文摘

虽然称为Na, K-ATPase抑制剂,其他几个细胞和系统性的行为归因于类固醇乌本苷(Oua)。特别是在免疫系统,我们的团队表明,乌本苷作用于淋巴细胞增殖减少,与糖皮质激素协同加强自发的胸腺细胞凋亡,减轻CD14表达和阻塞CD16 upregulation人类单核细胞。然而,乌本苷对树突状细胞(dc)的影响没有探索到目前为止。考虑到特殊的可塑性和DCs在免疫反应的重要性,我们的研究的目的是探讨DC成熟下乌本苷的影响。生成未成熟dc,人类单核细胞培养与il - 4和gm - csf(5天)。探讨乌本苷DC活化作用,DCs与TNF -刺激α48 h乌本苷的存在与否。TNF-induced CD83表达和il - 12在DCs孵化生产废除100海里乌本苷,尽管直流功能能力涉及淋巴细胞激活仍然没有改变。然而,肿瘤坏死因子-α全身的,差别抗原捕获对这些又是一个成熟的标志,甚至发生在乌本苷的存在。除此之外,乌本苷HLA-DR和CD86表达增加,而CD80表达式是维护。总的来说,我们的研究结果表明,DCs对乌本苷成熟到一个不同的类别,可能导致免疫力之间的平衡和宽容。

1。介绍

适当的免疫系统的功能需要,在几个方面,专业的抗原呈递细胞的作用,促进效应细胞的激活和增强免疫反应的延续。其中,树突状细胞(dc)在吸收扮演最重要的角色,过程,和演示抗原的天真的CD4, CD8,和B细胞,由于他们的能力产生这样的效果甚至一个相对小的数字和在抗原含量低(1]。

DCs来源于骨髓祖细胞和血液中循环迁移到外围组织之前不成熟的前体。它们来自不同的造血血统和基本分类两类:传统的和血浆DCs。第一个是通常分为亚型,子集从不同组织呈现特定的形态,表型,位置,细胞因子的生产概况和函数(2]。这些亚型开发由于不同细胞前体的承诺或环境因素对修改DC函数,进而提供更大范围的可能性来决定淋巴细胞的命运。专门的细胞亚型可以诱发积极响应针对多个抗原(1]但耐受性属性也被描述为DCs (3,4]。因此,由于免疫力的关键作用在控制,DCs广泛用于临床研究涉及T淋巴细胞的功能。

通过这种方式,调制的成熟和/或树突细胞的激活和功能是非常重要的,几项研究已经描述了一些情况下DCs存在这样的可塑性。例如,DCs成熟的维生素D (3), il - 10, TGF -β、雷帕霉素、或地塞米松伤者耐受性细胞(4]。此外,低氧供应条件(缺氧)可能抑制表面分子的表达与DCs的分化和成熟的能力,像MHC II级分子,CD80、CD86, CD40, CD1a [5]。丁酸钠的政府,一个修改染色质组蛋白脱乙酰酶复合组织,也对DCs的移植能力CD1a蛋白质在分化,CD1家族的一员,调解的脂质和醣脂类抗原,要么来自自我或病原体起源、CD1-restricted T淋巴细胞(6]。最后,DCs还可以回应其他内源性刺激,如炎症介质,神经肽,和激素7,8]。DCs的可塑性也表明他们可能受药物用于治疗慢性疾病。

强心剂类固醇乌本苷和其他相关苷已经在临床使用多年的充血性心力衰竭的管理。乌本苷调节肌细胞收缩性通过抑制Na, K-ATPase活动,这是治疗的基础上使用这类药物(9]。除了它的角色在肌细胞收缩,一些报告描述了乌本苷对免疫细胞的影响,因此,乌本苷可能也被认为是一种免疫调节物质(10- - - - - -15)修改炎症过程的能力(16- - - - - -18]。尽管经典描述为从植物中提取的糖苷Na有很强的亲和力,K-ATPase酶(Na, K-ATPase),研究表明,哺乳动物,包括人类,拥有一个内生的模拟植物的一些组织和乌本苷也流传在等离子体19,20.]。乌本苷水平通常增加急性压力和病理生理条件下,像高血压甚至怀孕21,22]。

虽然Na, K-ATPase已知细胞乌本苷的目标,一些证据表明其行为并不完全与Na, K-ATPase离子抑制流动,一些作者表明,信号通路的激活乌本苷发生甚至在正常Na, K-ATPase运输活动(23- - - - - -26]。

评估人类单核细胞在文化、描述,用100海里乌本苷治疗引发广泛的对这些细胞调节的影响。乌本苷诱导(差别CD14对这些10,11)和阻止大小增加导致adhesion-induced激活和促炎CD14的外观+/ CD16+分组人口(11]。同时,单核细胞暴露于乌本苷调节几个分子的表达与激活过程如CD69、CD80、CD86和HLA (11,15]。增加β细胞因子水平的il - 1、TNF -α(13- - - - - -15)和il - 1015)观察单核细胞文化暴露于乌本苷。各种信号通路被赋予不同的效果观察(10,11,13]。

