文摘

类风湿性关节炎(RA)滑膜的特点是慢性炎性浸润和促炎细胞因子的高程。胞质磷脂酶一2(cPLA2)是参与炎性疾病的发展。血红素oxygenase-1 (HO-1)已被证明具有抗炎作用。这项研究的目的是调查的详细机制TNF -α全身cPLA2表达和确定一氧化碳释放molecule-2 (CO-RM2)抑制肿瘤坏死因子-αNF -全身的表达式κB-related促炎的基因,包括cPLA2通过HO-1感应在RA滑膜成纤维细胞(RASFs)。这里,我们报道,TNF -α全身cPLA2表达式是通过TNFR1 / PKC介导的α端依赖的信号通路,包括NADPH氧化酶(NOX)激活/ ROS生产和NF -κB激活。CO-RM2显著抑制肿瘤坏死因子-α全身cPLA2表达式通过抑制ROS的生成和NF -的磷酸化κB p65 IKKα/β,但不是p38 MAPK和JNK1/2的磷酸化。这些结果进一步证实了芯片分析检测NF -κB dna结合活性。我们的研究结果表明,感应的HO-1 CO-RM2施加抗炎和抗氧化效果要求一致,防止NF -的激活κB导致各种炎症基因的诱导与RA的发病机制。

1。介绍

滑膜细胞似乎参与滑膜的炎症细胞浸润和进步的滑膜炎症,导致不可逆的联合破坏[1]。一旦激活,滑膜细胞产生TNF -α和il - 1β参与维持监管反馈回路和诱发炎症介质的表达(2]。胞质磷脂酶一2(cPLA2)负责解放sn-2位置的花生四烯酸膜磷脂,导致前列腺素和白三烯生物合成(3]。它已经表明,cPLA2调节了il - 1β在人类风湿性关节炎滑膜成纤维细胞(RASFs) [4]。cPLA2有缺陷的小鼠显示明显下降在胶原诱导关节炎滑膜炎症和疾病严重程度5]。因此,抑制cPLA2表达和铂族元素2生产被认为是重要的治疗类风湿性关节炎(RA)的目标。

RA滑膜暴露在滑膜成纤维细胞产生的活性氧,是与RA的发病机制(6]。过氧化物的主要来源之一是NADPH氧化酶(NOX);这种氮氧化物复杂是两个membrane-located子单元组成的 NOX2和复杂的组成 , , ,局部在细胞质中7,8]。证据表明,激活氮氧化物涉及的磷酸化 启动大会的细胞质膜的组件和易位的完整与氮氧化物和功能氧化酶(9- - - - - -11),这表明 是一种调节亚基膜的氮氧化物。在synoviocytes NOX2可以通过细胞因子(特别是负责过氧化物生产12]。越来越多的证据也表明,ROS作为第二信使在NF -的激活κB (11),导致各种炎症基因的诱导(13,14]。然而,氮氧化物/ ROS和NF -之间的分子机制κ肿瘤坏死因子- B激活α诱导cPLA2表达式仍然未知。

血红素加氧酶1 (HO-1)诱导的氧化应激和不同的刺激,它充当一个宿主防御机制由于其抗氧化和抗炎作用11,15,16]。HO-1-based保护的确切机制还没有完全理解。越来越多的证据表明,HO-1的保护作用可能是通过其介导的副产品包括一氧化碳(CO)、胆绿素/胆红素和自由铁。HO-1副产品中,公司已经显示出抑制LPS-induced炎性因子的表达,增加LPS-induced巨噬细胞il - 10的表达,表明公司参与HO-1[的抗炎作用17]。最近,金属羰基化合物已经被确认为CO-releasing分子(生长),可能促进制药使用有限公司通过提供组织和器官(18]。这些化合物可以减弱白细胞封存在肝脏和肺组织通过干扰NF -κB激活和ICAM-1表达式,因此抑制内皮细胞proadhesive表型(19]。因此,我们假设在TNF - HO-1调和其有益的影响α全身炎性关节cPLA的差别,通过对这些基因2。为了验证这一点,我们使用tricarbonyldichlororuthenium (II)二聚体([俄文(有限公司)3Cl2]2CORM-2)作为CO-releasing分子和HO-1诱导物。

