文摘
氧化应激是一个重要的外国病原体宿主先天免疫反应的一部分。然而,维生素C对氧化应激和炎症的影响尚不清楚在社区获得性肺炎(CAP)。我们旨在确定维生素C对氧化应激和炎症的影响。帽患者登记。活性氧(ROS)、DNA损伤、超氧化物歧化酶(SOD)活性,肿瘤坏死因子-α(TNF-α)和il - 6在限制病人和LPS-stimulated巨噬细胞细胞分析。与RFP-LC3 MH-S细胞转染质粒。在LPS-stimulated巨噬细胞细胞自噬测量。严重限制病人显示显著增加活性氧、DNA损伤,TNF-α,il - 6。SOD明显降低严重帽。维生素C显著减少ROS, DNA损伤,TNF-α,il - 6。维生素C抑制LPS-induced ROS、DNA损伤TNF-α,il - 6, p38巨噬细胞细胞。 Vitamin C inhibited autophagy in LPS-induced macrophages cells. These findings indicated that severe CAP exhibited significantly increased oxidative stress, DNA damage, and proinflammatory mediator. Vitamin C mitigated oxidative stress and proinflammatory mediator suggesting a possible mechanism for vitamin C in severe CAP.
1。介绍
氧化应激是一个关键的一部分,一系列事件导致细菌感染引起的炎症。粒细胞氧化物酶发挥重要作用引发氧化应激(1]。囊性纤维化(CF)与氧化应激有关,尤其是在慢性肺部感染铜绿假单胞菌发病率和死亡率的主要原因,在CF (2]。呼吸道合胞病毒(RSV)感染引起的氧化细胞损伤和细胞信号调节病毒诱导肺疾病(3]。活性氧(ROS)和氧化应激反应被认为发挥核心作用在细胞功能障碍的病因学和组织损伤。ROS也调节许多细胞信号通路导致转录因子激活和炎症介质的释放4]。活性氧诱导血管细胞粘附molecule-1 (VCAM-1)信号转导和VCAM-1-dependent炎症被抗氧化剂(5]。一项研究报告更高的发生细菌性重症社区获得性肺炎患者的氧化应激(6]。抗氧化剂可能影响肺发病率。维生素C显著提高“呼吸总分”在最严重的病人7]。
脂多糖(LPS);内毒素)是一个重要的事件,导致活性氧物种的海拔8]。LPS-induced急性肺损伤(ALI)和肺成纤维细胞的异常增殖在疾病早期阶段与PI3K-Akt途径激活(9]。活性氧诱导的DNA损伤。自然,内生DNA损伤可以激活NFκb抑制规范化NF -κB通路加剧了H2O2全身的A549细胞凋亡(10]。自噬在感染细胞死亡中起着至关重要的作用。肺部感染h5n1病毒的人类尸体,老鼠,和人类感染A549肺上皮细胞自噬小体的积累。阻断自噬信号增加小鼠的存活率和液引起的急性肺损伤和死亡的H5N1感染(11]。氧化压力诱导的DNA损伤和自噬在肺炎仍不清楚。在我们目前的研究中,我们的研究结果表明,严重的限制表现出显著增加氧化应激和炎性介质。维生素C减轻氧化应激和炎性介质。
2。材料和方法
2.1。研究设计和主题
这项研究是由泸州医学院附属医院的(一个拥有3000个床位的医院在泸州的城市,四川,中国)。所有患者住院肺炎2011年7月至2013年6月被招募。肺炎被定义为一个新的渗透胸部x线摄影一起下呼吸道感染的症状与体征:发热(> 38°C)、咳嗽、和脓痰12,13]。多个严重性评分系统已设计和评估在社区获得性肺炎。肺炎患者分为轻度至中度肺炎(无严重肺炎)和严重肺炎的初级护理总结英国胸学会指南成人社区获得性肺炎(CAP)的管理(14]。病人crb - 65 3或4分的被定义为严重的肺炎。本研究是泸州医学院伦理委员会批准。
2.2。单核细胞分离和人类的肺部组织
外周血从肺炎和正常处理捐赠获得分离单核细胞。周边血液稀释1:1与无菌磷酸盐(PBS)分层在Ficoll-Hypaque(通用电气医疗集团生物科技AB,斯德哥尔摩,瑞典),在1500 rpm和离心机在室温下15分钟。外周血单核细胞(PBMC)收集从界面层和PBS洗。PBMC与rpmi - 1640 resuspended媒介。生长在rpmi - 1640细胞中含有10% FCS(胎牛血清)。肺组织收集与纤维支气管镜肺组织活检。组织很快就沉浸在液氮和转移到−70°C冰箱冷冻储存。