然而,尽管很多行动描述为乌本苷在不同细胞免疫系统的,没有,据我们所知,公布的数据关于可能的这种物质对树突细胞的影响。因此,由于重视的细胞类型的控制适当的免疫反应,这是我们的利益分析乌本苷是否会影响树突状细胞的成熟和功能的能力。

2。材料和方法

2.1。DC分化

医院的伦理委员会大学Clementino弗拉加Filho-UFRJ同意研究协议,批准文号注册下的148/09。采集血样从外周血样本使用肝素钠从健康志愿者(罗氏,里约热内卢,巴西)抗凝。外周血单核细胞(PBMC)是由密度梯度离心法分离Ficoll-Paque(美国通用电气)。PBMC被播种的浓度5 106每口井的细胞(1毫升最终体积)2小时24-well板块(瑞士TPP),在湿润商会有限公司为5%2气氛在37°C。后来,不依从细胞被广泛的洗涤。贴壁细胞在RPMI1640培养介质(σ,化工有限公司美国)补充10%胎牛血清(500年的边后卫μL最终体积)有或没有50 ng / mL gm - csf(美国PeproTech)和50 ng / mL il - 4(美国研发生物系统),5天。在一些实验中,细胞与100 nM preincubated乌本苷(σ,化工有限公司、美国)24 h,紧随其后的是加入新鲜培养基或上述细胞因子。

2.2。直流激活

树突细胞,经过5天的文化,获得他们的新鲜培养基被介质含有gm - csf和il - 4的存在与否50 ng / mL TNF -α(美国研发生物系统),为进一步48 h。在一些实验中乌本苷(10点1和100海里)或p38抑制剂SB202109 (20μ美国M,西格玛化工有限公司)是在激活期间(48小时)。

2.3。DC表型分析

确定CD14、CD1a CD83、CD86 CD80、或HLA-DR表达式,DC分化和激活后,细胞收集和孵化与磷酸缓冲盐(PBS) + 10分钟的边后卫5%解决方案。细胞被染色了30分钟在4°C FITC共轭anti-CD14, FITC共轭anti-HLA-DR, PE共轭anti-CD1a, PE共轭anti-CD86, PE共轭anti-CD80, PE共轭anti-CD83(都来自BD生物科学,美国)。潜伏期后,细胞被洗PBS和分析流式细胞仪(美国Becton和Dickinson FACSCalibur)和数据分析通过软件4.3峰会(美国Dako)。

2.4。细胞因子的生产评估

dc分化了5天,然后与gm - csf细胞被孵化,il - 4, TNF -α或有限合伙人(100 ng / mL)的存在与否乌本苷(100海里)为进一步48 h。上层清液被收集并存储在−20°C到使用。IL-12p40和il - 10浓度测定和酶联免疫吸附试验(Duo-Set包、购买的研发系统,美国),根据制造商的指示。光密度是阅读在450 nm标日出基本(Tecan、奥地利)。

2.5。细胞生存能力分析

尽管MTT试验取决于细胞的代谢活动由于NAD (P) H通量可能用于细胞生存能力的决心,线粒体活动通常是可行的细胞的数量有关。在目前的实验中,2.5 106每口井的细胞被镀在96 -孔板(瑞士TPP) 5天。DC分化后,细胞的培养基被包含gm - csf的新鲜培养基,il - 4, TNF -α乌本苷的存在与否(10点1和100海里)48 h。然后,细胞被孵化为0.5μg / mL MTT(西格玛化工有限公司、美国)4 h。之后,上层清液被除去,与200年甲瓒晶体溶解μL(二甲亚砜(DMSO)。光密度是阅读在490 nm标日出基本(Tecan、奥地利)。

2.6。免疫印迹

DC分化后细胞孵化与gm - csf、il - 4, TNF -α乌本苷的存在与否对10分钟(100海里)。NF的激活 B是由免疫印迹分析。布拉德福德后测定蛋白质浓度的方法(27(60),样品μg / lane)受到钠十二烷基sulfate-polyacrylamide凝胶电泳(9%)和转移到聚乙二烯二氟化物薄膜(PVDF)。兔子anti-phospho-NF一夜之间,膜被孵化 B抗体(1:1000)或鼠标anti-actin (1: 5000)。抗体都是来自圣克鲁斯生物技术(美国CA)。膜清洗在TBS,然后被暴露于辣根peroxidase-conjugated二级anti-rabbit或anti-mouse IgG抗体(1:2000年,Bio-Rad实验室Inc . CA,美国)在室温下为60分钟。检测进行L-Pix化学photodocumentation系统(Loccus、SP、巴西)使用Luminata微孔(马、美国)。蛋白质分析了乐队的密度与ImageJ微。的平均值控制被设定为100%。