这里,我们报道,TNFR1 / PKCα端依赖激活NF -κB是通过磷酸化IKK介导的α/β和NF -κB p65和氮氧化物/ ROS的生成,诱导cPLA所需2肿瘤坏死因子-α挑战RASFs。另一方面,CORM-2 HO-1表达显著下调肿瘤坏死因子-增加α全身cPLA2表达式。CORM-2发挥保护作用的可能机制是通过抑制氮氧化物/ ROS介导的生产和IKKα/β和p65磷酸化TNF -α。我们的发现提供了新的见解的机制CORM-2施加在RA抗氧化和抗炎作用。

2。材料和方法

2.1。材料

Diphenyleneiodonium氯(DPI), Go6976, U0126 SB202190, SP600125, helenalin获得Biomol(普利茅斯会议上,PA)。Apocynin是从ChromaDex(圣安娜,CA)。防治(NAC) tricarbonyldichlororuthenium (II)二聚体(CORM-2)和氯化钌(III)(不活跃的CORM-2)购买的σ(圣路易斯,密苏里州)。Anti-GAPDH抗体来自生源论(英国Boumemouth)。反 、anti-HO-1 anti-Gsα,anti-g ,anti-gydF4y2Baβ肌动蛋白,anti-cPLA2抗体是来自圣克鲁斯(圣克鲁斯,CA)。Anti-phospho-p38 MAPK、anti-phospho-JNK1/2 anti-phospho-PKCα/β二、anti-phospho-p65 anti-phospho-IKKα/β抗体来自细胞信号(丹弗斯,MA)。Dihydroethidium(她)从分子探针(尤金,或者)。

2.2。人类滑膜成纤维细胞的隔离和文化

RASFs得到来自29个RA患者膝关节或髋关节手术。从所有患者知情同意了,实验机构审查委员会批准的协议,长庚纪念医院。RASFs分离、培养和特征(如前所述)(20.,21]。实验用细胞通道3 - 6所示。

2.3。动物

雄性ICR小鼠年龄在4 - 6周内购买来自国立台湾大学医学院实验动物中心。老鼠维护条件下符合长庚大学动物保健委员会的指导方针,以及指导的护理和使用实验动物在美国国家研究委员会。小鼠腹腔内注射麻醉的200μL(戊巴比妥钠(5毫克/毫升)。老鼠有一个intraarticular注入CORM-2 (8μ克/公斤体重)或磷酸盐(PBS)治疗与肿瘤坏死因子-前16个小时α(30μ克/公斤体重),24小时后被牺牲了。

2.4。免疫组织化学染色

免疫组织化学染色进行串行部分的脚踝关节,deparaffinized,水化,并与PBS洗。非特异性结合被预孵化与PBS含5毫克/毫升的BSA在室温下1 h。部分与anti-cPLA孵化2或anti-HO-1 37°C 1 h,然后与一个anti-rabbit辣根过氧化物酶Ab在室温下1 h。绑定Abs检测到孵化在0.5毫克/毫升3,3′-diaminobenzidine / 0.01%过氧化氢在100毫米Tris-HCl缓冲区,作为发色体(向量实验室。,伯林盖姆,CA)。第二部分是孵化的anti-vimentin Ab积极的定位和滑膜成纤维细胞的识别。图片是放大的光学显微镜下获得200或400××。免疫组织化学染色法的定量数据cPLA的百分比计算2阳性细胞在vimentin-positive细胞在微观领域,使用ImageJ软件。

2.5。免疫荧光染色

细胞被镀6-well文化板块盖玻片,转移到血清DMEM-Ham F-12的24小时,然后用TNF -孵化α。细胞被固定,permeabilized和染色使用anti-p65抗体如前所述[21]。荧光显微镜图像采集(Axiovert 200,蔡司)使用100 x的目标。

2.6。免疫印迹分析

Growth-arrested RASFs与TNF -孵化α在指定的时间间隔。细胞被洗净,刮、收集和离心机在4°C 45000×g 1 h产生整个细胞提取物,如前所述[21]。样本变性,受到使用12% sds - page凝胶,并转移到硝酸纤维素。膜与一个anti-cPLA孵化2抗体24 h,然后用一个孵化anti-mouse辣根过氧化物酶抗体1 h。免疫反应性的乐队被ECL试剂检测。

