文摘
AP736被确认为一种antimelanogenic药物可用于预防黑斑,雀斑,黑斑的皮肤作为抑制黑色素的合成和酪氨酸酶的表达。自从macrophage-mediated炎症反应对皮肤的健康至关重要,在这里,我们调查了AP736潜在的抗炎活性。的影响等各种炎症事件AP736一氧化氮(NO) /前列腺素(PG) E2生产、炎症基因表达、吞噬吸收,在RAW264.7细胞形态变化研究。AP736发现强烈抑制没有和铂族元素的生产2在脂多糖(LPS)对RAW264.7细胞。此外,AP736强烈抑制LPS-induced形态变化和FITC-dextran-induced吞噬吸收。此外,AP736也下调多种炎症基因的表达,如诱导没有合酶(间接宾语),环氧酶- 2 (COX),白介素- 1 (IL)β在LPS-treated RAW264.7细胞。转录因子分析,包括上游信号事件,表明NF -κB和AP-1 AP736通过抑制IKK /我的目标κBα和IRAK1 / TAK1通路。因此,我们的研究结果有力地表明,AP736是一个潜在的抗炎药物由于其抑制NF -κB-IKK /我κBα和AP-1-IRAK1 / TAK1信号,这可能会让AP736有用的治疗macrophage-mediated皮肤炎症。
1。介绍
皮肤港口组成的一个复杂的免疫防御系统各种免疫和多发地细胞如上皮细胞、巨噬细胞、角质细胞、肥大细胞、朗格汉斯细胞(1]。这些细胞类型,最强大的免疫细胞,位于皮肤巨噬细胞(1,2]。这些细胞组成防御感染的一个重要部门各种克(+)或克(−)细菌、真菌或病毒;巨噬细胞也很重要的防御其他环境压力,如化学品,辐射,污染物,和紫外线(UV)光,所有这些会导致皮肤炎症(3- - - - - -6]。这些免疫原和刺激物激活巨噬细胞,进而释放多种炎症介质和细胞因子,包括一氧化氮(NO)、肿瘤坏死因子(TNF),α白介素- 1 (IL),环氧酶- 2 (COX),基质金属蛋白酶(MMPs) [7- - - - - -10]。在遇到这些细胞因子,邻近的巨噬细胞激活复杂细胞内的信号级联nonreceptor蛋白质酪氨酸激酶的活化和serine-threonine蛋白质激酶,如增殖蛋白激酶(如p38,细胞外signal-regulated激酶(ERK)和c-Jun n端激酶[物]),以及与炎症有关的转录因子的刺激如核转录因子——(NF)B和激活蛋白-(美联社)1 (11- - - - - -13]。
新产品的开发成功控制杀菌作用一直是皮肤研究人员的目标(14]。尽管黑色素起着至关重要的作用在保护皮肤免受紫外线照射,过度释放黑色素的黑色素细胞会导致黄褐斑、雀斑、黑斑(15]。因此,antimelanogenesis补救措施将可能非常有价值的化妆品和制药工业。在这种背景下,小分子AP736(图1从1)最近被合成,3-diphenylpropane骨架通过优化流程涉及的替代苯基二羟基和adamantyl[半个16];重要的是,AP736被发现有效地抑制黑色素生产从黑色素细胞17]。尽管AP736显然是一个有效的脱色药物(16),它尚未确定是否能抑制macrophage-mediated皮肤炎症反应,这对皮肤健康是至关重要的(1]。因此本研究的目的是确定精确AP736对巨噬细胞的促炎作用刺激与G (−) bacterium-derived脂多糖(LPS)和仔细阐明AP736的抗炎机制。
2。材料和方法
2.1。材料