2.3。MH-C细胞文化
当小鼠肺泡巨噬细胞细胞行(MH-C细胞)rpmi - 1640年增长到85%融合中含有10% FCS,媒介是替换为无血清培养基rpmi - 1640。然后细胞接受有限合伙人或/和100 nM维生素C在无血清培养基为24小时。
2.4。测量的ROS, SOD、il - 6和TNF-α
这些细胞被装满10μM H2DCF-DA(美国分子探针英杰公司)或10μM dihydroethidium(她表达载体、分子探针、美国)在37°C 30分钟根据制造商的指示。删除多余的探针后,细胞保持在37°C包含5%的股份有限公司2。荧光强度是探测到徕卡TCS SP5共焦显微镜(德国徕卡)。为每个样本收集10000个事件。肺组织,增加0.1% ROS(她)调查大约10微升的肺组织冰冻切片,孵化后30分钟37°C,洗2 - 3次磷酸盐(PBS)和由徕卡TCS SP5共焦显微镜观察。超氧化物歧化酶(SOD)活性测定使用草皮试验装备WST(南京建成生物工程研究所、中国)。TNF-α和il - 6的ELISA试剂盒购自研发系统(明尼阿波利斯、锰)。
2.5。测量DNA损伤和细胞生存能力
彗星试验被用来测量DNA损伤。彗星试验进行的过程15]。10μL细胞悬架包含20000和90μL低熔点琼脂糖(LMA)(σ)在PBS 37°C和分层的幻灯片上涂上正常熔点琼脂糖。幻灯片被浸没在刚做好的冷(4°C)赖氨酸溶液(2.5 M氯化钠100毫米EDTA-2Na 10毫米Tris-HCl, pH值10 - 10.5,1% Triton x - 100和10% DMSO) 2小时。幻灯片在4°C沉浸在新鲜的电泳缓冲了30分钟,然后电泳(25 V / 300 Ma) 25分钟。电泳后,幻灯片和溴化乙锭染色。幻灯片满是盖玻片和分析使用徕卡TCS SP5共焦显微镜(德国徕卡)。第四彗星试验软件被用来评估DNA损伤评分。细胞生存能力是衡量5-ethynyl-2′脱氧尿苷(EdU)分析使用一个EdU分析工具包(Ribobio,广州,中国)16]。细胞核是沾4′6-diamidino-2-phenylindole (DAPI)试剂。
2.6。细胞转染
MH-S细胞转染RFP-LC3或GFP-LC3质粒使用Lipofectamine 2000试剂(表达载体)血清RPMI 1640中(热费希尔科学)制造商的指令(17]。吴RFP-LC3 GFP-LC3质粒和请提供最小(美国北达科他大学)。
2.7。免疫印迹
细胞中均质里帕裂解缓冲进行免疫印迹分析。溶菌产物(20μg)运行在10% SDS聚丙烯酰胺凝胶在100 V 2小时,转移到微孔聚乙二烯二氟化物(PVDF)膜在100毫安2小时。膜与磷酸化(p) P38涂抹,P38, TNF-α,LC3 BECN1,β肌动蛋白抗体(1:1000)(圣克鲁斯生物技术有限公司)和处理通过增强化学发光(皮尔斯)。
2.8。统计分析
数据表示为平均值±标准错误。执行统计分析使用方差分析(图基的事后)或学生的以及和意义被定义为水平任意两组之间。Mann-Whitney测试和斯皮尔曼相关的双尾检验被用于统计分析。数据分析使用SPSS 13.0软件(18]。
3所示。结果
3.1。描述的严重限制
总共30例社区获得性肺炎患者参加了这项研究。15例患者有严重的社区获得性肺炎和15显示社区获得性肺炎肺炎者。15例承认控制情况。这些患者的基线特征描述表1。重症社区获得性肺炎的平均年龄或长程社区获得性肺炎没有明显不同,在正常控制。重症社区获得性肺炎PaO下降2和PaO2/ FiO2者相比,社区获得性肺炎()。痰培养显示的增长克雷伯氏菌肺炎,大肠杆菌和不动杆菌。木糖醇在严重的帽帽者相比显著增加。
3.2。严重的肺帽增强氧化应激
社区获得性肺炎的患者相比,有更高的氧化应激没有感染(19]。然而,目前尚不清楚,氧化应激涉及严重程度的肺炎。评估肺部氧化应激的帽子,我们测量了ROS在气道组织从对照组或限制收集的患者支气管镜检查。帽的病人表现出ROS增加气道组织。ROS水平严重的帽帽者(价格相比显著增加,图1 (b))。
(一)
(b)
3.3。严重的上限提高ROS, TNF-α,il - 6