2.7。瞬时转染与siRNAs

人类siRNAs PKCα, 从σ,JNK1 p38和炒(圣路易斯,密苏里州)。瞬时转染的siRNAs执行使用Metafectene转染试剂从Biontex实验室(Planegg / Martinsried GmbH,德国)根据制造商的指示。转染混合物被稀释到500年μL DMEM / F-12中有10%的边后卫和抗生素和直接添加到细胞。16 h转染后,介质代替血清DMEM / F-12 24 h。细胞溶解产物准备与TNF - RASFs挑战α被免疫印迹分析。

2.8。实时定量PCR分析

RNA提取使用试剂盒和合成第一链cDNA是1μ使用上标2 g的总RNA逆转录酶(英杰公司)根据制造商的协议。引物和探针用于人类cPLA实时PCR2和GAPDH是来自应用生物系统公司(CA)福斯特城。每一个PCR反应(20μL)含有100 ng cDNA、PCR大师,和预调TaqMan基因表达分析组件包含一个FAM记者染料的5′端TaqMan探针和nonfluorescent冷却器(NFQ)的3′端调查。人类GAPDH是用作控制验证互补dna模板的质量。执行实时PCR和分析由ABI StepOnePlus QPCR仪器(CA)福斯特城。

2.9。测量细胞内的活性氧积累

在表示时间刺激后,dihydroethidium(她5μ米)添加到中、孵化为30分钟37°C。细胞被洗PBS和她的荧光图像RASFs可视化在荧光显微镜使用20 x客观(蔡司,Axiovert 200)。20 - 30细胞的平均荧光强度值利用ImageJ软件计算了三种不同的考试。

2.10。NADPH氧化酶活性

由lucigenin-enhanced NADPH氧化酶活性测定化学发光在50 mM磷酸盐缓冲剂(缓冲),包含1毫米EGTA,蛋白酶抑制剂,150毫米蔗糖,10μM lucigenin(σ),10μM NADPH作为底物(22]。静止细胞被血清饥饿不足24小时,视为表示,洗两次与冰冷的磷酸盐(PBS)和收获。低旋转离心后,颗粒在冰冷的resuspended缓冲,缺乏lucigenin和衬底。总蛋白浓度测定用BCA蛋白质分析工具包(美国皮尔斯),调整为1毫克/毫升。100年μL整除的蛋白质样品测量超过10分钟一式四份用NADPH作为衬底的Appliskan光度计(热)out-of-coincidence模式。

2.11。的制备和分析细胞分数

细胞被收获,然后用冰冷的PBS洗两次,300年μL的均化缓冲(20毫米Tris-HCl (pH值8.0),EGTA 10毫米,2毫米EDTA,德勤2毫米,1毫米PMSF, 25岁μ10 g / mL抑肽酶,μg / mL亮抑酶肽)被添加到每个菜,和细胞被刮到1.5毫升用橡皮管警察。悬架是用近10年代与超声发生器输出4(超声学)和离心机在5000 g×15分钟在4°C颗粒核和其他碎片。上层清液可以保留细胞质分数和进一步离心机在15000 g×60分钟4°C到产生颗粒(膜部分)和上层清液(胞质分数)。Gsα是用作膜标记蛋白质分数。

2.12。Coimmunoprecipitation化验

细胞溶解产物含有1毫克的蛋白质是孵化2μ克anti-PKCα或者在4°C anti-TNFR1抗体24 h,然后10μL 50%的蛋白质A-agarose珠子在4°C和混合添加24 h。收集免疫沉淀反应和洗涤三次裂解缓冲没有特里同x - 100。5 x Laemmli缓冲区添加,受到12% sds - page电泳,然后使用一个anti-PKC涂抹α或anti-TNFR1抗体。

2.13。测量cPLA2和NF -κB子活动

cPLA的建设2人类cPLA -promoter-Luc质粒2启动子区域(~ 1674个基点)是从人类基因组DNA和PCR扩增之间插入荧光素酶基因和SV40晚聚(A)信号编码区域的荧光素酶质粒与野生型cPLA pGL32启动子的质粒。的cPLA2启动子区域扩大了传统使用以下引物PCR:正向引物5′-GGGGTACCAGAACGAACATGCCCTGCAGTATAGA-3′和反向引物5′-GGAAGCTTGCTGACTTTAAGCAGCGAGG-3′。DNA片段直接subcloned pGL3使用KpnI和HindIII。向量序列DNA测序证实了利用试剂盒质粒DNA制备包和放大。的pNF——虽然κB-Luc (Clontech)或cPLA2启动子活性决定如前所述[21]。萤火虫启动子荧光素酶活动是标准化β牛乳糖活动。