4-dihydroxybenzyl AP736 [5-adamantan-1-yl-N - (2) 2, 4-dimethoxybenzamide, 97.5%纯度)合成了根据先前描述的方法(16]。表面(PEI), 3 - (4 5-dimethylthiazol-2-yl) 2, 5-diphenyltetrazolium溴化(MTT)硝普酸钠(SNP),-dichlorodihydrofluorescein二乙酸(DCF-DA),异硫氰酸荧光素(FITC)葡聚糖,吲哚美辛,-nitro-L-arginine甲酯盐酸盐(L-NAME)和脂多糖(LPS);大肠杆菌0111:B4)从西格玛化工有限公司购买(圣路易斯,密苏里州,美国)。bay11 - 7082, U0126(情况),SP600125 (SP)获得Calbiochem (La Jolla、钙、美国)。酶免疫测定(EIA)用于确定铂族元素的工具2水平从Amersham购买(小都,白金汉郡,英国)。胎牛血清和RPMI1640获得Gibco(美国纽约大岛)。小鼠巨噬细胞的细胞株RAW264.7和人类胚胎肾细胞系HEK293买来写明ATCC(罗克维尔市,医学博士,美国)。所有其他化学试剂均为分析纯,从σ。荧光素酶结构含有NF -结合位点κB和AP-1教授的礼物有年轻的钟(釜山国立大学、釜山、韩国)。Phosphospecific和总抗体NF -κB亚基(p65 p50), AP-1蛋白质(c-Fos和c-Jun),我的家人κBα物,一种蛋白激酶ERK p38,增殖蛋白激酶(MKK) 4/7, MEK1/2, TAK1, ITAK-1, IRAK-4,核纤层蛋白A / Cβ肌动蛋白从细胞信号(美国贝弗利,MA)。
2.2。细胞培养
RAW264.7 HEK293细胞培养在RPMI 1640中补充heat-inactivated 10%胎牛血清(的边后卫;Gibco,宏伟的岛,纽约,美国),谷氨酰胺,抗生素(青霉素和链霉素)37°C下5%的股份有限公司2。细胞被分离为所有实验用细胞刮板。当细胞被培养为实验2×106细胞/毫升,死细胞的比例还不到1%,由台盼蓝染料排斥。
2.3。确定没有和铂族元素2生产
预培养后RAW264.7细胞或腹膜巨噬细胞(1×106细胞/ mL) 18 h,细胞治疗AP736(0到30μ米)为30分钟,然后进一步孵化有限合伙人(1μg / mL) 6(铂族元素2)或(NO)的24小时。AP736的影响没有和铂族元素的生产2通过分析这些化合物的含量测定用格里斯试剂和环评工具如前所述18,19]。
2.4。针对SNP-Derived激进分子的中和活性
的自由基清除活性AP736决心通过测量其中和一氧化氮的能力(SNP)公布的激进分子自发分解(10μ米)30分钟。合成生色团的吸光度测量在540海里。没有生成的抑制百分比来衡量比较负面的吸光度值控制硝普酸钠和车辆(10毫米)试验准备。
2.5。形态变化测试
AP736-treated RAW264.7细胞,培养在任何有限合伙人的存在与否,是孵化6 h。培养细胞的图像在指定时间点获得使用一个倒置相差显微镜配备摄像头和捕获用NIH图像软件如前所述[20.]。细胞计数器是用于确定形态改变细胞的数量在每一个条件。
2.6。实验测定吸收
RAW264.7细胞的吞噬功能测定如前所述,但与少量修改21]。简而言之,RAW264.7细胞(5×104100年)接受AP736 resuspendedμ包含1%的人类AB血清L PBS。细胞培养与异硫氰酸荧光素(FITC)葡聚糖(1毫克/毫升)30分钟的37°C。孵化项目被停止的2毫升冰冷的PBS包含1%的人类血清和0.02%的叠氮化钠。细胞被洗了三次与冷PBS-azide和分析FACScan流式细胞分析仪(如前所述)(22]。
2.7。流仪结果
FITC-dextran水平RAW264.7细胞是由流仪分析(23,24]。简而言之,RAW264.7细胞(2×106细胞/毫升)对AP736 FITC-dextran的存在与否(1毫克/毫升)和染色洗缓冲区(2%的兔血清和1%的叠氮化钠磷酸盐(PBS)],然后用直接标记抗体孵化一个额外的45分钟在冰上。与染色缓冲洗涤三次后,染色细胞分析在FACScan流式细胞分析仪(正)。