2.7。内吞作用分析

由FITC-dextran吸收吞噬能力评估。DC分化后细胞孵化与gm - csf、il - 4, TNF -α乌本苷的存在与否为进一步48 h(100海里)。然后,细胞的培养基被新鲜培养基含有FITC-dextran (40 kDa, 0.5毫克/毫升,σ化工有限公司,美国)。一半的细胞在4°C的环境评估的背景吸收,以便确定背景染色。1 h孵化在37°C后,细胞被洗两次冰冷的PBS和受流仪分析。

2.8。混合淋巴细胞反应

48 h后50 ng / mL的激活TNF -α,在100 nM乌本苷的存在与否,DCs为allostimulatory能力进行测试。为此,105淋巴细胞培养在96孔酶标(圆底)与不同浓度的同种异体DCs(1: 4, 1: 40岁和1:400)37°C的5%的股份有限公司2的气氛。胸腺嘧啶核苷掺入被6 h脉冲测量5天3H-thymidine (1μCi /嗯,Amersham生命科学),然后使用一个多井细胞收割机收割。3H-thymidine公司评估了液体闪烁计数,使用TriCarb 1600 ca计数器(帕卡德,Inc .)、美国)。

2.9。等离子体膜电位分析

探讨乌本苷是否可以调节等离子体膜电位在DC活化,树突细胞被孵化的阴离子亲脂性的potential-sensitive染料,即bis-oxonol (bis - [1, 3-dibutylbarbituric酸]trimethineoxonol)或DiBAC4(3),得到分子探针(美国),其它地方描述的方法(28]。短暂,分化DCs与250 nM DiBAC孵化30分钟4(3),在37°C公司为5%2氛围,在没有乌本苷或存在100 nM或1毫米。后这段时间,细胞的流式细胞术检测FACSCalibur设备(Becton和Dickinson,美国)。另外,未成熟dc是培养有或没有肿瘤坏死因子,在没有或100海里乌本苷的存在,48 h和250海里DiBAC进一步孵化4(3)在37°C公司为5%2的气氛。然后,实验进行如上所述。作为一个积极的控制膜去极化,DCs与50 mM氯化钾孵化30分钟。488纳米的励磁进行氩激光和荧光发射检测在530海里。一万个细胞检查每个条件下,通过软件和数据分析峰会4.3(美国Dako)。

2.10。评价Na, K-ATPase活动

乌本苷钠是一种已知的抑制剂,K-ATPase。来验证,如果在我们的模型中,乌本苷能显著抑制酶,不成熟的DCs培养48 h在100 nM乌本苷的存在与否。此外,部分细胞只收到100海里乌本苷在膜制备过程。腺苷三磷酸酶活性测定如下。

(32P]我获得了来自巴西原子能研究所(金额)。中使用的酶的合成γ- - - - - -32P] ATP (glyceraldehyde-3-phosphate脱氢酶、glycerol-3-phosphate脱氢酶triose-phosphate-isomerase, 3 -磷酸甘油酸激酶、乳酸脱氢酶)来自勃林格曼海姆(达姆施塔特,德国)。放射性ATP准备根据Walseth和约翰逊(29日)修改被玛雅et al。(30.]。蛋白质测量进行使用1毫克/毫升BSA作为标准。

微粒体分数从Ouabain-treated DCs通过差速离心贝克曼超离心机。简而言之,所有细胞(约1.4 106)提交给低渗的溶解在等缓冲(盐酸三10毫米+ 2毫米EDTA)。材料是在2500转/ 5分钟,以避免核碎片和旋转下来8000转/ 20分钟,以避免线粒体。包含Na膜分数,K-ATPase活动是通过收集和均化最终颗粒的离心90 50000转/分钟。颗粒在伊势resuspended缓冲区(12.5毫米咪唑+ 250毫米蔗糖+ 2毫米EDTA)和存储在−22°C用于活动的决定。Na, K-ATPase活动被测量的化验32从(πγ- - - - - -32P] ATP水解的微粒体与DCs(之前所述31日,32]。简单地说,45μg整除的微粒体准备被稀释到最后量0.5毫升10毫米Tris-HCl, pH值7.0,130毫米氯化钠,氯化钾20毫米,5毫米MgCl2,EGTA 2毫米。的反应是由ATP /(增加3毫米γ- - - - - -32P] ATP (1520 cpm / nmol)的特定活动,允许进行40分钟在37°C。的反应是停止添加0.2毫升0.4米高氯酸和管放置在冰浴。后的0.2毫升的冰水和400年μL的活性炭管在2000转离心10分钟,然后0.5毫升的上层清液收集巴斯德吸管和滤纸上发现磁盘。的32π被液体闪烁计数量化发布2100年帕卡德Tri-Carb LSC闪烁计数器。所有测量数据进行描述,没有1毫米乌本苷,活动对应Na的差异,K-ATPase活动。DCs膜准备展品的atp酶活性300到339 nmol /毫克/分钟。