2.14。染色质免疫沉淀反应(芯片)的测定

如前所述(执行芯片分析21]。溶性染色质免疫沉淀反应是使用一个anti-p65抗体。使用纯化DNA进行PCR扩增引物含有NF -特定的区域κB结合位点出现在cPLA2子:5′-GAGACGGAGTCTCGCTCTGT-3′(意义)和5′-GTGGCTCACGCCTGTAATCC-3′(反义)。PCR分析了碎片在1 x Tris-acetate-EDTA 2%琼脂糖凝胶含有溴化乙锭。

2.15。测量铂族元素2释放

细胞治疗肿瘤坏死因子-α(30 ng / mL)的16个小时表示抑制剂的存在与否。收集媒体和铂族元素2使用铂族元素化验吗2酶免疫分析法工具包(开曼化学)。

2.16。统计分析的数据

所有数据至少代表三个独立的实验,比较≥3人口是使用GraphPad棱镜程序(GraphPad软件,Inc .)。数据表示为均值±扫描电镜,分析了单向方差分析与图基的事后测试。相比团体之间的显著差异表明: ; 。

3所示。结果

3.1。过度的HO-1 CORM-2变弱TNF -α全身cPLA2表达式

首先,我们调查了在人类RASFs CORM-2对HO-1表达的影响。治疗人类RASFs CORM-2导致HO-1增加蛋白质和mRNA表达,但不是cPLA2(数据1(一)和1 (b))。接下来,我们发现,肿瘤坏死因子-α诱导cPLA2蛋白质和mRNA表达,启动子活动时间和浓度的方式(数字1 (c)和1 (d))。在我们之前的研究中,超表达的HO-1人类气管平滑肌细胞可以抑制VCAM-1和ICAM-1诱导细胞因子的表达(11]。因此,我们研究了在TNF HO-1——的角色α全身cPLA2表达式。确定HO-1蛋白质过度可以下调cPLA2表达,我们人类RASFs预处理CORM-2 16 h与TNF -然后孵化α16 h。cPLA2表达显著诱导肿瘤坏死因子-α减毒的HO-1 CORM-2诱导的浓度的方式(图1 (e))。此外,我们专门HO-1 CORM-2引起的表达特点。如图1 (f)孵化,活动形式的CORM-2 (iCORM-2)未能诱导HO-1表达和降低TNF -α全身cPLA2表达式。一致,肿瘤坏死因子-α刺激cPLA2信使rna表达的预处理和启动子活性也降低CORM-2(图1 (g))。这些结果表明CORM-2-induced HO-1表达式产生抑制性影响TNF -α全身cPLA2在RASFs表达式。

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图1
CORM-2增强HO-1表达和调节TNF -α全身cPLA2在RASFs表达式。RASFs (a)不同浓度处理或(b) 25μM的CORM-2指定的时间间隔。(c) RASFs与不同浓度的TNF -孵化α在指定的时间间隔。(d)细胞与肿瘤坏死因子-孵化α(30 ng / mL)为指定的时间间隔。cPLA的mRNA水平2和cPLA2吕克·子被测量。(e)细胞与不同浓度的预处理CORM-2 16 h与TNF -然后孵化α16 h。细胞被使用(f) CORM-2 iCORM-2或(h)与炒(scrb)或转染HO-1 siRNA没有或TNF -然后孵化α16 h。((a)、(c) (e), (f)和(h))细胞溶解产物分析使用一个anti-cPLA西方墨点法2、anti-HO-1或anti-GAPDH(控制)。((g),打开酒吧)RASFs没有或CORM-2,预处理或iCORM-2 16 h,并与肿瘤坏死因子-孵化α(30 ng / mL) 6 h。cPLA2信使rna被定量实时PCR分析。((g),渐变酒吧)RASFs cPLA转染2luc报告基因,进行预处理或与CORM-2 iCORM-2 16 h,并与肿瘤坏死因子-孵化α(30 ng / mL) 6 h。启动子荧光素酶活性进行了分析。所有分析样本4类风湿性关节炎患者。结果是代表三个独立的实验。值均值±SEM。((b) - (d)) ; ,而细胞暴露于车辆本身;((e) - (g)) ; 与细胞暴露于TNF -α一个人。
3.2。肿瘤坏死因子-αPKC介导的招聘α参与cPLA TNFR1复杂2感应

