文摘

脂肪与抗炎M2巨噬细胞表型防止obesity-induced炎症和胰岛素抵抗。血红素oxygenase-1 (HO-1),抒发抗氧化和抗炎活性,调节巨噬细胞表型,从而是涉及多种炎性疾病。在这里,我们表明,HO-1诱导物,氯高铁血红素,防止obesity-induced脂肪炎症诱导巨噬细胞切换到M2表型。HO-1感应的氯高铁血红素减少促炎细胞因子(TNF -的生产α和il - 6) cocultured脂肪细胞和巨噬细胞通过抑制炎症信号分子的激活物和NF -κB)在两种细胞类型。氯高铁血红素增强M2巨噬细胞标记基因的转录水平(il - 4、Mrc1 Clec10a) cocultures,同时减少记录的M1巨噬细胞标记(CD274和TNF -α)。氯高铁血红素的保护作用脂肪炎症和巨噬细胞表型转换被证实在小鼠喂高脂肪的食物,而这些与PPAR有关γupregulation和STAT6激活。这些发现表明,诱导HO-1通过M2与氯高铁血红素能预防obesity-induced脂肪炎症巨噬细胞表型转换,这是PPAR引发的γ和STAT6通路。HO-1抗病诱导剂如氯高铁血红素对预防obesity-induced脂肪炎症可能是有用的。

1。介绍

Obesity-induced脂肪炎症中扮演一个重要的角色在代谢并发症的发展,如胰岛素抵抗和2型糖尿病(1- - - - - -3]。的积累脂肪组织巨噬细胞(atm)是一个标志性的obesity-induced脂肪炎症,炎症介质(TNF -α从自动取款机,il - 6和MCP-1)发布起到至关重要的作用在促进与肥胖相关的系统性炎症条件(4]。有趣的是,自动取款机可以分化成不同的激活状态,执行不同的功能通过生产促炎和抗炎细胞因子(4),根据微环境刺激。促炎的巨噬细胞(M1)经典激活干扰素-γ或脂多糖(5,6),而抗炎(M2)被激活巨噬细胞il - 4或IL-13 [4- - - - - -6]。自动取款机的瘦老鼠有一个平方米,而肥胖老鼠的极化对M1表型(4]。这表明代理极化对M2巨噬细胞表型可能防止obesity-induced脂肪炎症。

血红素oxygenase-1 (HO-1)是微粒体酶诱导氧化应激和炎症刺激,起着重要的作用在抑制炎症和胰岛素抵抗[7]。它催化氧化降解的血红素胆绿素和一氧化碳(CO) (8),其酶活性是平行的水平的成绩单和蛋白质(8,9]。重要的是,HO-1强有力的抗炎作用的诱导与macrophage-mediated炎症反应通过优先促进M2表型(9,10]。此外,感应HO-1在遗传肥胖小鼠(ob / ob)和糖尿病大鼠增加脂联素表达和抑制炎症细胞因子表达(11,12]。然而目前尚不清楚是否HO-1感应减少obesity-induced脂肪炎症通过影响脂肪的巨噬细胞极化。

在这里,我们表明,HO-1感应的氯高铁血红素降低炎性细胞因子的水平,增加脂肪的巨噬细胞对M2表型转换在体外和在活的有机体内。HO-1诱导物的氯高铁血红素可能有利于保护obesity-induced脂肪组织炎症。

2。材料和方法

2.1。试剂

Tricarbonyldichlororuthenium (II)二聚体[俄文(有限公司)₃Cl₂]₂(Sigma-Aldrich,圣路易斯,密苏里州)称为CO-releasing分子(CORM-2)作为一氧化碳(CO)捐赠。因为CORM-2包含钌(俄文)作为他们的金属中心,氯化钌(III)水合物(RuCl₃)(Sigma-Aldrich,圣路易斯,密苏里州)作为消极的控制。RuCl₃都有相同的基本结构与例外CORM-2它不产生CO的解决方案(13]。CORM-2或RuCl₃可溶性在二甲亚砜(DMSO)给股票的浓度1 M。张和民HO-1表达和活性的诱导物,提高内生生成有限公司时,和原卟啉IX锌(II) (ZnPP)抑制剂HO-1活动,也从Sigma-Aldrich购买(圣路易斯,密苏里州)和溶解在20毫米氢氧化钠(氢氧化钠)给股票的浓度1毫米。