已经表明,防止postinfluenza细菌性肺炎是通过增加白细胞招募和活性氧的生产(20.]。然而,是否过度ROS加重炎症尚不清楚。使用ROS的调查,我们发现帽显示ROS增加相比,控制在PBMC。此外,严重的帽帽者相比显示ROS增加密度(,图2(一个))。DNA损伤在PBMC被彗星试验检测。DNA损伤PBMC表现出不同的增加上限。每个幻灯片的总伤害分数严重帽帽者相比显著增加(,图2 (b))。SOD的严重的帽帽者相比显著降低(,图2 (c))。发现重大协会ROS和DNA损伤之间严重的限制(,,图2 (d))。SOD和活性氧(之间存在显著的负相关,,图2 (e))。TNF-α和il - 6在严重的帽帽者相比显著增加(和0.005,图2 (f))。结果表明,严重限制了更高的氧化应激,DNA损伤,促炎介质生产。
(一)
(b)
(c)
(d)
(e)
(f)
3.4。维生素C减少ROS、TNF-α和il - 6在严重的限制
维生素C有效抑制amfepramone-induced DNA损伤(21),但是否维生素C抑制细菌感染和诱导活性氧和DNA损伤严重的限制仍不清楚。我们的研究发现,维生素C减少ROS和DNA损伤分数而接受pbs单核细胞从严重限制体外(和0.00053,图3(一个))。维生素C TNF-α下降和il - 6与接受pbs体外全血细胞严重帽(和0.03,图3 (b))。
(一)
(b)
3.5。维生素C抑制LPS-Induced ROS、TNF-α和P38 MH-S细胞系
活性氧产生的先天免疫反应有限合伙人代理antipathogen防御很重要,但是否维生素C调节LPS-induced氧化应激和促炎介质尚不清楚22]。在目前的研究中,MH-S细胞与LPS刺激24小时和维生素C是补充道。我们发现,有限合伙人增加ROS-positive细胞和DNA损伤分数相比,控制细胞。维生素C抑制ROS-positive细胞和DNA损伤分数相比LPS-stimulated细胞(数字4(一)和4 (b),和0.0001)。维生素C MH-S细胞生存能力增加LPS-stimulated细胞(图4 (c))。它已经表明,从LPS-stimulated TNF-α释放细胞浓度显著增加(23]。过氧化氢诱导巨噬细胞通过激活p38 TNF-α生产氧化应激相关信号通路(24]。维生素C治疗后显著降低TNF-α,P38和p-P38 LPS-stimulated细胞在本研究观察(图4 (e),0.001和0.0006)。
(一)
(b)
(c)
(d)
(e)
3.6。维生素C减少LPS-Induced自噬在MH-S细胞系
人们已经发现,自噬是需要一个有效的抗感染免疫反应体内并提高细菌的间隙中铜绿假单胞菌肺部感染(25]。LPS-induced自噬的限制大肠杆菌在腹膜间皮的细胞(26]。确定LPS诱导自噬,MH-S细胞转染RFP-LC3质粒或GFP-LC3质粒。与10 MH-S细胞被刺激μg / mL有限合伙人12 h。根据以前的报告,共焦显微镜图像用于半定量的测量(17]。我们观察到,LPS诱导LC3的点状MH-S细胞。H2O2显著增加LC3斑点。然而,维生素C抑制增加LC3点状LPS-induced细胞(图所示5(一个))。我们发现H2O2显著增加beclin-1 LPS-stimulated细胞(图所示5 (b))。LPS-stimulated LC3-II增加细胞的表达。维生素C抑制增加LC3II LPS-stimulated细胞(图5 (c))。
(一)
(b)
(c)
4所示。讨论
肺炎是一种肺部感染通常由细菌和病毒引起的(27]。氧化应激是一个重要的外国病原体宿主先天免疫反应的一部分28]。氧化应激在呼吸系统增加了生产的肺部炎症介质。这些影响包括增加细胞间粘附分子1和白细胞介素- 6的表达和分泌过多的粘液(29日]。我们的研究发现,帽展出ROS增加肺部组织。此外,严重的肺帽显示显著增加活性氧。因此,这些数据表明,氧化应激是严重程度的肺炎。