大多数肿瘤坏死因子-α通过TNFR1效应引起。此外,PKCα是一个重要的监管机构在TNF -α/ TNFR1-mediated信号(23]。在这项研究中,我们探讨是否PKCα可以调节肿瘤坏死因子-α全身cPLA2表达式。如图2(一个)肿瘤坏死因子-α全身cPLA2表达式是由预处理抑制PKC抑制剂α/β,Go6976。此外,肿瘤坏死因子-α时间刺激PKCα/β二世磷酸化在刺638/641与最大响应在10到60分钟(图2 (b))。预处理与Go6976减毒TNF -α刺激PKCα/β二世磷酸化期间观察(图2 (b),上半部分)。我们还发现,肿瘤坏死因子-αPKC诱导α/β二世磷酸化通过TNFR1通过使用TNFR1中和抗体(TNFR1 nAb)(图2 (b)较低的面板)。我们进一步证明TNF -α刺激PKCα和PKCβ第二转位从胞质膜(图2 (c))。为了进一步确保PKC的角色α肿瘤坏死因子-α全身cPLA2表达式,如图2 (d),与PKC转染α核表达下调总PKC的表达α蛋白质,然后明显抑制cPLA2表达诱导肿瘤坏死因子-α。TNFR1之间的相互作用和PKC信号通路在炎症反应是反映在关键蛋白质的表达与调控24]。我们接下来检查TNFR1之间的交互和PKCα肿瘤坏死因子-α刺激RASFs。我们发现,肿瘤坏死因子-α时间刺激立即PKC之间的相互作用α和TNFR1(图2 (e)),由预处理抑制Go6976(图2 (f))。这些结果表明TNF -α全身cPLA2表达式是通过TNFR1 / PKC介导的α在RASFs信号通路。

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图2
肿瘤坏死因子-α全身cPLA2表达式是通过形成TNFR1 / PKC介导的α复杂。RASFs被使用(a) Go6976 1 h或与PKC (d)转染α或炒(scrb)核与TNF -然后孵化α16 h。(b)细胞进行预处理或Go6976 (1μ米)或一个anti-TNFR1中和Ab (1μg / mL)与肿瘤坏死因子- 1 h然后孵化α(30 ng / mL)为指定的时间间隔。(c) RASFs与TNF -刺激α在指定的时间间隔。膜(我)和胞质提取物(CE)准备。细胞分数被免疫印迹分析使用抗体和anti-Gs表示α和β肌动蛋白用作我和CE、内部控制。((e)和(f)) RASFs被使用或没有(f) Go6976 (1μ米)与肿瘤坏死因子- 1 h和刺激α指定的时间间隔(e)或5分钟(f)。RASFs免疫沉淀反应使用anti-PKC (IP)α(上)或anti-TNFR1(底部)抗体。细胞溶解产物免疫沉淀反应,分析了使用anti-PKC西方墨点法α或anti-TNFR1抗体。输入代表完整的细胞免疫沉淀反应之前提取。所有分析样本4类风湿性关节炎患者。结果是代表三个独立的实验。值均值±SEM。控制部分(b)(左),(c)和(e), ; 与车辆。在(a)、(b)(正确,实验部分)和(d), ; 与肿瘤坏死因子-α一个人。
3.3。参与氮/ ROS生成在肿瘤坏死因子-α全身cPLA2表达式

