文摘
腹膜炎的特点是协调涌入各种白细胞的亚种。白细胞招聘的模式是由主要由腹膜间皮的细胞和巨噬细胞分泌的趋化因子。我们也曾表明,某些趋化因子可能由人类腹膜成纤维细胞(HPFB)。我们的研究的目的是评估的潜力HPFB文化释放CCL5、单核白细胞的强有力的化学引诱物。静HPFB结构上没有或微量的CCL5发布。刺激HPFB il - 1β和肿瘤坏死因子-α导致时间(96小时)和增加存在剂量依赖的相关性CCL5表达和释放。干扰素-γ就不能产生CCL5分泌在范围广泛的浓度(0.01 -100 U /毫升)。然而,它放大吗TNF -的影响α和il - 1β通过upregulation CCL5 mRNA。此外,预处理细胞干扰素-γ调节CD40受体,使HPFB应对重组的CD40配体(CD40L)。接触干扰素-γ对待HPFB,但不是控制细胞,CCL5 CD40L导致感应存在剂量依赖的相关性。这些数据证明HPFB合成CCL5针对炎症介质存在于腹膜腔发炎。HPFB-derived CCL5因此可能导致单核白细胞在腹膜炎的腹腔内招聘。
1。介绍
腹膜透析(PD)是一种有效的替代血液透析作为一个拯救生命的慢性肾脏疾病患者的肾脏替代治疗。然而,这项技术可能会失败的结果腹膜感染反复发作导致腹膜膜损伤和损失的超滤能力(1,2]。腹膜腔通常包含变量的居民白细胞数量,以巨噬细胞为主的淋巴细胞(主要是记忆T细胞),树突和自然杀伤(NK)细胞(3]。相比之下,急性腹膜炎的特点是大量多形核白细胞(中性粒细胞)4]。中性粒细胞摄取入侵微生物,然后逐渐清除,取而代之的是单核细胞(单核细胞、巨噬细胞和淋巴细胞),腹腔内恢复体内平衡。整个过程是由一个复杂的网络细胞因子、生长因子、粘附分子,分子来自病原体和受损的细胞5]。在这方面,各种类创建的趋化因子趋化现象的渐变,调解具体白细胞亚种群迁移进入腹腔。在早期阶段的腹膜炎促炎细胞因子(TNF -α和il - 1β)来自常驻巨噬细胞诱导的表达科学家吸引中性粒细胞的趋化因子。然后,在干扰素——的影响γ和il - 6,趋化因子表达变化的模式,这样CC趋化因子支配和调节单核细胞招聘6]。
腹膜炎期间产生趋化因子主要由cytokine-stimulated覆盖腹膜间皮的细胞薄膜。然而,近年来,它已成为明显,嵌在腹膜间质成纤维细胞行为不仅结构细胞,也可能作为趋化因子的重要来源7]。因此,通过生产各种趋化因子成纤维细胞可能修改炎症反应的强度和持续时间(8]。我们之前已经证明人类腹膜成纤维细胞(HPFB)产生大量的科学家趋化因子,吸引和促进中性粒细胞的生存期间PD-associated腹膜炎(9]。此外,HPFB能够产生CCL2,属于CC趋化因子和主要充当了单核细胞化学引诱物(7]。
CCL5 (CC-chemokine配体5)是另一个CC趋化因子家族的成员。首次发现在T细胞和指定咆哮(监管在激活正常T细胞表达和分泌),CCL5是一个8 kDa 68个氨基酸组成的蛋白质(10]。除了淋巴细胞外,它还被发现是由基质细胞。代理通过三种类型的趋化因子受体CCR1、CCR3和CCR5, CCL5广泛chemoattractive T淋巴细胞和NK细胞,单核细胞,嗜碱性粒细胞,嗜酸性粒细胞11]。有趣的是,一旦T淋巴细胞达到受伤的网站,成为与特定抗原激活,他们开始生产大量的CCL5 3 - 5天后,维护和增强免疫应答。虽然有大量的重叠在CC趋化因子的生物活性,在小鼠实验研究证明CCL5缺乏与t细胞增殖和功能受损(12]。这个观察表明CCL5独特的t细胞招聘体内所必需的。因此,在本研究,我们分析了如何促炎细胞因子已知存在于腹膜成纤维细胞的发炎腹膜调节CCL5生产。
