文摘
9 -十六碳烯酸(PMA)抗炎和抗糖尿病的活动。我们测试这些PMA对葡萄糖稳态的影响是否和肝脏炎症,在与高脂肪饮食的老鼠(HFD),是PPAR -相关的。C57BL6野生型(WT)和PPAR -击倒(KO)标准饮食的老鼠(SD)或HFD为期12周治疗10周后油酸(OLA, 300毫克/公斤合著)或PMA 300毫克/公斤的合著的脂肪变性引起HFD与只在KO小鼠肝脏炎症,如肝IL1-beta水平增加,白介素、肿瘤坏死因子-;然而,HFD TLR4的表达增加和减少的表达IL1-Ra基因型。palmitoleate治疗明显减毒HFD引起的胰岛素抵抗,增加葡萄糖摄取和纳入肌肉体外,减少WT小鼠的血清AST水平,减少肝IL1-beta和il - 12水平KO小鼠,地的表达减少和增加的表达IL-1Ra WT老鼠,和减少了NF的磷酸化B (p65) KO小鼠的肝脏。我们得出这样的结论:palmitoleate变弱食源性胰岛素抵抗,肝脏炎症,损伤机制,不依赖于PPAR -。
1。介绍
慢性正能量平衡通过不适当的饮食习惯和久坐不动的生活方式会导致身体脂肪的过度堆积,称为肥胖,全世界患病率的增加令人担忧的是(1]。肥胖者有许多慢性和高度发展的更大风险事件疾病,如2型糖尿病、dislipidemia,肝脂肪变性,和某些类型的癌症2- - - - - -6]。
在这些疾病中,非酒精性脂肪肝病(NAFLD),它被定义为过度肝脂质积累,是最常见的并发症之一,与肥胖和胰岛素抵抗相关。随着肥胖流行病,非酒精性脂肪肝的发病率正在全球增长;非酒精性脂肪肝现在影响估计有20 - 30%的西方国家的人口(1]。如果不及时治疗,肝细胞脂肪变性可能发展成更严重的疾病,如非酒精性脂肪肝炎(纳什),肝硬化和肝细胞癌(7,8]。
一致的关键作用肝脏葡萄糖代谢的调节,过多的脂肪堆积在肝脏促进局部炎症过程经常与组织胰岛素抵抗的发展和主要葡萄糖体内平衡的变化。更具体地说,肝脂肪变性和炎症明显损害胰岛素抑制肝葡萄糖生产的能力,导致高血糖和高胰岛素血症(9,10]。因此,策略来抵消肝脂肪变性、炎症和增加肝葡萄糖生产是至关重要的慢性代谢疾病的预防和治疗。
9 -十六碳烯酸(16:1n7),单不饱和脂肪酸(n-7)的16个碳产生脂肪组织,已被证明有重要的代谢活动,改善全身葡萄糖体内平衡和胰岛素敏感性11]。事实上,9 -十六碳烯酸被证明刺激葡萄糖摄取增加骨骼肌(11)和降低肝脂肪变性、炎症和胰岛素抵抗,从而衰减高脂肪食源性肝葡萄糖生产(12]。
从力学上看,9 -十六碳烯酸降低肝脂肪变性通过抑制甾醇监管元素绑定的表达蛋白1 (SREBP1),一个转录因子,参与许多酶参与脂质合成的规定,包括脂肪酸合酶(FAS)和stearoyl-CoA desaturase 1 (SCD1) [13]。最近,这是证明9 -十六碳烯酸是一种积极的调制器的白色脂肪脂类分解通过一个机制,涉及的内容增加脂肪酶脂肪甘油三酯脂肪酶(ATGL)和需要PPAR核受体的激活α(14]。过氧物酶体扩散者激活受体α(PPARα),一个转录因子,主要表现在肝脏和调节的转录酶有关β氧化,促进脂肪酸氧化和减少整体异位沉积的三酰甘油(15]。此外,PPARα也显示出抑制促炎基因的表达,主要由灭活主促炎的转录因子NF吗κB,从而减少细胞因子的生产和组织炎症16]。