已经表明,呼吸道合胞体病毒感染诱发气道的差别明显对这些基因的体内抗氧化系统,可能导致肺氧化损伤(30.]。抗氧化剂已经被证明是有效的在预防肺损伤和预防损伤的其他器官,如心脏,肾脏,肝脏氧化应激动物模型(31日]。我们还发现,ROS增加帽PBMC。ROS相比显著增加严重帽帽。此外,帽和严重帽展出在PBMC DNA损伤。严重的帽帽相比表现出更多的DNA损伤。氧化损伤与超氧化物歧化酶(SOD)在肺。抗氧化治疗逆转器官功能衰竭在脓毒症大鼠模型31日]。在我们目前的研究中,我们发现,SOD与ROS严重限制PBMC负相关。严重限制PBMC中表现出更多的DNA损伤。TNF-α和il - 6在严重限制明显增加。结果表明,氧化应激和DNA损伤可能代表一个重要的致病的机制的严重限制。
预防性使用维生素C在人群应该进一步研究预防肺炎肺炎的发病率高27]。虽然它已经表明,维生素C显著提高了“呼吸总得分”最严重的病人,抗氧化剂可能会影响肺发病率。更多的维生素C和其他抗氧化剂的研究似乎是必要的(7]。抗氧化剂保护巨噬细胞的吞噬作用铜绿假单胞菌在氧过多(32]。
我们的研究是第一个报告,维生素C减少ROS和DNA损伤严重的帽子PBMC体外,和维生素C TNF-α和il - 6在全血细胞减少的严重限制。
活性氧(ROS)通过NF -调节炎症反应κB通路(33]。氧化应激可能改变基因表达的促炎介质之间的平衡和抗氧化酶的肺部炎症介质(34]。有限合伙人(TLR4的配体)诱导肿瘤坏死factor-α巨噬细胞(TNF-α)生产。LPS-induced TNF-α可能是一个有用的治疗脓毒症的治疗候选人和其他炎性疾病35]。p38激活与LPS-induced相关TNF-α在巨噬细胞36]。防治作用显著提高zymosan-induced肺组织损伤和肺功能受损37]。然而,抗氧化剂腹膜炎的严重性增加吞噬效率降低,氧化破裂,TNF-α生产和增加中性粒细胞浸润。抗氧化剂减少腹膜巨噬细胞的吞噬功效,也降低了大肠杆菌全身的氧化在巨噬细胞细胞破裂。补充抗氧化过程中细菌感染不推荐作为主机(可能是有害的38]。维生素C是一种新型调节器的嗜中性粒细胞胞外陷阱形成脓毒症。维生素C是保护在脓毒症的设置39]。我们的数据表明LPS诱导活性氧的增加,在巨噬细胞细胞株DNA损伤。TNF-α的表情,p38和磷酸化p38还增加LPS-stimulated巨噬细胞细胞。维生素C也减少ROS水平和DNA损伤程度和减少TNF-α表达式,p38和磷酸化p38 LPS-stimulated巨噬细胞细胞在体外。
在环境压力条件下自噬通路被激活(40]。之前报道自噬体内有效地调节细菌清除铜绿假单胞菌从肺。与雷帕霉素治疗干预旨在诱导自噬与减少细菌负荷铜绿假单胞菌肺部感染在体内25]。有限合伙人移植肝细胞自噬;LC3II表达增加肝脏和肝细胞在有限合伙人和依赖于TLR4 [41]。事实上,我们的数据令人信服地表明,LC3点状增加LPS-stimulated MH-S细胞。H2O2显著增加LC3斑点在LPS-stimulated MH-S细胞。LC3在细胞的各种组织普遍存在,主要表现在自噬体。LC3II表达增加MH-S细胞暴露于有限合伙人和H2O2。Beclin1表达增加MH-S细胞暴露于有限合伙人和H2O2。数据表明,氧化应激不受监管的自噬,这可能是有用的细菌清除率。然而,我们发现,维生素C抑制自噬在MH-S细胞暴露于有限合伙人和H2O2。维生素C对自噬的影响需要调查。
总之,我们证明严重限制表现出显著增加氧化应激和促炎介质(TNF-α和il - 6)在肺和外周血。维生素C抑制ROS, DNA损伤,TNF-α,il - 6严重限制体外。维生素C也减少了ROS, LPS-stimulated巨噬细胞细胞DNA损伤,TNF-α生产。氧化应激在巨噬细胞细胞不受监管的LPS-induced自噬。维生素C抑制自噬在MH-S细胞暴露于有限合伙人和H2O2。因此,我们的研究是一个新颖的机制的维生素C,它抑制氧化应激和促炎介质在严重的肺炎。
缩写
| ROS: | 活性氧 |
| 有限合伙人: | 脂多糖 |
| 帽子: | 社区获得性肺炎 |
| PBMC: | 外周血单核细胞 |
| 她: | Dihydroethidium。 |
利益冲突
作者宣称没有利益冲突有关的出版。
作者的贡献
独到的李、刘Zhiguang和南山钟的构思和设计研究。渊源,王娇元,渊源进行了实验。Guangyan罗、Xiaoqiong杨和王小云分析数据。独到的李写道。所有作者阅读和批准了期末论文。渊源陈和焦元的贡献同样这项工作。
承认
这个项目是由中国国家科学基金会(81170032)。