2.2。动物

六个雄性C57BL / 6小鼠从东方有限公司购买(釜山、韩国)。老鼠被维护在一个标准的光周期(12 h光明/黑暗),被允许免费的水和食物。他们被随机分配到下列实验组(每组):(1)控制饮食+车辆,(2)控制饮食+氯高铁血红素,(3)高脂肪饮食(HFD) +车辆,(4)HFD +氯高铁血红素,(5)HFD +氯高铁血红素+ ZnPP。控制饮食中含有10%的卡路里,脂肪而HFD含有60%的卡路里,脂肪来自猪油和大豆油(研究饮食Inc .,新布伦瑞克,新泽西州);氯高铁血红素和ZnPP (Sigma-Aldrich)溶解在10%氢氧化铵(NH₄OH)在0.15 M氯化钠的原液100毫克/毫升,然后进一步稀释1:40无菌0.15 M氯化钠。氯高铁血红素独自腹腔内注射(25毫克/公斤体重)或结合ZnPP(12.5毫克/公斤体重)的老鼠为2周(每周3次14]。收到相同的NH Vehicle-injected老鼠₄氯高铁血红素缺乏或ZnPP OH-containing解决方案。所有动物实验动物伦理委员会批准韩国蔚山大学和符合国家卫生研究院的指导方针。老鼠被杀死后4 h快,血液通过心脏穿刺收集。

2.3。细胞培养和治疗

小鼠巨噬细胞细胞细胞株Raw264.7从韩国细胞系获得银行(KCLB40071,首尔,韩国),维护在RPMI1640(美国纽约Gibco BRL)含有10%(卷/期)的边后卫(胎牛血清)(美国纽约Gibco BRL)和37°C湿润5%孵化有限公司₂。3 t3-l1 preadipocytes是生长在DMEM(杜尔贝科修改鹰的介质)高葡萄糖(美国纽约Gibco BRL)包含10%的边后卫。分化3 t3-l1 preadipocytes成熟脂肪细胞和胰岛素诱导,地塞米松,和3-isobutyl-1-methyl-xanthine描述(15),和3 t3-l1分化细胞分化的6天。Coculture脂肪细胞和巨噬细胞进行接触系统:3 t3-l1脂肪细胞(细胞/)孵化24-well板块和Raw264.7巨噬细胞(细胞/)被放置在脂肪细胞。脂肪细胞和巨噬细胞是用氯高铁血红素预处理,ZnPP或CORM-2 RuCl₃表示浓度的1 h coculture之前24 h。作为一个控制,脂肪细胞和巨噬细胞的数量等于单独接触系统培养和收获后混合。

2.4。脂肪细胞和巨噬细胞的分离

Cocultures相同数量的3 t3-l1脂肪细胞和Raw264.7巨噬细胞(如前所述)分离使用CD11b微系统(mac;Miltenyi研究,美国加州森尼维尔市)根据制造商的协议。短暂,cocultured收集细胞,洗两次缓冲区(磷酸缓冲盐(PBS)补充2毫米EDTA和0.5%牛血清白蛋白(BSA)),和孵化CD11b微15分钟在4°C。清洗和resuspended细胞应用于mac列,保留CD11b⁺细胞和允许-细胞(组织)通过。列从分离器中删除,然后放在一个合适的集合管。适当数量的列缓冲区被用移液器吸取到列冲洗出阳性细胞(巨噬细胞)和列用柱塞一个供应商。这种方法导致纯CD11b 90%至95%⁺细胞,流式细胞术的评估。