基于这些发现,我们测试的假设9 -十六碳烯酸变弱肥胖相关肝脂肪变性和炎症通过激活核受体PPARα。为此,野生型和PPARα敲除小鼠喂高脂肪的食物,未经处理或处理9 -十六碳烯酸,和评估肝脂肪变性和炎症和全身葡萄糖体内平衡。
2。材料和方法
2.1。动物的过程
雄性C57BL / 6 j野生型(WT)和PPARα击倒(KO)老鼠从杰克逊实验室获得和维护在一个十二12 h光暗周期(灯在06:00时)。在10到12周的年龄开始,老鼠被喂食高脂肪的饮食(HFD, 59%的热量来自脂肪,15%来自蛋白质,碳水化合物和26%)[17)或低脂饮食(最晚完成日期,9%的热量来自脂肪,15%来自蛋白质,从碳水化合物和76%)[17为12周。在过去的两周,HFD-fed老鼠接受油酸(300毫克/公斤体重)或9 -十六碳烯酸(300毫克/公斤体重)每天口服填喂法。剂量和治疗方案是基于以前的研究(13,14]。在喂养/治疗期间,小鼠的体重和食物摄入量每周评估。12周后,小鼠禁食4小时,然后牺牲的血液和组织样本的集合。附睾的、肠系膜和腹膜后脂肪组织被切割,体重,这些组织的总重量是表示为脂肪组织指数。肝脏重和存储在RNA和蛋白质的进一步分析。
2.2。分析方法
血浆总胆固醇、高密度脂蛋白胆固醇、三酰甘油水平,丙氨酸转氨酶活性测定酶的方法(Labtest,小湖圣诞、MG、巴西)。低密度脂蛋白水平估计使用Friedewald方程[18]。
2.3。组织学分析
小块的肝组织与多聚甲醛固定(10%),嵌入在石蜡,连续截面。幻灯片被苏木精和伊红染色分析脂肪变性(19]。
2.4。三酰甘油水平评估肝脏
从肝脏脂质提取chloroform-methanol,描述Folch et al。20.]。组织脂质提取的三酰甘油水平测定酶化验(Labtest,小湖圣诞、MG、巴西)。
2.5。胰岛素和葡萄糖耐量测试
小鼠禁食4人力资源收到一封腹腔内注射胰岛素(1 U /公斤体重)或d -葡萄糖(2克/公斤体重)。对于胰岛素耐量测试,血液样本(5μL)收集从尾静脉和10点之前,20、30、40分钟后丸胰岛素注射。血浆葡萄糖间隙恒定(小猫)线性回归计算的血糖水平测量胰岛素注射后5至30分钟;这是葡萄糖的区间线性衰减阶段发生(21]。同样,对于葡萄糖耐量测试,从尾静脉血样采集和15岁之前,30、60、90和120分钟后注射葡萄糖丸(22]。血糖的差异之前和期间血糖管理是用来计算曲线下的面积(AUC)。血糖的水平测量使用Accu-Chek性能glucometer(罗氏、圣保罗、SP、巴西)。
2.6。孤立的比目鱼肌肌肉胰岛素反应
比目鱼肌肌肉从安乐死WT KO小鼠小心地隔离,重(8 - 10毫克)和附着在不锈钢夹来维持静息张力。肌肉在Krebs-Ringer preincubated碳酸氢盐缓冲(KRBB)包含5.69毫米葡萄糖和1%牛血清白蛋白(BSA)、pH值7.4,pregassed(95%啊2,5%的公司2),搅拌(100振荡/分钟)。这些过程后,肌肉被转移到新的瓶包含同一个缓冲区包含0.3μCi /毫升D - U -14C]葡萄糖和0.2 oμCi /毫升2-deoxy-D - [2,6 -3H]葡萄糖的存在与否7纳米胰岛素。潜伏期后,样本处理测量吸收2-deoxy-D - [2,6 -3H]葡萄糖,将D - (14C]葡萄糖的合成14C)糖原,D -[进行脱羧反应的酶14C]葡萄糖,根据描述的方法challis et al。23埃斯皮纳尔,et al。24),和雷顿等。25]。