2.8。细胞生存能力测试
RAW264.7细胞(1×106细胞/毫升)培养18 h,之后时间AP736(0到30μ米)是一个额外的8或添加到细胞24小时的文化。AP736当时的细胞毒性效应评估传统MTT测定如前所述[25,26]。最后3 h(文化、10μL MTT方法(10毫克/毫升的磷酸盐,pH值7.4)被添加到每个。反应停在添加15%十二烷基硫酸钠(SDS)到每个好,随着甲瓒的产品(27]。吸光度在570 nm (OD570 - 630)测量使用SpectraMax 250标(BioTek坏Friedrichshall,德国)。
2.9。mRNA分析使用半定量和定量反向Transcriptase-Polymerase链式反应
为了确定mRNA表达各种细胞因子的水平,总RNA隔绝LPS-treated RAW264.7细胞使用试剂盒试剂根据制造商的指示。总RNA是储存在−70°C到使用。进行了半定量的RT反应如前所述[28]。量化的mRNA水平是由实时rt - pcr使用SYBR预混料交货Taq根据制造商的指示(豆类、志贺、日本)和一个实时热循环(Bio-Rad大力神,CA)之前报道(29日]。本研究中使用的所有引物获得Bioneer(大田、韩国),如表所示1。
2.10。制备细胞溶解产物,制备核分数,和免疫印迹分析
RAW264.7细胞(5×106细胞/毫升)清洗三次在寒冷的PBS补充1毫米原钒酸钠,resuspended裂解缓冲(20毫米Tris-HCl (pH值7.4),2毫米EDTA, 2毫米ethyleneglycotetraacetic酸,50毫米β二硫苏糖醇甘油磷酸酯1毫米原钒酸钠1毫米,特里同x - 100 1%, 10%的甘油,10μ10 g / mL抑肽酶μg / mL抑肽素,1毫米苯甲酰胺和2毫米PMSF],声波降解法和细胞溶解的旋转在4°C为30分钟。溶菌产物被离心澄清在16000 g×10分钟在4°C和储存在−20°C到使用。
核溶解产物准备以下三步过程(30.]。适当的治疗后,收集细胞用橡胶警察,用PBS洗净,细胞溶解在500年冰4分钟μL裂解缓冲包含50 mM氯化钾,0.5%诺乃清洁剂p 40, 25毫米玫瑰(pH值7.8),1毫米phenylmethylsulfonyl氟化物,10μ20 g / mL亮抑酶肽,μg / mL抑肽酶,和100年μ米1,4-dithiothreitol(德勤)。在19326×g细胞溶解产物被离心机1分钟。第二步,核分数颗粒被洗一次缓冲区(与上面描述的裂解缓冲,除了没有诺乃清洁剂p 40)。在最后一步,细胞核提取处理缓冲区包含500毫米氯化钾,10%的甘油,和所有其他试剂包含在上述裂解缓冲。核/提取缓冲混合物是冻结在−80°C,在冰解冻,在19326×g离心5分钟。最后得到的上层清液收集核提取。可溶性细胞溶解产物与指定的抗体,免疫印迹和免疫反应性的乐队被可视化为之前报道(31日]。
2.11。质粒转染和荧光素酶报告基因活性测定
HEK293细胞(1×106细胞/毫升)转染有1μ克的质粒的表达β牛乳糖和NF -κB-Luc或AP-1-Luc存在与否的诱导分子(MyD88或TRIF)。转染进行使用12-well板块中的裴方法如前所列出(32,33]。转染细胞用于转染48 h后对所有实验。细胞治疗AP736每个实验的最后8 h。荧光素酶检测进行使用荧光素酶检测系统(Promega,麦迪逊,WI),如前所报道(34]。
2.12。统计分析
定量数据都表示为意味着±标准差(SDs)作为计算的两个独立的实验。每个实验都完成了6复制。所有其他数据显示代表三个独立的实验。统计分析使用方差分析/菸害的事后考验和克鲁斯卡尔-沃利斯/ Mann-Whitney测试。值< 0.05被认为是具有统计学意义。所有统计测试进行了使用SPSS(美国SPSS Inc .,芝加哥,IL)。