2.11。统计分析

统计分析了使用方差分析和学生的一种方式 以及。的值 被认为是具有统计学意义。

3所示。结果

3.1。乌本苷对DC分化的影响

我们小组此前报道的发现与100 nM孵化后差别人类单核细胞CD14展出对这些乌本苷为24小时(10,11,15]。这样的发现是不相关的诱导细胞死亡,但似乎广泛调节调节主要的一部分,未分化的单核细胞(11]。然而,一个经典的情况单核细胞可能会失去CD14表达分化为树突状细胞。在分化,同时减少CD14,单核细胞逐渐开始表达表面分子CD1a,一个可以复制的过程在体外持续5天,并导致CD11c的分化+CD11b+骨髓DCs (6,33,34]。因此,探讨单核细胞的可能性使用乌本苷更倾向于树突状细胞分化,这些单核细胞进一步暴露于il - 4和gm - csf, DC分化的标准协议在体外(33]。

在目前工作单核细胞培养在100 nM乌本苷的存在与否,24 h。这个接触乌本苷后,细胞被洗,用新鲜的培养基培养5天。如图1(一)(上面板,灰度直方图),观察到在这个时期没有乌本苷,单核细胞CD14恢复蛋白质控制水平(控制,88.56%;Oua 92.31%),当比较值24小时暴露于乌本苷后获得的。在这种情况下,乌本苷治疗后的阳性细胞百分比分别为49.42%和87.22%,控制(图1 (b))。此外,见图1(一)5天后观察,没有CD1a表达式,表明乌本苷本身没有诱导分化的过程。

(一)
(一)
(b)
(b)
图1
在单核细胞CD14和CD1a表达模式培养与乌本苷(Oua)之前分化为树突状细胞。(a)细胞培养介质的存在与否100海里Oua 24 h,然后与介质或il - 4 + gm - csf (50 ng / mL) 5天允许单核细胞分化成直流。这一时期后,CD14和CD1a表达式被流式细胞术分析。直方图代表4个独立的实验显示CD14和CD1a表达模式在细胞培养中,细胞中il - 4 + gm - csf,治疗与100 nM Oua之前。R1和R2地区包括阳性细胞CD14和CD1a分别。阳性细胞的百分比和平均荧光强度在每个柱状图表示。(b)单核细胞与100 nM Oua孵化24 h。代表性的实验显示在控制细胞CD14表达模式(黑色直方图)和细胞内处理100海里乌本苷24 h(直方图)。

此外,图1(一)(底板,黑色的直方图)也表明当单核细胞分化成刺激树突细胞il - 4和gm - csf,正如预期的那样,一个强烈的CD14的百分比减少+细胞,以及增加CD1a的表达。然而,同样的价值观是实现乌本苷预处理后当细胞区分。因此,似乎并不能反映差别Ouabain-induced CD14对这些便利向DC分化。

3.2。在激活期间调制直流表面表型的乌本苷

几个作者报道,乌本苷诱导信号通路的激活13,24,35),例如,p42/44 MAPK和p38 MAPK。我们组所描述,乌本苷可能诱导或抑制p38 MAPK的激活,细胞类型依赖的方式(10,12]。鉴于p38 MAPK函数对树突状细胞激活(至关重要36),可以假设乌本苷可以调节DCs的另一个阶段,即最终成熟或通过p38信号激活。

许多表面分子的表达,研究了在乌本苷的存在与否来验证任何影响激活过程。

首先,我们测试的可行性未成熟dc分化后()在乌本苷和TNF -治疗α48 h,但没有发现不同的浓度(表用于我们的实验1)。下面的步骤是分析乌本苷是否能影响DCs的激活过程。成熟dc通常表现为大量的表面分子的表达可能促进T细胞的相互作用和激活。然而,尽管CD83分子的功能尚不清楚,其激活后表达刺激与DCs的许多方面激活有关。因此,为了调查是否乌本苷可能影响这个过程,未成熟dc与肿瘤坏死因子-刺激α没有和药理(100海里)的存在或生理(1纳米和10点)乌本苷的浓度,并CD83的表达进行了分析(图2)。只保证差异化DCs将评估,我们雇了一个门CD14 -人口。因为它可以观察到,100海里的乌本苷48 h诱发显著减少CD83 TNF -独立表达α刺激(数据2(一个)和2 (c))。这是观察到的阳性细胞百分比以及荧光强度。在TNF -α,100海里乌本苷能够抑制CD83表达式,但没有影响被观察到在使用这种激素的生理浓度(数字2 (b)和2 (d))。如图2 (e),我们的协议促进了一代的相对不成熟,未激活的,很低的CD83的表情。CD83相比,当我们表达的不成熟的DCs天5和7天的文化中,我们观察到这个表达式的增加,表明文化条件本身诱发一些这个分子的表达。因此,这些数据表明,乌本苷干扰CD83 upregulation诱导通过TNF -α或者被长时间的潜伏期在体外(图2 (e))。