2.7。酶化验
肝脏是均质(1:10 w / v)的赛斯缓冲区,pH值7.4(250毫米蔗糖,EDTA 2毫米,10毫米Trizma基地,和50个国际单位/毫升肝素)。匀浆离心机,和上层清液储存在−70°C用于酶活性测定。蛋白质含量的匀浆是由洛瑞和他的同事描述的方法(26]。柠檬酸合成酶的活性被Srere化验根据描述的方法,和反应是由草酰乙酸(0.2毫米)添加到混合物三(100毫米,pH值8.0)、乙酰辅酶a(0.1毫米),dithiobis-2-nitrobenzoic酸(0.1毫米),特里同x - 100(0.1%), 2 - 4所示μ克浮在表面的蛋白质和监控在412 nm 3分钟25°C (27]。琥珀酸脱氢酶的活性测定方法的费舍尔和他的同事们(28)的吸光度下降造成的反应在600 nm减少2,6-di-chloro-indophenol的吩嗪methosulfate。苹果酸脱氢酶的活性被测量所述托等。29日]。NADH脱氢酶的活性(复杂的)评估根据Cassina和x射线检验30.),和琥珀酸的活动:细胞色素c氧化还原酶(复杂III)确定使用费舍尔和他的同事描述的方法(28]。
2.8。酶联免疫吸附试验(ELISA)
肝组织样本(80 - 100 mg)均质很仔细在缓冲区里帕(0.625%诺乃清洁剂p 40, 0.625%钠脱氧胆酸盐,6.25毫米磷酸钠,乙二胺四乙酸和1毫米在pH值7.4)包含10μg / mL蛋白酶抑制剂鸡尾酒(Sigma-Aldrich,圣路易斯,密苏里州,美国)。匀浆离心机,上层清液是用来确定蛋白质浓度通过布拉德福德化验(美国Bio-Rad大力神,CA)和il - 1的蛋白水平β引发,白介素、肿瘤坏死因子-α通过ELISA测定(DuoSet ELISA、研发系统,明尼阿波利斯,美国)。对il - 1β引发,白介素、肿瘤坏死因子-,检测灵敏度5.0 pg / mL的31.2到2000 pg / mL。
2.9。RNA隔离、逆转录和实时PCR
肝基因的表达与脂肪酸合成(ACC)和一些因素参与炎症(IL-1Ra TLR4和TNF -)是评估中存在SYBR绿色标记。为此,总RNA提取描述Chomczynski和萨基31日)和量化分光光度计(260海里),和总RNA的互补脱氧核糖核酸合成使用逆转录酶。引物的序列如表所示1;基因表达是比较量化的方法使用的表达GAPDH作为标准(32]。
2.10。西方墨点法
肝脏被小心翼翼地均质提取缓冲含有蛋白酶和磷酸酶抑制剂。合适的离心后,蛋白质浓度测定布拉德福德化验(Bio-Rad、大力神、钙、美国)。整除的每个示例相同的总蛋白浓度(25克)被稀释在Laemmli缓冲区,经过对SDS-polyacrylamide电泳凝胶电泳(sds - page),并从凝胶转移到硝酸纤维素。这些膜孵化与抗体toll样受体4 (1:500),Phospho-NFκB p65 (Ser536)(1: 500)(细胞信号技术,美国),或β微管蛋白(1:1.000)(美国圣克鲁斯生物技术),然后用一个anti-IgG孵化与过氧化物酶抗体结合。孵化项目后,这些膜孵化与过氧化物酶的底物(美国Biorad ECL工具包)和暴露于x射线胶片。
2.11。统计方法
数据提出了均值±SEM(平均数标准误差),分析了单向方差分析(ANOVA)其次是Bonferroni期末测验。分析使用GraphPad Prism 5.0软件。差异被认为是重要的时候。