3所示。结果与讨论
在先前的研究中,AP736显示表达下调酪氨酸酶的表达,抑制cAMP-PKA-CREB信号通路(17]。此外,AP736也被报道强烈抑制黑色素生产(16]。在目前的研究中,我们审查AP736是否能够调节macrophage-mediated炎症反应,以识别潜在的immunopharmacological角色这种化合物。
为此,我们首先测试的抑制活动AP736没有和铂族元素2生产、炎症反应的程度的两个指标35),使用LPS-treated RAW264.7细胞。如数据所示2(一个)和2 (b),AP736有效地抑制没有和铂族元素的生产2。确定AP736-mediated抑制没有发布涉及NO-derived的直接清除自由基,我们检查了AP736抑制SNP-derived没有释放的能力。如右边的面板图所示2(一个)边际抑制(25%),只有通过观察AP736 30μM,表明AP736-mediated抑制生产不仅是由于直接AP736的彻底清除,而且其他药理机制。我们还证实,两个控制化合物,L-NAME(用于分析)和吲哚美辛(用于铂族元素2试验),产生剂量依赖性抑制没有释放和铂族元素2分别为分泌(图2 (c)),与以前的结果一致36]。重要的是,AP736没有显示任何细胞毒RAW264.7细胞浓度高达30μ8点和24小时(图2 (d)左和右面板)。日积月累,这些结果清楚地表明,(1)我们的分析提供了一种精确测量的炎症反应和(2)的抑制活动AP736不仅仅是由于特异性的药理活性。
(一)
(b)
(c)
(d)
(e)
(f)
因为我们之前发现macrophage-mediated炎症反应的积极管理形态变化介导的肌动蛋白细胞骨架(37,38下检查),我们是否也受到AP736 LPS-induced形态学改变。如图2 (e),AP736明显抑制LPS-induced巨噬细胞90%的结构性改变,这意味着AP736的抑制活动也与抑制巨噬细胞的形态变化等肌动蛋白cytoskeleton-disrupting特工一样细胞松弛素B (38]。符合这一假说,AP736也明显抑制吞噬吸收RAW264.7细胞(图2 (f))。吞噬吸收是一个极为重要的先天免疫反应的一部分,也在其他炎症活动。自吞噬吸收也完全依赖于肌动蛋白细胞骨架重排(37),我们的研究结果强烈暗示AP736会抑制炎症反应通过阻断肌动蛋白cytoskeleton-dependent炎症活动。的确切机制如何AP736调节肌动蛋白细胞骨架将进一步探索的肌动蛋白及其调节蛋白如ρ,Rac, CDC42。
事实上,肌动蛋白细胞骨架重排被报道与NF的激活密切相关κb .事实上,两个IKK抑制剂,湾11 - 7082和人参皂苷一国,可以抑制肌动蛋白cytoskeleton-dependent吞噬吸收,和粘附[39,40),这表明依赖肌动蛋白细胞骨架的炎症反应可能是由转录因子(例如,NF -κB)活动。确定AP736-mediated抗炎反应是由转录因子的激活,我们确定各种炎症基因的表达水平,如il - 1β,进气阀打开,cox - 2。正如所料,炎症基因的表达在细胞受到强烈表达下调20或30μM AP736,根据实时(图3(一个))和半定量的(图3 (b)rt - pcr分析。因此,这些结果强烈支持的想法AP736-mediated抑制可在转录水平调节。这种类型的监管也出现在其他已知的化学物质和抑制剂如槲皮素、lancemaside, NSC95397,咖啡酸、白藜芦醇衍生物2,4-dihydroxy-N -苯甲酰胺(4-hydroxyphenyl)和叶黄素39,41- - - - - -44]。
(一)
(b)