2.5。制备脂肪细胞/ Macrophage-Conditioned媒介

Adipocyte-conditioned媒介收集从3日成熟t3-l1脂肪细胞的无血清培养系统在24小时。准备Raw264.7 macrophage-conditioned介质,巨噬细胞孵化24 h和5μg / mL脂多糖(σ,圣路易斯,密苏里州,美国),与PBS洗一次,无血清培养系统在24小时。这些条件媒体收集和过滤清除残骸。

2.6。测量细胞因子水平

细胞因子水平文化上层清液由酶联免疫吸附分析(ELISA)测定使用TNF - OptEIA老鼠α集(BD生物科学Pharmingen、钙、美国),鼠标il - 6,脂联素组和il - 4包(研发系统、明尼阿波利斯、MN)。细胞因子水平值来源于标准曲线使用曲线拟合程序SOFTmax(分子器件、桑尼维尔,美国)。

2.7。实时定量PCR(存在)

从培养细胞总RNA提取使用M-MLV reverse-transcribed生成cDNA逆转录酶(Promega,麦迪逊,WI)。实时PCR扩增的cDNA在重复执行SYBR预混料交货Taq工具包(豆类生物公司,福斯特,CA)使用一个热循环骰子(豆类生物有限公司、日本)。所有反应都是由相同的过程:初始变性在95°C 10年代,紧随其后的是45周期95°C的5 s和60°C 30年代。结果分析与实时系统TP800软件,和所有感兴趣的基因值归一化值看家基因(36 b4 cocultured细胞;β肌动蛋白脂肪组织)。鼠标使用引物序列如下:脂联素,5′-GTCAGTGGATCTGACGACACCAA-3′(向前),5′-ATGCCTGCCATCCAACCTG-3′(反向);il - 4、5′-ACGGAGATGGATGTGCCAAAC-3′(向前),5′-AGCACCTTGGAAGCCCTACAGA-3′(反向);CD274 5′-GCCTCACTTGCTCATTACAGGTTC-3′(向前),5′-GCAGTAGCTGTCAAGGGCTCA-3′(反向);NOS2 5′-CAAGCTGAACTTGAGCGAGGA-3′(向前),5′-TTTACTCAGTGCCAGAAGCTGGA-3′(反向);Mrc1 5′-AGCTTCATCTTCGGGCCTTTG-3′(向前),5′-GGTGACCACTCCTGCTGCTTTAG-3′(反向);Clec10a 5′-GGTCGTCTCCGTGATTGGAT-3′(向前),5′-GGTGGTGTTGTCTAAAGTGGCTCTC-3′(反向);HO-1,5′-TGCAGGTGATGCTGACAGAGG-3′(向前),5′-GGGATGAGCTAGTGCTGATCTGG-3′(反向);肿瘤坏死因子-α;il - 6;36 b4;β肌动蛋白(15]。

2.8。免疫印迹分析

核和胞质蛋白提取准备使用NE-PER核和胞质提取试剂(美国罗克福德热科学)根据制造商的指示。附睾的脂肪组织收集,在PBS洗,均质在冰冷的CER我缓冲区。在孵化后10分钟,冰冰冷的CER二世是添加到细胞悬液,混合,孵化1分钟。胞质提取后收集细胞离心5分钟的15000克。核球然后resuspended在冰冷的尼珥和孵化与涡流40分钟15秒每10分钟。核提取离心后收集(10分钟15000克、4°C)。其他样本细胞溶解裂解缓冲(10毫米Tris-HCl,氯化钠10毫米,0.1毫米EDTA,氟化钠50毫米,10毫米Na₄P₂O₇1毫米MgCl₂脱氧胆酸盐,0.5%,1% IGEPAL ca - 630,蛋白酶抑制剂鸡尾酒)和离心机。样品的蛋白质含量是决定用BCA蛋白质工具包(美国罗克福德IL皮尔斯)。样品含有10 - 30μ克总蛋白受到使用多克隆抗体免疫印迹分析磷酸化物(p-JNK) (c-Jun伴激酶),总物,pSTAT6 (Tyr641),总STAT6,和组蛋白H3(细胞信号,丹弗斯、马、美国);CD68, PPARγ,我κBα(核因子抑制剂κBα),NF -κB p65(圣克鲁斯生物技术、圣克鲁斯、钙、美国);HO-1(法明岱尔恩佐生命科学公司,纽约);和β肌动蛋白(σ)。