3所示。结果
我们没有观察到任何差异变量分析WT - KO与控制SD饮食的老鼠(见表网上补充材料的补充http://dx.doi.org/10.1155/2014/582197);因此,为了客观,我们只显示WT的数据与标准控制饮食的老鼠。
正如所料,HFD显著增加WT和KO小鼠的体重增加,这低振幅的影响是在KO小鼠(分别为40%和10%,分别地。)(表1)。HFD引发的增加身体体重增加与老鼠肥胖明显增加,可以在更大的和大众的主要脂肪沉积(附睾的、腹膜后和腹股沟,看到脂肪组织指数,表2)。与白色脂肪组织,然而,HFD喂养并不影响质量的褐色脂肪组织在任何团体(表进行测试2)。HFD显著增加总胆固醇,KO小鼠,估计的低密度脂蛋白水平高(表2)。空腹血糖水平高于动物受到HFD,但KO小鼠血糖低于WT老鼠(表2)。治疗9 -十六碳烯酸(PMA)没有改变体重,白色和褐色脂肪组织的重量,或两组的血浆血脂,但9 -十六碳烯酸治疗减少了空腹血糖水平在WT和KO小鼠受到HFD(表2)。
我们的研究结果表明,独立于老鼠的基因型,HFD喂养减少了外围对胰岛素反应。WT, KO小鼠受到HFD降低葡萄糖的吸收,但WT小鼠胰岛素刺激的葡萄糖减少了(数字1(一)和1 (b))。相比SD-fed WT老鼠、WT和KO小鼠受到HFD有一个更大的血糖增加葡萄糖耐量试验(GTT)(图1 (c)),这个指标可以证实了AUC的增加(图1 (d));然而,相比HFD-fed WT老鼠,HFD-fed KO小鼠提出更高的葡萄糖耐量。此外,HFD WT小鼠的胰岛素反应受损但不是在KO小鼠(图1 (e)),他有一个更好的响应性胰岛素减少基特(图如图所示1 (f))。另外,我们观察到独立的老鼠基因型,palmitoleate明显减毒HFD诱导的胰岛素抵抗,增加葡萄糖摄取(图就证明了这一点1(一))和更好的应对胰岛素(图1在两组(h))。palmitoleate也增加了葡萄糖进入肌肉体外(图1 (b))和改进的宽容葡萄糖(图1 (d)但不是在KO小鼠)WT老鼠。
(一)
(b)
(c)
(d)
(e)
(f)
影响最大的组织之一HFD肝脏;事实上,肝脏的重量显著增加了在WT和HFD KO小鼠(表2);然而,HFD只有提升显著增加肝脏中甘油三酯的KO小鼠(图2(一个)),我们只观察到严重的脂肪变性肝组织学切片从KO白鼠HFD(图3)。WT和KO小鼠肝损伤的血清水平的增加标记受到HFD(图时,天冬氨酸转氨酶2 (b))。PMA并未改变肝脏的重量或异位堆积的脂肪在肝脏和似乎没有调节肝脂肪变性,但这种单一不饱和脂肪酸几乎完全恢复了WT小鼠的血清天冬氨酸氨基转移酶水平,表明可能会有一些PMA对肝损伤的保护作用(数字2和3)。
(一)
(b)
几个克雷布斯循环酶(柠檬酸合成酶的活性(图4(一))、琥珀酸脱氢酶(图4 (b))和苹果酸脱氢酶(图4 (c)))和电子传递链复合物的活动我和III(数据4 (d)和4 (e))进行评估。令人惊讶的是,所有的这些酶复合物,HFD只有促进苹果酸脱氢酶的活性差异,和HFD的影响的苹果酸酶活性KO小鼠更大。尽管如此,补充与9 -十六碳烯酸苹果酸脱氢酶的活性下降在WT老鼠(图4 (c))。
(一)
(b)
(c)
(d)
(e)