2。材料和方法
除非另有规定,所有化学物质来自Sigma-Aldrich(圣路易斯,密苏里州,美国)正欲和文化塑料都是猎鹰(德国海德堡)。细胞培养基和胎牛血清(FCS)表达载体/生命技术(达姆施塔特,德国),和其他细胞培养试剂从Biochrom AG(德国柏林)。人类重组细胞因子和anticytokine抗体来自研发系统(德国威斯巴登)。干扰素-γ具体活动2×104标准单位每1谁μg蛋白(1 U /毫升= 50 pg / mL)。
2.1。隔离和人类文化腹膜成纤维细胞(HPFB)
HPFB显然被孤立的标本的正常网膜获得择期腹部手术的病人。组织处理四个轮与胰蛋白酶消化,其他地方的详细描述(13]。HPFB被梭形外观确认,形成并行阵列和轮生体的融合(13),和积极的免疫染色纤维母细胞特定蛋白1 (FSP-1) [14]。细胞被传播在火腿的F12培养基补充与青霉素(100 U /毫升),链霉素(100μ氢化可的松(0.4 g / mL)μg / mL), 10% (v / v) FCS。HPFB文化是维持在37°C在湿润的气氛中95%的空气和5%的有限公司2。所有实验用细胞从第一个3通道和细胞来源于不同的捐赠者。在实验之前,细胞呈现静止通过减少FCS 48小时浓度到0.1%。图中指定的细胞被视为传奇。曝光后,上层清液收集并存储在整除−80°C到化验。
2.2。CCL5蛋白质测量
HPFB CCL5分泌蛋白的浓度测量与DuoSet免疫测定开发工具包(研发系统)。试验设计和执行根据制造商的指示。敏感性分析是5 pg / mL。
2.3。基因表达分析
CCL5基因的表达是评估与逆转录(RT)和PCR。提取总RNA, RNA蜜蜂(美国Tel-Test Friendswood, TX),纯化与RNeasy工具包(试剂盒,汉堡,德国)和反向转录成cDNA六聚体随机引物,如[15]。传统semiquantitive PCR进行本质上作为CCL5和被罗布森等人β肌动蛋白(16为CD40 [], Abdel-Haq等人17]。精确的定量CCL5信使rna是由实时PCR。反应进行了罗氏LightCycler II使用20 ng cDNA,由于“快速上手”项目DNA主人SYBR绿色我试剂按照制造商的指示(罗氏应用科学,印第安纳波利斯,美国)。引物配对(TIB的Molbiol,柏林,德国)跨越内含子,消除潜在的污染基因组DNA扩增。使用以下引物:CCL5(基因库NM_002985.2)向前,GAGTATTTCTACACCAGTGGCAAG;相反,TCCCGAACCCATTTCTTCTCT;GAPDH(基因库NM_002046.4)向前,TGATGACATCAAGAAGGTGGTGAAG;相反,TCCTTGGAGGCCATGTGGGCCAT。循环参数如下:变性在95°C 10年代,5 s退火在63°C, 72°C伸长了20年代40周期。融化曲线分析从60°C到95°C 0.5°C的增量。 Quantitative PCR data for CCL5 were normalized based on GAPDH transcript levels. Run data were analysed by “second derivative maximum” with the quantification program Quant versions 2.7 and 3.0.