表1
可行性的树突细胞孵化期间与乌本苷与TNF-α激活。
(一)
(一)
(b)
(b)
(c)
(c)
(d)
(d)
(e)
(e)
图2
乌本苷影响CD83表达式在树突状细胞激活。分化期(5天)后,细胞进一步培养48 h (b, d)存在或缺乏TNF-α(50 ng / mL) (a、c)和100海里的存在与否,Oua 1海里,或10点。CD83表达式被流式细胞术分析。数据表示为CD14的百分比−CD83+细胞((a)和(b)板)或荧光强度的手段(MFI: (c)和(d)板),和线条表示意味着至少八个独立的实验。(e)和il - 4细胞培养5或7天+ gm - csf和CD83表达进行了分析。积极染色细胞的百分比(R1)和他们的荧光强度在代表直方图表示。,∗∗∗,∗∗∗明显不同于控制(∗ ;∗∗ ;∗∗∗ )。

DC成熟的概念/激活依赖于MHC upregulation。激活刺激修改营业额和MHC基因表达,因此改变MHC分子的数量表达细胞膜(33,37]。

如前所述,p38磷酸化/激活激活的DCs至关重要。表面分子和细胞因子的表达等方面生产严重影响当p38 MAPK抑制(36]。在这里,我们评估CD83和HLA-DR在p38的表达抑制。正如所料,p38的抑制剂能够抑制CD83和HLA-DR表达式TNF -的存在α(数据3(一个),3 (b),3 (c)、职责)。

(一)
(一)
(b)
(b)
(c)
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图3
在激活期间CD83和HLA-DR树突状细胞上的表达。分化期(5天)后,细胞进一步培养48 h有或没有TNF-α(50 ng / mL),存在与否的20μM p38抑制剂(SB202109)。流式细胞术CD83和HLA-DR表达进行了分析。数据表示为(一)CD83的百分比+细胞,或(b) MFI CD83(平均荧光强度)+细胞,(c) HLA-DR的小额信贷机构+细胞,行表示的3 - 5个独立的实验。∗TNF-α显著不同(∗ )。

然后我们探讨了乌本苷可能产生活化过程的障碍,因此,影响表面的表达HLA分子。为此,我们使用相同的协议如图2,但我们评估HLA-DR表达在100 nM乌本苷的影响。它可以观察到,几乎所有的未成熟dc表达HLA-DR(图4(一))。此外,细胞表面暴露于TNF -下HLA-DR水平增加α(所描绘的阳性细胞的荧光强度)和更高的细胞治疗肿瘤坏死因子-α加上乌本苷(图4 (b))。我们还观察到乌本苷就能够诱导显著增加HLA-DR水平(图4 (b))。

(一)
(一)
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(b)
图4
在激活期间HLA-DR树突状细胞上的表达。分化期(5天)后,细胞进一步培养48 h有或没有TNF-α(50 ng / mL),在100 nM Oua的存在与否。HLA-DR表达式被流式细胞术分析。数据表示为(一)HLA的百分比+细胞,或(b)小额信贷机构(平均荧光强度),和线条表示七个独立实验的手段。和∗∗∗明显不同于控制(∗ ;∗∗ )。

除了HLA-DR, costimulatory分子的表达还定义了DCs的激活状态。这些costimulatory分子的平衡被指出是重要的区分不同的T辅助淋巴细胞和似乎是由微环境条件(38]。类似于观察HLA-DR,每单元CD86的表达增加,这种蛋白质的荧光强度(图测量5 (b))。此外,CD86的百分比的增加+细胞也观察(图5(一个))。可以认为,与乌本苷孵化项目单独和与TNF -α诱导CD86的upregulation。然而,相反,自己看到了,CD86的表达CD80在这些条件下保持不变(数字5 (c)和5 (d))。

(一)
(一)
(b)
(b)
(c)
(c)
(d)
(d)
图5
CD80和CD86表达在树突状细胞激活。分化期(5天)后,细胞进一步培养48 h有或没有TNF-α(50 ng / mL),在100 nM Oua的存在与否。CD80和CD86表达被流式细胞术分析。数据表示为(a、c)阳性细胞的比例,或(b, d)小额信贷机构(平均荧光强度)和线条表示的五个独立的实验。∗∗和∗∗∗明显不同于相应的控件(∗∗ ;∗∗∗ )。
3.3。乌本苷影响细胞因子的生产在直流激活