HFD引发的令人惊讶的是,肝脂肪变性与肝脏炎症在WT KO小鼠但不是老鼠,如增加肝水平的il - 1所示β(图5(一个)),il - 12(图5 (b))和一个更高水平的引发(图的趋势5 (c))和肿瘤坏死因子-α(图5 (d))在KO小鼠的肝脏相比WT老鼠受到SD。此外,在KO小鼠,palmitoleate摘要意思——肝水平降低βil - 12和导致减少的趋势引发和TNF水平α在肝脏(图5)。
(一)
(b)
(c)
(d)
虽然HFD ACC的mRNA表达减少和IL-1Ra WT老鼠(数字6(一)和6 (c)),HFD调节TLR4的表达在WT和KO小鼠(图6 (b))。此外,TNF的表达α不是HFD调制,但只增加了PPAR的击倒α(图6 (d))。Palmitoleate并不影响ACC mRNA的表达(图6(一)),但它倾向于减少肝地和TNF的表达α(数据6 (b)和6 (d)),扭转了下降IL-1Ra WT mRNA的表达情况,并大幅度增加IL-1Ra mRNA表达KO小鼠(图6 (c))。
(一)
(b)
(c)
(d)
随着增加TLR4 mRNA水平,TLR4和NF的磷酸化蛋白水平κB (p65)在丝氨酸增加KO小鼠喂养和HFD(图7);治疗9 -十六碳烯酸减少这两种炎症介质,减少的TLR4和NF的磷酸化水平Κ(图B (p65)7)。
4所示。讨论
在这项研究中,我们研究了核受体PPAR的假设α可能参与有益的活动9 -十六碳烯酸的衰减HFD-induced肝脂肪变性和炎症的发展和中断的葡萄糖稳态。相比这一假设,我们的主要结果表明,9 -十六碳烯酸对其有利影响肝脏炎症和损伤和改善胰岛素敏感性通过机制,不需要PPARα。
PPAR的激活α似乎是一个有前途的目标因为PPAR治疗非酒精性脂肪肝α也是一个基因参与脂肪酸氧化的关键调节器(33- - - - - -36和抗炎作用37,38]。事实上,它已经先前表明,PPAR的缺乏α可能会导致一个重要的肝脂肪变性和肝脏炎症(34,39]。在我们的研究中,我们观察到,PPARKO小鼠加剧肝脂肪变性和肝脏炎症HFD经过12周的接触。与此一致的是,苏et al。(2014)表明,PPAR缺陷α信号诱导线粒体和氧化压力与高果糖饮食的老鼠(40]。
9 -十六碳烯酸对非酒精性脂肪肝的影响是有争议的;而郭et al。12)显示,9 -十六碳烯酸增加脂肪酸在肝脏沉积,杨et al。13观察到它改善脂肪变性,降低甘油三酯的异位沉积。在这项工作中,我们没有观察到9 -十六碳烯酸对脂肪变性的影响或异位沉积引起的肝脏中甘油三酯HFD两组的老鼠,尤其是KO小鼠,非酒精性脂肪肝更明显。9 -十六碳烯酸的不同的影响在这些研究可能非酒精性脂肪肝的治疗时期,PMA的剂量,模型用于脂肪变性的感应。
我们也观察到其他9 -十六碳烯酸的影响,这是一个重要的信号分子,主要是由白色脂肪组织,被描述为一个insulin-sensitizing激素能够调节的一些代谢过程,如葡萄糖处理和胰岛素敏感性的骨骼肌和脂肪沉积在肝脏11,41]。同样的,我们的发现表明9 -十六碳烯酸能增加葡萄糖的吸收在孤立的肌肉刺激条件下,提高了边缘响应胰岛素的老鼠喂食HFD由PPAR机制不规范α。