2.9。统计分析

结果意味着±SEM。使用学生的统计进行比较t以及与邓肯的多个测试。差异被认为是重要的。

3所示。结果

3.1。氯高铁血红素诱发HO-1表达式在巨噬细胞和/或脂肪细胞

我们首先检查氯高铁血红素的影响在cocultured HO-1表达式脂肪细胞/巨噬细胞,模拟炎症在肥胖脂肪组织环境。预处理前脂肪细胞和巨噬细胞coculture与氯高铁血红素显著调节HO-1表达在转录和蛋白质含量(数字1(一)和1 (b)),HO-1感应被证实分离脂肪细胞和/或巨噬细胞从coculture检索(图1 (b))。

3.2。HO-1感应减少从Cocultured脂肪细胞释放炎性细胞因子/巨噬细胞

接下来,我们检查是否HO-1氯高铁血红素诱导的炎性细胞因子的影响生产cocultured细胞。如图2HO-1感应显著降低释放促炎细胞因子TNF -α(图2(一个))和il - 6(图2 (b))从cocultures,成绩单的脂联素水平增加(图2 (c))。氯高铁血红素的影响被ZnPP钝化,HO-1的竞争性抑制剂(数字2(一个)- - - - - -2 (c))。此外,CO-releasing分子,CORM-2试剂,模仿HO-1的生物效应13,16),还减毒coculture-induced炎性细胞因子的生产(数字2(一个)- - - - - -2 (c)),这表明氯高铁血红素的效果与CO释放有关。HO-1感应的影响,氯高铁血红素似乎很大程度上取决于公司发布,因为RuCl₃不解放公司(13),没有任何影响炎性细胞因子的释放。

3.3。HO-1感应抑制炎症信号Cocultured脂肪细胞/巨噬细胞

我们进一步研究了氯高铁血红素对炎症的影响信号分子。我们对待3 t3-l1脂肪细胞或Raw264.7巨噬细胞与巨噬细胞或adipocyte-conditioned介质(M厘米或Adi-CM)激活炎症信号通路。我们发现这两个条件媒体减少HO-1表达式在脂肪细胞和巨噬细胞(数据未显示),伴随着增加物的磷酸化和我κBα退化(图2 (d)和2 (e))。Hemin-induced HO-1表达抑制物的磷酸化,CORM-2一样,在这两种脂肪细胞(图2 (d))和巨噬细胞(图2 (e))。此外,抑制增加两个代理我κBα在M退化/ Adi-CM-treated脂肪细胞/巨噬细胞。ZnPP和RuCl₃没有效果。

3.4。HO-1诱导促进M2巨噬细胞极化Cocultured脂肪细胞/巨噬细胞

为了测试是否HO-1感应影响巨噬细胞极化在cocultured脂肪细胞/巨噬细胞,我们对其影响M1和M2巨噬细胞标记物的表达。如图3HO-1感应,从cocultures氯高铁血红素增加释放il - 4, CORM-2一样(图3(一个))。它也增强il - 4(图记录水平3 (b))。与此一致的是,它还会增强转录水平的M2巨噬细胞标记如Mrc1(图3 (c))和Clec10a(图3 (d)),而它的转录水平降低M1巨噬细胞标记CD274(图3 (e))。