除了表面受体的差异,观察到的一个关键特性在成熟的DCs生产白介素,随后的一个关键细胞因子Th1极化幼稚T细胞中遇到的次级淋巴组织,其缺乏生产驱动Th2淋巴细胞的分化39]。因此,考虑到il - 12的重要性的连续性免疫反应,然后我们看是否乌本苷可能会影响DCs的分泌。

为了解决这个问题,上层清液收集从树突细胞分化(维持5天的存在il - 4和gm - csf)经过进一步激活TNF - 48 hα或肿瘤坏死因子-α+乌本苷,然后是测定il - 12的分泌。如图6分泌了大量的il - 12 DCs激活TNF -α48 h。然而,与TNF - dc刺激α连同100海里乌本苷生产的低水平的il - 12,这表明乌本苷明显抑制细胞因子的分泌在TNF-induced DC成熟。

(一)
(一)
(b)
(b)
图6
在直流激活il - 12的分泌。分化期(5天)后,细胞进一步培养48 h有或没有TNF-α(a) (50 ng / mL)的存在与否或TNF-α100海里Oua (b),然后收集上层清液和化验通过ELISA IL-12p40生产。数据表示为细胞因子浓度(pg / mL)从六个不同的个体。和∗∗∗明显不同于各自的控制((a):没有TNF, (b):没有Oua) (∗ ;∗∗ )。

受损的树突细胞白介素生产可以伴随着il - 10 upregulation,当细胞的表型,指向一个监管模式(40]。因此,il - 10分泌在相同的条件下,测定和LPS刺激采用作为il - 10的积极控制生产。我们发现,正如所料,有限合伙人(用作积极控制)诱导il - 10分泌后7天( 1000 pg / mL),而TNF -α没有效果。同样,乌本苷(100海里)就无法通过树突状细胞诱导il - 10生产和修改TNF -α效果(数据未显示)。

3.4。激活NF B

结果这一点证明孵化期间与乌本苷DCs激活只是部分繁殖的表型观察p38抑制剂治疗。来测试假设乌本苷调节其他重要信号通路相关HLA-DR和CD86 upregulation,我们评估了激活的转录因子NF - 我们可以观察到在图7肿瘤坏死因子-α刺激,正如所料,诱导增加NF - B磷酸化。此外,治疗DCs与药理乌本苷的浓度(100海里)诱导增加NF - B磷酸化,TNF -的存在与否α(图7)。


图7
NF B在直流激活激活。分化期(5天)后,细胞培养10分钟有或没有TNF-α(50 ng / mL),在100 nM Oua的存在与否。然后,NF的磷酸化 B是评估蛋白质印迹。控制信号表达任意单位(%)的均值±SEM 3独立实验(∗ ;∗∗ )。
3.5。分析等离子体膜去极化

抑制Na, K-ATPase可能导致质膜去极化,最终崩溃的Na+和K+梯度在动物细胞的细胞膜41]。尽管长期损伤Na, K-ATPase与细胞死亡,主要是缺乏引起的K+(28,42),几个作者所描述的乌本苷效果无关的离子通量的调制,通过激活诱导的细胞信号通路(23- - - - - -26]。所以,知道很重要在我们的实验模型100海里乌本苷的浓度可以促进等离子体膜去极化,能显著抑制Na的的一个象征,K-ATPase酶,在直流激活。为此,我们利用荧光探针DIBAC4(3)bis-oxonol染料进入细胞根据其膜极化和孵化DCs的不同子集。第一组实验测试没有TNF -一群不成熟的dcα。实验进行了孵化100海里乌本苷30分钟或1毫米。作为代表实验(图中描述8(一个)只有积极控制氯化钾(50毫米)和1毫米乌本苷诱导等离子体膜去极化。然而,当DCs与100 nM孵化乌本苷48 h,有或没有TNF -α,部分去极化可以观察到即使这个乌本苷的浓度(图8 (b))。

(一)
(一)
(b)
(b)
图8
等离子体膜电位评估乌本苷的存在。(一)分化DCs(维持5天与gm - csf和il - 4)进一步孵化100海里乌本苷的存在与否或1毫米乌本苷与荧光染料oxonol DIBAC 250海里4(3)30分钟。(b)分化DCs是孵化的存在与否有或没有TNF-α100海里乌本苷为进一步48 h。然后,细胞被洗,自由中添加和DCs与250 nM DIBAC孵化4(3)30分钟。控制膜去极化,增加了50 mM氯化钾与DIBAC 30分钟(在孵化4(3))的文化。接下来,细胞用流式细胞仪分析,表明在材料和方法部分。描绘了一个代表性的实验的数据从一个个体((a), 5个独立实验;(b), 2个独立实验)和值在每个面板指的荧光强度DIBAC(小额信贷机构)4(3)。
3.6。抑制Na, K-ATPase活动