在肝细胞脂肪生成的控制下的一系列关键基因,如固醇调节元件结合蛋白1 (SREBP1),脂肪酸合酶(FAS)、乙酰辅酶a羧化酶酶(ACC),和硬脂酰辅酶a desaturase 1 (SCD-1)。其中,FAS和ACC似乎特别病原反应酶负责脂肪从头合成,这可能是增加在非酒精性脂肪肝42,43]。认识提高,我们观察到PPARαko小鼠在ACC mRNA的表达增加因此加剧了异位脂肪沉积在肝脏,而WT老鼠ACC的表达较低,这表明这些动物的平衡调节机制,最有可能通过PPAR的激活α;这或许可以解释为什么WT老鼠HFD NAFLD和炎症反应低。结合ACC的增加,肝在KO小鼠促炎细胞因子水平的增加和HFD喂养。
HFD增加苹果酸脱氢酶(MDH)的活性WT KO小鼠和促进一个更大的增加老鼠。这种酶活性高,催化苹果酸转换成草酰乙酸和逆向反应,可能导致增加线粒体中的苹果酸含量。苹果酸可以运输到胞质和转换的MDH草酰乙酸盐,糖质新生途径的前体(44,45]。然而,除了这MDH活动的增多,我们观察到PPAR组αKO小鼠受到HFD较低在丙酮酸糖质新生耐量试验(数据未显示),表明这种过剩的克雷布斯循环中间体可能转换为其他途径,如脂肪从头合成,显示较高的表达水平的ACC和更严重的脂肪变性KO小鼠观察。9 -十六碳烯酸没有调节的活动克雷布斯循环酶或电子链运输车。
虽然9 -十六碳烯酸没有改善肝脂肪变性,这个ω7脂肪酸减少了WT和PPAR血清天冬氨酸氨基转移酶水平α基因敲除小鼠,这表明观察到减少肝损伤是PPAR的独立α。先前的研究已经报道,更高水平的AST表明更大程度的炎症在肝脏46];我们观察到增加肝PPAR的促炎细胞因子水平α敲除老鼠HFD,确凿的几项研究[11,14,35,39]。令人惊讶的是,9 -十六碳烯酸减少这些基因敲除小鼠的肝脏炎症,减少摘要意思——的水平β和il - 12在肝脏,再次表明,9 -十六碳烯酸的有益作用在肝脏被PPAR发生α独立的机制。
据报道,棕榈酸等饱和脂肪酸(0)通过TLR4可能增加炎症激活(47]。事实上,一些作者表明HFD补充也增加了TLR4的表达,表明这种受体在非酒精性脂肪肝的发展发挥了主要作用48,49]。在目前的研究中,我们观察到HFD TLR4的表达增加mRNA在WT和KO小鼠和TLR4蛋白质含量增加KO小鼠的肝脏,但9 -十六碳烯酸TLR4肝mRNA和蛋白水平降低,表明这单不饱和脂肪酸有很强的抗炎效果。
PPAR的激活α被描述为一个抑制NF机制κ激活,因此减少促炎基因的表达和促炎细胞因子的生产,这样TNF -α和il - 1250]。与此一致的是,我们观察到,TNF的表达α增加在KO小鼠即使受到SD。然而因为9 -十六碳烯酸能降低NF的丝氨酸磷酸化κB p65,增加了PPAR HFD只αKO小鼠,我们建议9 -十六碳烯酸的抗炎作用包括抑制NF的其他机制κB比PPAR的激活α。事实上,HFD减少IL-1Ra的表达这两种基因型,而9 -十六碳烯酸的表达增加IL-1Ra WT和KO小鼠。然而,IL-1Ra的表达是在更大程度上增加KO小鼠受到HFD和9 -十六碳烯酸处理。其他研究已经表明,AMPK活化可以提高独立于PPAR IL-1Ra水平α激活(51]。
因此,我们得出这样的结论:补充与9 -十六碳烯酸与油酸可以减弱胰岛素抵抗,但不是HFD通过引起的肝损伤,炎症机制,不取决于PPARα。
利益冲突
作者宣称没有利益冲突有关的出版。
补充材料
不同基因型对外围参数的影响。体重(BW),组织重量和血清三酰甘油、总胆固醇、高密度脂蛋白,估计低密度脂蛋白,空腹血糖、天冬氨酸转氨酶和肝的三酰甘油水平的野生型(WT)和PPARα淘汰赛(KO)标准饮食的老鼠(SD)。