2.4。统计分析
数据提出了均值±SEM结果的独立实验细胞不同的捐赠者。统计分析进行了使用GraphPad Prism 5.00软件(GraphPad软件公司,拉霍亚,CA,美国)。数据比较与重复测量方差分析Newman-Keuls修改或配对以及,如适当。一个值< 0.05被认为是显著的。显著差异而适当控制用星号表示:;;。
3所示。结果
3.1。诱导il - 1的HPFB CCL5生产β和肿瘤坏死因子-α
CCL5释放的数量结构上由静止HPFB几乎没有可检测(图1)。相比之下,刺激的HPFB重组促炎细胞因子il - 1β和肿瘤坏死因子-α导致时间和剂量依赖性CCL5分泌。释放CCL5对il - 1的回应β明显高于背景水平的12 - 24小时内孵化,72小时后到达高原。CCL5生成的时间进程的相同浓度的TNF -α遵循了类似的模式;然而,更大的大量的CCL5(图生产1(一))。评估细胞因子的剂量效应实验表明il - 1β是有效的已经在浓度低至1 pg / mL和效果达到饱和100 pg / mL(图1 (b))。肿瘤坏死因子-α能够刺激CCL5释放浓度范围从100到10000 pg / mL。
(一)
(b)
(c)
(d)
预处理的HPFB放线菌素D导致剂量依赖性抑制细胞因子诱导CCL5分泌,表明il - 1的刺激效应β和肿瘤坏死因子-α发生在转录水平(图1 (c))。事实上,治疗HPFB与il - 1β或肿瘤坏死因子-α导致时间upregulation CCL5 mRNA的信号,由传统的半定量PCR(图可视化1 (d))。
3.2。干扰素的效果,γ由HPFB CCL5生产
干扰素-γ在浓度范围从0.01到100 U /毫升不产生CCL5 HPFB生产。然而,它放大CCL5释放引起的肿瘤坏死因子-增效剂α(图2)但对较小程度上il - 1β(没有显示)。是时间(图的影响2(一个))和相关的剂量干扰素-γ和肿瘤坏死因子-α(数据2 (b)和2 (c))。干扰素-的浓度γ低至0.1 U /毫升是能够放大1000 pg / mL TNF -的影响α。另一方面,25 U /毫升IFN -γ放大的影响施加10 pg / mL TNF -α10倍以上。
(一)
(b)
(c)
(d)
(e)
(f)
虽然干扰素-γ本身不能产生CCL5信使rna,它产生了快速增加(1小时内)协同TNF -α简况CCL5表达式,它持续超过24小时(图2 (d))。定量评估显示,CCL5 mRNA表达回应TNF -的组合α+干扰素-γ大约是10倍大于诱导的肿瘤坏死因子-α单(图2 (e))。
3.3。干扰素-特异性和时机的影响γ和肿瘤坏死因子-αHPFB CCL5释放
干扰素-特异性结合的刺激γ和肿瘤坏死因子-α验证了在实验中使用阻塞抗体。中和干扰素-γ减少CCL5生产水平达到治疗肿瘤坏死因子-α单(图2 (f))。反过来,anti-TNF -α抗体完全废除CCL5分泌TNF -的反应α+干扰素-γ。同一个类的控制抗体并不影响CCL5释放。确定肿瘤坏死因子的协同效应α和干扰素-γ序列相关的刺激,HPFB孵化的存在与否,TNF -α或干扰素-γ24小时,然后洗净,再刺激进一步(表24小时1)。这些实验显示出某种程度的启动与TNF -α或干扰素-γ。然而,最大的协同作用时观察到的细胞因子都是应用在一起。有趣的是,结合刺激与肿瘤坏死因子的影响α和干扰素-γ第一24小时仍坚持在接下来的24小时,即使没有细胞因子。
3.4。影响CD40配体(CD40L)在HPFB CCL5感应
CD40L, TNF -的成员α家庭,是表达的单核细胞浸润腹膜腹膜炎期间(18]。因此,我们已检查是否能够产生CCL5 HPFB CD40L。原来CD40L在控制细胞,但几乎没有效果刺激CCL5存在剂量依赖的相关性在HPFB发布使用干扰素-γ(图3)。我们然后使用PCR评估表达式HPFB CD40、CD40L的受体。如果细胞不表达CD40信使rna;然而它的存在可能与干扰素治疗后,检测到γ。因此,随后的刺激和CD40L诱导CCL5 mRNA表达细胞使用干扰素-γ。
(一)
(b)
4所示。讨论