乌本苷是一个经典的抑制剂Na, K-ATPase活动。当atp酶活性测定使用制备微粒体与树突细胞暴露48 h 100 nM乌本苷,可以获得一个抑制(表大约50%的活动2)。

表2
Na, K-ATPase活动。
3.7。评估DC函数下乌本苷治疗

观察到的结果修改DCs在乌本苷的存在,我们评估未成熟和成熟的DCs的基本功能。抗原捕获使用右旋糖酐被选为寻找未成熟dc的吞噬作用和DCs的刺激能力来引出alloreactive T淋巴细胞的增殖反应作为成熟的DCs的函数。

FITC-dextran吸收后7天测量。如图9,约75%的未成熟dc FITC-dextran捕获粒子(图9(一个))。引人注目的是,在100 nM乌本苷(添加在过去48 h(文化)的百分比DCs能够捕获FITC-dextran和这些细胞的吞噬能力降低了近20%和45%,分别。

(一)
(一)
(b)
(b)
图9
与乌本苷吞噬活动的树突细胞培养。分化期(5天)后,细胞进一步培养48 h有或没有TNF-α(50 ng / mL),在100 nM Oua的存在与否。这段时间后,细胞被孵化FITC-dextran(0.5毫克/毫升)1 h在37°C和流式细胞术分析。数据表示为阳性细胞的百分比和小额信贷机构(阳性细胞的平均荧光强度)(意味着±SEM 6独立实验)。和∗∗∗明显不同于各自的控件((a):没有肿瘤坏死因子;(b):没有Oua) (∗ ;∗∗ )。

由于激活,树突状细胞表达下调抗原捕获的机械。如数据所示9(一个)和9 (b)肿瘤坏死因子-α刺激(现在在过去的48 h(文化)减少FITC-dextran树突细胞吸收,在降低40%的阳性细胞百分比和小额信贷机构。推行差别在乌本苷的存在,对这些基因的肿瘤坏死因子-α也发生,支持这一概念,乌本苷并不抑制DC活化在许多方面。此外,coincubation与TNF -乌本苷α提升额外影响直流捕捉葡聚糖颗粒的能力,证明了MFI水平下降33%,相比与TNF -观察α单(图9 (b))。

在图10描述H的手段吗3胸腺嘧啶核苷掺入经过五天的coincubation DCs的淋巴细胞。DCs诱导同种异体t细胞增殖,正如预期的那样,刺激与TNF -α导致高水平增殖的细胞比1:4 (DCs / T细胞)相比,如果/未成熟dc。不成熟的DCs的乌本苷48 h不修改DCs的鼓舞人心的能力。此外,Ouabain-treated成熟dc的刺激能力优于不成熟的DCs控制,表明DCs保存有这种能力。这些数据支持了这种观点,尽管减少il - 12的分泌和CD83表达乌本苷治疗并不妨碍DCs的T细胞刺激能力。


图10
评价混合淋巴细胞反应的不成熟和成熟的树突细胞之前与乌本苷孵化。DCs治疗或没有100海里Oua cocultured同种异体淋巴细胞(105细胞/)表示细胞比率,为5天。扩散是评估的H3胸腺嘧啶核苷掺入,添加后6 h文化时期。在酒吧表示为数据意味着公司±SEM的五个独立实验一式三份(∗ ;∗∗ )。

4所示。讨论

在目前的工作,这是观察到乌本苷(100海里)本身没有诱导分化的单核细胞进入DCs的过程。确凿的以前的结果(10]CD14水平的降低,与乌本苷24小时孵化后,乌本苷后逆转,回到控制值去除和单核细胞的维护文化的新媒介进一步5天。此外,没有观察到在这些条件下CD1a表达式。虽然孵化100海里乌本苷分化诱导高毒性的整个过程中DCs(数据未显示),预处理与乌本苷没有损害单核细胞分化成不成熟的dc,使用il - 4 + gm - csf 5天。,目前的数据清楚地表明,在差别Oua-induced CD14对这些人类单核细胞分化成DCs完全无关。

减少表面CD14水平从乳沟的增加可能导致mCD14 sCD14和暗示单核细胞激活(43,44]。同样,单核细胞暴露于乌本苷表达了表面分子CD69, CD80、CD86和HLA (11,15)也与激活过程,以及细胞因子水平增加(13- - - - - -15]。然而,这些单核细胞并没有引起增加同种异体在混合白细胞活化反应或吞噬细胞的百分比增加15]。