活性氧释放在联合组织的炎症反应和与风湿性关节炎软骨退化6,25,26]。肿瘤坏死因子-α诱导表达的基因通过NOX-dependent ROS介导的中介机构包括H2O2和超氧化物阴离子11]。首先,我们测量是否TNF -α可以诱导细胞内活性氧的生产。如图3(一个)肿瘤坏死因子-α诱导显著增加氮氧化物和活性氧的生产活动。PKC亚型,主要,PKCα,β二世,δ,都被定性为一个重要的催化剂的氮氧化合物(27,28]。在这里,我们还显示,与PKC抑制剂预处理α(Go6976)和氮氧化物(DPI和APO)明显降低TNF -α全身的氮氧化物活动和ROS水平(图3 (b)),这表明TNF -α通过PKC诱导活性氧生成α/在RASFs氮氧化物。我们进一步证实,肿瘤坏死因子-α诱导cPLA2表达式通过氮氧化物和ROS通过使用NAC, DPI, APO,或者, 核。如数据所示3 (c)和3 (d)与南汽预处理,DPI或APO和转染 核显著废除TNF -α全身cPLA2表达式。另一方面,我们观察到,TNF -α按时间的刺激 易位从胞质膜,抑制与DPI或Go6976(数据预处理3 (e)和3 (f))。综上所述,这些数据表明TNF -α诱发cPLA2通过PKC表达α端依赖氮氧化物RASFs激活和ROS生成。

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图3
肿瘤坏死因子-α诱发氮/ ROS生成和cPLA2通过PKC表达α。(一)细胞被孵化的TNF - 30 ng / mLα在指定的时间间隔。接下来,添加细胞(5μ米)她和DHE-labeled红色细胞荧光显微镜下计数。开酒吧表示她染色的统计分析。NADPH氧化酶活性(阴影酒吧)决定的。(b) RASFs使用Go6976 (1μ米),DPI (5μ米),或者APO (50μ米)与肿瘤坏死因子- 1 h然后刺激α90分钟(开放酒吧)或1 h(阴影酒吧)。ROS生成和NADPH氧化酶活性测定。(c)细胞使用NAC, DPI或APO与肿瘤坏死因子- 1 h然后孵化α16 h。cPLA的表达2是由西方墨点法。(d)与炒或细胞转染 核与TNF -然后孵化α16小时。的水平 和cPLA2蛋白质免疫印迹测定。细胞培养(e) TNF -α指定的时间间隔或(f)使用DPI (5μ米)或Go6976 (, 1μ米)与肿瘤坏死因子- 1 h然后孵化α60分钟。膜(我)和胞质(CE)分数准备并使用一个反受到免疫印迹 抗体。值均值±扫描电镜样本4 RA患者3独立的实验。在(a)和(e), ; 与车辆。(b)、(c) (d)和(f), ; 与肿瘤坏死因子-α一个人。
3.4。p38 MAPK和JNK1/2-Dependent ROS生成参与TNF -α介导cPLA2表达式

检查是否参与肿瘤坏死因子- MAPKsα全身的生产和cPLA ROS2表情,MEK1/2的抑制剂U0126, p38 MAPK (SB202190)和JNK1/2 (SP600125)。如图4(一)肿瘤坏死因子-α之二cPLA2表达式是由预处理抑制SB202190和SP600125,但不是U0126。此外,我们发现SB202190和SP600125导致一个更有效的降低TNF -α全身cPLA2表达式。肿瘤坏死因子-α也大大刺激了第42页/ p44 MAPK, p38 MAPK, JNK1/2磷酸化,抑制的预处理与各自的抑制剂U0126, SB202190或SP600125期间观察(图4 (b))。进一步确保p38 MAPK的角色和JNK1/2 TNF -α全身cPLA2表达式,如图4 (c),转染核p38 MAPK或JNK1表达下调的表达各自的蛋白质和随后减毒TNF -α全身cPLA2表达式。此外,预处理与Go6976降低TNF -α刺激p38 MAPK或JNK1/2磷酸化(图4 (d))。然而,预处理与南汽没有影响p38 MAPK或JNK1/2磷酸化(图4 (e))。我们进一步研究了角色的p38 MAPK和JNK1/2 TNF -α刺激和ROS生成氮氧化物活动。如图4 (f)明显,预处理SB202190或SP600125废除TNF -α刺激和ROS生成氮氧化物活动。此外,肿瘤坏死因子-α刺激的易位 从胞质膜也减弱了SB202190或SP600125(图4 (g))。这些结果表明TNF -α刺激激活和ROS生成氮氧化物是介导通过p38 MAPK和/或JNK-1/2-stimulated膜易位 在RASFs。