趋化因子的具体招募白细胞亚种群控制炎症反应过程中是至关重要的。因此,趋化因子生产的监管同样重要。我们已经表明,腹膜成纤维细胞产生大量的趋化因子CCL5。这一观测结果符合的成纤维细胞作为前哨细胞提供地址编码白细胞迁移(19]。以往的经验显示,腹膜间皮的细胞合成CCL5对炎性细胞因子(16,20.,21]。然而,腹膜炎可能导致严重的间皮的细胞损伤和剥落22,23]。腹膜成纤维细胞的功能可能会成为必不可少的,提供一个替代和/或额外的趋化因子的来源。已经证明了虽然CCL5生产纤维母细胞从其他地方,如胰腺(24)、皮肤(25,26],齿龈[27),鼻粘膜(28,29日),滑膜(30.),重要的是研究函数的成纤维细胞从组织中获得的利益。因为成纤维细胞显示组织表型,包括不同的趋化因子的表达模式31日,32),这可能导致白细胞浸润的组成特征。
在这里,我们表明,HPFB文化不释放CCL5既定的但有能力生产这个趋化因子新创与促炎细胞因子il - 1刺激的反应β和肿瘤坏死因子-α。其中,TNF -α似乎是一个更强有力的刺激,这是它对科学家趋化因子的影响相比,其生产HPFB被发现主要由il - 1诱导β(9]。这个微分响应il - 1β和肿瘤坏死因子-α可以提供另一层次的监管由HPFB趋化因子释放。
CCL5介导单核细胞的大量涌入,包括T细胞干扰素-的主要来源γ在透析腹膜(33]。干扰素-γ可以进一步放大CCL5生产通过协同诱导CCL5 mRNA。有趣的是,干扰素,γ施加这种影响尽管当自己表演,它不刺激CCL5。也观察到类似的结果间皮的细胞(16),滑膜成纤维细胞(34),内皮细胞(35,肺泡上皮细胞(36]。相比之下,在小鼠巨噬细胞干扰素-γ发现直接诱导CCL5 [37]。早期诱导CCL5基因对肿瘤坏死因子-α和干扰素-γ表明效果是由快速激活转录因子结合CCL5启动子。在这方面,核因子κB (NF -κB)被发现是一个首席调解员参与(36,38]。它可能会进一步配合干扰素调节因子(IRF) [39,40)和信号传感器和催化剂的转录(统计)38]。
除了t细胞,CCL5吸引也嗜酸性粒细胞。这个功能很有趣,腹膜嗜酸性粒细胞可能发生腹膜透析过程中(41)和腹膜膜可能与接触外国环境(42]。有趣的是,它已被证实在动物模型的腹膜透析腹膜后嗜酸性粒细胞和CCL5海拔尤为明显少接触透析液体视为生物相容性(43]。
CCL5-induced白细胞渗透包含t淋巴球,表达膜结合CD40L [18]。已经表明,不同来源的成纤维细胞表达CD40 mRNA很少;然而,它可以调节通过干扰素γ(44]。这种效应与CD40细胞表面表达的增加(44- - - - - -46]。我们发现,暴露在干扰素-γ增加CD40表达HPFB响应CD40L。从而诱导CD40的结扎CCL5 CD40L导致增加生产。这种效果观察以前在成纤维细胞从结肠粘膜发炎47),而且在腹膜间皮的细胞(45]。最有可能涉及NF -底层机制κB,由CD40结扎证明被激活(46]。CD40L-induced CCL5可能创造积极的反馈循环,进一步支持淋巴细胞大量涌入。在这方面,它已经表明,增加CD40L表达腹膜淋巴细胞和巨噬细胞支持过渡到单核细胞阶段的后期优势腹膜炎和及时解决炎症(18]。
总之,我们的研究表明腹膜的巨大潜力在反应激活成纤维细胞产生CCL5促炎介质过程中遇到腹膜炎。通过建立CCL5梯度,HPFB可能促进单核白细胞招募和成功解决炎症。另一方面,重复和/或严重的感染可能伤害防护间皮和暴露的底层HPFB过度刺激。在这些情况下,HPFB-derived CCL5可以促进白细胞渗透进入腹膜间质,这可能会导致长期的炎症。在这两种场景HPFB将积极参与细胞因子网络控制炎症。
利益冲突
作者宣称没有利益冲突有关的出版。
作者的贡献
Edyta Kawka和Janusz Witowski这项研究同样起到了推波助澜的作用。
承认
Edyta Kawka Janusz Witowski, Achim Jorres支持的欧洲培训&研究腹膜透析(EuTRiPD)计划,由欧盟资助的一个项目在居里夫人计划(287813号)。