSK-3β抑制抑制凋亡细胞死亡。GSK-3凋亡效应的机制β抑制作用尚不清楚。细胞凋亡可能是由浸润中性粒细胞或macrophage-derived肿瘤坏死因子等细胞因子-α,ROS,没有。王等人发现GSK-3抑制剂下调LPS-induced肾细胞凋亡减少TNF -的数量α生产(19]。此外,不同类型的肝损伤的研究结果也支持了假设GSK-3的保护作用β通过antiapoptosis抑制。小鼠模型的肝脏I / R损伤,夏和他的同事们表明GSK-3β抑制剂增加β连环蛋白积累,进一步增强凋亡信号通过感应bcl - 2和存活素表达(22]。这个结果进一步支持了我们之前的研究中,这表明GSK-3β抑制由锂降低小鼠肝细胞凋亡在肝脏I / R (21]。此外,GSK-3β能够阻止细胞凋亡的抑制被显示在D-galactosamine / LPS-induced肝损伤减少内质网应激(20.]。

5。结论

总之,我们记录GSK-3β抑制可以改善脓毒症小鼠的生存幼童腹壁薄弱,改善肝损伤和肝细胞凋亡减少。似乎机制包括抑制炎症反应的能力通过调制NF -κB和活化分子。这些发现表明,抑制GSK-3β可以作为一个替代治疗策略除了抗生素治疗。

利益冲突

作者宣称没有利益冲突有关的出版。

确认

这个项目是国家自然科学基金的赠款支持中国(国家自然科学基金委)(81300343)和专业研究基金会对中国高等教育的博士项目(SRFDP) (20130142120074)。