未成熟dc可能激活TNF -α和存在的可能性,这一过程可以通过乌本苷进行调制(100海里)。激活/成熟的DCs减少吞噬活动提倡的差别和乌本苷的存在对这些肿瘤坏死因子-α也发生了。同样,肿瘤坏死因子-α导致增加诱导同种异体t细胞增殖能力和同时孵化与乌本苷并不影响鼓舞人心的能力。因此,在功能方面激活/成熟的DCs乌本苷的存在并没有修改。这不是当相关分子的表达内在DC活化,CD83、HLA和CD86等进行了分析。各种模式不成熟的dc与肿瘤坏死因子被激活——时出现α在乌本苷的存在与否。增加CD83表达被抑制,而HLA和CD86被乌本苷明显调节。DC活化的另一个特点是il - 12的分泌和乌本苷抑制细胞因子的分泌。

综上所述,这些研究结果清楚地表明,乌本苷调节的一些变化观察到成熟/激活过程中DCs TNF -α;它还表明,标记通常归因于激活细胞独立监管,不同样对一些功能方面的影响。例如,DCs与TNF -刺激α或肿瘤坏死因子-α加上乌本苷诱导的淋巴细胞增殖水平相似,不管CD83表达的细胞。因此,看来CD83 upregulation在DCs并不需要激活诱导淋巴细胞激活。这一出人意料的结果是获得的协议,这些常和同事报告相当于CD83之间混合淋巴细胞反应−和CD83+DCs亚型水平可比的CD40、CD80、CD86和MHC II级(45]。在目前的工作中,乌本苷治疗保持CD80表达式,同时增加CD86表达。通过CD86能够激活T细胞聚集有关,但结果在效应细胞的生成Th2表型(38]。因此,乌本苷可能诱发Th2-driving DCs。在目前的工作,虽然可以抑制il - 12的生产,没有发现il - 10,提高的可能性,乌本苷的存在可能会修改DC成熟为一个监管亚型。

DCs与不同的表型,细胞因子的生产,能够刺激不同的淋巴细胞亚群有被描述。ATP或TNF -等一些危险的信号α诱导树突细胞有促炎的发病,分泌和增加CD54的表达高水平的il - 12 CD83 [46]。此外,它最近表明,炎症调节脂联素与DCs成熟导致这些细胞的诱导下Th17反应(47]。另一方面,耐受性属性描述了DCs成熟的维生素D (3), il - 10, TGF -β与这些分子或雷帕霉素,DCs刺激呈现不同的表型和细胞因子生产的模式:他们通常缺乏白介素生产和诱导淋巴细胞刺激也很低(4]。脂醇如地塞米松抑制生产的白介素TNF-matured树突细胞和诱导il - 10的生产(4]。此外,地塞米松抑制CD86和CD83表情成熟dc,没有抑制由这些细胞HLA表达式(4),直流概要文件与乌本苷还存有分歧。

p38 MAPK级联激活TNF -α和LPS刺激。它已经清楚地表明,这个激酶的抑制影响DCs激活,引起不同的物质(36,48,49]。黑客和同事报道了使用SB203580 CpG-induced抑制il - 12的分泌(p38 MAPK-specific抑制剂)。中的和同事观察到的SB203580防止upregulation CD40、CD80、CD86, HLA-DR, CD83、根据LPS激活,TNF -α和接触增敏剂36]。在协议,在目前的工作中,p38抑制剂减少CD83和HLA-DR调节肿瘤坏死因子的表达α乌本苷产生的效果不同。先前的报道从我们组还透露,乌本苷治疗导致激活或抑制p38 MAPK在单核细胞和淋巴细胞,分别为(10- - - - - -12]。它已经表明,乌本苷诱导其他几个信号事件可能引起多个基因最终的规定有不同的调制模式(24,35]。据报道,NF的抑制 B通路在LPS激活DCs导致HLA-DR的减少,CD80、CD83、CD86 [48]。在我们的手中,这个关键信号通路的激活是肿瘤坏死因子引起的乌本苷,观察和累加效应当两种物质都在一起。

乌本苷的影响在我们的实验模型观察成熟/激活过程中DCs TNF -诱导α。其他作者(50)描述,DCs的诱导成熟是伴随着电压门控离子通道的表达的变化。通过修改膜电位,乌本苷可能破坏这个新形势下必要的调整。尽管观察减少Na, K-ATPase活动,我们没有观察到细胞死亡,功能,通常与持续的Na, K-ATPase障碍(28,42]。

最后,本工作首次演示了乌本苷能够调节树突状细胞成熟和功能的药物浓度。到目前为止的结果也相关的树突状细胞功能在病理生理条件下,等离子体乌本苷水平通常增加,像压力,高血压,甚至怀孕(20.- - - - - -22]。

利益冲突

作者没有财务利益冲突有关的出版。

确认

这项工作是支持由Coordenacao de Aperfeicoamento de Pessoal de含量比(披肩),Fundacao德帕罗尽管带动做里约热内卢(FAPERJ),和西班牙de Ciencia e Tecnologia /慰问Nacional de Desenvolvimento Cientifico e学府(INCT Controle做癌症)。