我们下一个检查AP736是否还可以调节炎症转录因子的转录激活。对于这些实验,我们利用转录因子的活动这一事实可以用荧光素酶报告基因实验用cotransfection TLR适配器蛋白质(如MyD88和TRIF) [32,45]。有趣的是,NF -κB TRIF诱导激活抑制由20到30μM AP736,而MyD88-induced荧光素酶活动只有30所抑制μAP736的M(图4(一))。另一方面,AP-1激活在MyD88 cotransfection,但不是TRIF cotransfection,抑制了AP736 (30μ米)(图4 (b))。这些结果暗示NF -κB AP736可以抑制活动主要与TRIF的抑制,同时抑制AP-1活动可能会被封锁MyD88略微相关途径。事实上,许多信号蛋白已报告被这种适配器的过度激活分子(32,46]。NF -的磷酸化κB和AP-1子单元是由cotransfection MyD88和TRIF [47,48]。因此,TLR信号通路和相应的激活转录因子调控的TLR适配器分子可以通过AP736目标。在协议与我们的报告基因分析,我们也分析了核提取物免疫印迹,发现AP736治疗p65强烈抑制核易位,p50, c-Jun 15分钟和c-Fos 15 - 30分钟(图4 (c))。核易位转录因子的胞质是由这些因素的激活(49]。因此,观察到核的NF -水平κB和AP-1子单元被AP736下降表明,这些转录因子可能是这种化合物的目标。
(一)
(b)
(c)
大量研究表明,炎性转录因子核易位是由多种细胞信号网络。这些信号级联包括一系列激活事件涉及麦克米兰、Src, PI3K,基因,一种蛋白激酶,IKK和我κBαNF -κB激活和IRAK1/4 TAK1 MKK, MAPK (ERK, p38和墨水)AP-1激活(50- - - - - -52]。因此,我们还研究了是否AP736抑制细胞内的信号级联已知影响NF -κB和AP-1激活。识别可能的信号事件的上游NF -κ受AP736 B激活,我κBα第一次检查/ IKK途径。如图5(一个),我的磷酸化水平κBα高度减少5分钟后治疗AP736(左面板),而其他上游IKK和一种蛋白激酶磷酸化事件没有影响(右面板),表明IKK AP736的可能是一个目标。我们也评估MAPK信号蛋白的磷酸化作用模式与AP736治疗后。如图5 (b)磷酸化ERK和物的水平降低与AP736治疗5分钟后。同意这些结果,信号蛋白的磷酸化和退化的上游MAPK (MEK1/2, MKK4/7、TAK1 IRAK-1)被AP736减少,暗示AP736-mediated抑制AP-1可能由IRAK1的目标。综上所述,这些数据明显表明NF -的活动κ可以抑制B和AP-1 AP736通过抑制上游信号通路,包括IKK /我κBα和IRAK1 / TAK1。更精确地澄清的双重抑制行动AP736,激酶检测纯化IKK和IRAK1或荧光素酶检测采用IKK的过度或IRAK1,关注后续下游事件将在未来进行研究。
(一)
(b)
(c)
(d)
总之,我们的结果表明,AP736可以作为一种有效的抗炎药物。这种化合物显著抑制多个macrophage-mediated炎症反应,包括没有/铂族元素2生产、炎性基因(进气阀打开,cox - 2和il - 1β)表达式,吞噬吸收,活化巨噬细胞形态学变化。潜在目标转录因子分析表明NF -κB和AP-1,除了他们的上游信号伙伴(IKK /我κBα和IRAK1 / TAK1 resp),双immunopharmacological AP736的目标,总结在图6。基于这些结果,我们得出这样的结论:AP736可以作为抗炎药或进一步开发derivatized其药理活性提高,这将使其用于治疗炎症和/或色素皮肤疾病。
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利益冲突
作者报告没有利益冲突。