3.5。HO-1感应减少HFD-Induced脂肪组织炎症反应

延长在体外结果,我们把C57BL / 6小鼠60% HFD或控制饮食与氯高铁血红素2周注射每周3次。HFD hemin-treated小鼠给予60%的身体重量显著增加不到vehicle-injected的老鼠,和食物摄入这两组之间没有差别(图4(一))。如图4氯高铁血红素降低炎性细胞因子(TNF -水平α和il - 6)在HFD-fed老鼠的脂肪组织(图4 (b))和il - 4和脂联素水平增加(图4 (c))。氯高铁血红素治疗并不影响CD68的表情,巨噬细胞标记(图4 (d))。它抑制物的磷酸化和我κBα退化(图4 (d))。我们进一步测量NF -的表达κ亚基的NF - B p65κB转录复杂,脂肪组织的细胞质和核分数。我们发现氯高铁血红素减少核易位p65,指着NF -减少κB激活HFD-fed老鼠的脂肪组织(图4 (d))。它表明HO-1氯高铁血红素抑制炎症信号诱导的脂肪组织,同意在体外观察。

3.6。HO-1感应诱发M2在脂肪组织巨噬细胞极化

我们进一步检查HO-1感应的效果与氯高铁血红素在脂肪组织中巨噬细胞极化HFD-fed老鼠。如图5氯高铁血红素治疗水平的提高HO-1成绩单(图5(一个)(图)和蛋白质5 (c))在脂肪组织和成绩单的M2标记基因(Mrc1和Clec10a)(图5 (b))虽然减少了M1标记表达式(CD274和NOS2)(图5 (b))。此外,HO-1抑制剂ZnPP完全封锁了upregulation M2标记(Mrc1和Clec10a) M1的差别,对这些基因的标记(CD274和NOS2)成绩单(图5 (b))。这些变化都伴随着upregulation PPARγ表达式,M2巨噬细胞表型转换角色,和STAT6激活,il - 4的信号分子通路(图5 (c))。

4所示。讨论

Obesity-induced脂肪炎症的特征是招募巨噬细胞在脂肪组织和激活的细胞释放炎症介质。脂肪细胞和巨噬细胞之间的直接信息相声很可能促进肥胖的脂肪组织炎症反应的关键(15,17]。使用接触cocultured脂肪细胞/巨噬细胞系统和模拟炎症在肥胖脂肪组织环境,我们第一次发现HO-1感应的氯高铁血红素显著降低炎性细胞因子(TNF -水平α从cocultures和il - 6)释放。类似的效应是由CORM-2, CO-releasing代理。感应HO-1是明显的从cocultures组成细胞类型的检索,以及氯高铁血红素的影响是完全由HO-1抑制剂ZnPP钝化。这些观察表明,感应到HO-1氯高铁血红素,通过酶的释放公司的活动,负责减少炎性细胞因子释放的细胞类型。

接下来,我们研究了氯高铁血红素在炎症信号的影响。当脂肪细胞和巨噬细胞刺激与相应的条件培养基,我们发现氯高铁血红素抑制炎症信号分子的激活物和NF -κB的脂肪细胞和巨噬细胞,而HO-1抑制剂ZnPP钝化cocultures hemin-induced抑制炎症信号分子,表明减少炎性细胞因子释放氯高铁血红素是由于炎症信号的抑制作用。更重要的是,我们发现公司制片人CORM-2也抑制物的磷酸化和NF -κB激活。考虑到公司,由HO-1血红素分解代谢的副产品,施加强大的抗炎作用通过抑制物/ AP-1绑定(18)和/或NF -κB绑定(19),氯高铁血红素的抑制作用的激活炎症信号分子,至少部分由HO-1与公司生产有关,导致减少炎性细胞因子。因为抗炎M2巨噬细胞抑制M1 macrophage-mediated通过抑制物和NF -炎症反应κB (20.- - - - - -22),我们进一步询问是否抑制炎症信号cocultured氯高铁血红素的脂肪细胞/巨噬细胞与巨噬细胞极化有关。我们的确发现氯高铁血红素调节转录的M2巨噬细胞标记(Mrc-1、Clec10a和il - 4),虽然减少了M1巨噬细胞标记(CD274和TNF -αcocultures)。这些发现表明,氯高铁血红素对炎症的抑制作用信号导致切换M1和M2 cocultures巨噬细胞表型。

随后,我们证实氯高铁血红素的影响在活的有机体内通过将氯高铁血红素注入HFD-fed老鼠。氯高铁血红素注射明显调节HO-1表达在转录和蛋白质含量,降低炎性细胞因子的水平在脂肪组织,这也伴随着减少激活炎症信号分子和增加M2巨噬细胞标记物的表达。此外,由于氯高铁血红素治疗没有改变CD68表达HFD-fed老鼠的脂肪组织,但增加M2标记表达式,氯高铁血红素在脂肪组织的抗炎效果可能取决于极化M2表型。与我们的研究结果一致,其他的研究也报道,HO-1系统减少了各种代谢并发症如糖尿病疾病和血管性疾病:adipocyte-specific HO-1减毒HFD-mediated的过度肥胖和血管功能障碍,提高胰岛素敏感性,改善脂肪细胞功能通过增加脂联素和通过减少炎性细胞因子包括MCP-1 [23]。此外,氯高铁血红素选择性刺激巨噬细胞极化对消炎M2-phenotype糖尿病和/或自发高血压大鼠(23- - - - - -27]。这些与我们的研究结果表明,由氯高铁血红素减少obesity-induced HO-1感应脂肪组织炎症通过促进巨噬细胞表型转换,这可以防止与肥胖相关的代谢并发症。然而,HO-1感应可能在某些条件不利的:它会加重感染肠出血性大肠杆菌通过减少一氧化氮产量在人类肠上皮细胞(28),同时也增强了胰腺肿瘤的生长和转移通过增加血管生成(29日)和加剧星形神经胶质细胞内氧化应激,导致脑损伤(30.]。因此,谨慎是必须的如果HO-1抗病诱导剂作为治疗目标。

应该注意的是,PPARγ激活质数单核细胞到一个增强M2表型或具有明显抗炎作用M1巨噬细胞(31日]。通过这PPAR行之有效的途径之一γ控制炎症反应是通过干扰炎症信号通路包括AP-1、NF -κB在M1激活巨噬细胞(32]。此外,它还直接控制基因的表达参与诱导M2巨噬细胞表型,如精氨酸酶基因(我33]。因为HO-1增强PPAR的表达和活性γ(34),相反是PPAR的目标基因γ信号(35),PPAR的upregulationγ可能促进极化对M2表型。此外,我们发现脂联素,另一个分子促进M2巨噬细胞极化(36,37)和PPARγ脂肪组织的目标基因,增加hemin-injected HFD-fed老鼠,这与先前的研究一致(23]。HO-1感应到STAT6氯高铁血红素也增加il - 4和磷酸化,典型的il - 4受体激活的迹象,HFD-fed老鼠的脂肪组织。由于il - 4信号通过STAT6磷酸化PPAR诱发转录γ和他们共激活剂,放大签名M2蛋白的表达(38),增加il - 4 / STAT6 / PPARγ对hemin-induced M2巨噬细胞极化信号可能是重要的。

总之,我们已经表明,HO-1感应氯高铁血红素降低炎症反应在cocultured脂肪细胞/巨噬细胞和脂肪组织的HFD-fed老鼠。HO-1感应的保护作用与脂肪炎症与极化对通过PPAR M2巨噬细胞表型γ和STAT6通路。HO-1氯高铁血红素等诱发因素可能有助于防止obesity-induced脂肪炎症。

利益冲突

作者宣称没有利益冲突有关的出版。

承认

这项研究受到了生物和医学技术发展计划的国家研究基金会(NRF)由韩国政府(最高明的)(2012 m3a9c3048687)。