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PKC的参与α端依赖p38 MAPK和JNK1/2 TNF -α介导ROS生成和cPLA2表达式。与U0126 (a)细胞进行预处理,SB202190,或SP600125,或组合治疗1 h,然后孵化TNF -α16 h。cPLA的表达2是由西方墨点法。(b)细胞被使用或没有U0126 SB202190或SP600125与肿瘤坏死因子- 1 h然后孵化α在指定的时间间隔。(c)细胞转染炒,p38,或与TNF - JNK1 siRNA然后孵化α16 h。p38的水平,JNK1 cPLA2是由西方墨点法。(d)细胞使用Go6976与肿瘤坏死因子- 1 h然后刺激α30分钟。的水平phospho-p38 MAPK和phospho-JNK1/2取决于西方墨点法。(e)细胞使用NAC 1 h,然后孵化TNF -α在指定的时间间隔。的水平phospho-p38 MAPK和phospho-JNK1/2取决于西方墨点法。(f)细胞使用SB202190 (1μ米)或SP600125 (1μ米)1 h TNF -暴露前α1 h(阴影酒吧)或2 h(开放酒吧)。(阴影酒吧)和ROS生成氮氧化物活动(打开酒吧)进行了分析。(g)细胞使用SB202190 (1μ米)或SP600125 (1μ米)1 h TNF -暴露前α1 h。膜(我)和胞质(CE)分数准备并使用一个反受到西方墨点法 抗体。所有分析样本4类风湿性关节炎患者。结果是代表三个独立的实验。值(a)、(c) (f)和(g)均值±SEM。 ; 与肿瘤坏死因子-α一个人。
3.5。肿瘤坏死因子-α全身cPLA2Upregulation通过ROS-Dependent NF -介导的κB信号

NF -κB是由氧化应激或细胞因子激活和炎症基因的表达是至关重要的11,29日,30.]。我们发现,肿瘤坏死因子-α之二cPLA2蛋白表达是由预处理helenalin(抑制剂的抑制NF -κ小干扰rna (B)或转染p65数字5(一个)和5 (b))。自NF -κB信号取决于激活IKK复杂(31日),我们检查是否PKCα,JNK1/2 p38 MAPK和ROS-dependent途径参与肿瘤坏死因子-α介导IKKα/β磷酸化。如图5 (c)肿瘤坏死因子-α刺激IKKα/βGo6976和p65磷酸化的抑制,但不是SB202190, SP600125, DPI, APO,或者南汽。这些反应是进一步证实了利用免疫荧光染色显示预处理helenalin或Go6976抑制TNF -α全身的NF -κB易位,而SB202190、SP600125或NAC对核易位NF -没有影响κB(图5 (d))。类似的结果从RASFs分离出核分数由免疫印迹(图5 (e)),这表明激活IKK复杂结果的磷酸化和p65核易位,独立于p38 MAPK, JNK1/2, ROS。我们进一步发现,预处理Go6976、SB202190 SP600125, DPI, APO,南汽或helenalin抑制TNF -α全身的NF -κ(图B)启动子活动5 (f))。此外,核NF -的招聘κB p65 cPLA dna结合活性2启动子探测到染色质免疫沉淀反应试验(芯片)与NF -是相一致的κ(图B荧光素酶记者活动5 (g)),这表明NF -κ参与cPLA B转录活动2通过激活PKC表达介导的α后,p38 MAPK和JNK1/2 RASFs ROS的生成。最后,我们表明,预处理与Go6976 SB202190, SP600125, DPI,南汽或helenalin减毒TNF -α全身cPLA2α信使rna表达和荧光素酶启动子活动(图5 (h))。此外,与这些抑制剂预处理还减毒TNF -α全身的铂族元素2合成(图5(我)),这表明PKCα端依赖激活p38 MAPK、JNK1/2氮氧化物/ ROS生成和NF -κB参与TNF -α全身cPLA2表达和铂族元素2在RASFs生产。

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图5
肿瘤坏死因子-α介导ROS-dependent激活NF -κB是TNF -所需α全身cPLA2表达式。(一)RASFs使用helenalin与肿瘤坏死因子- 1 h然后孵化α16 h。cPLA的表达2是由西方墨点法。(b)细胞转染与炒或p65 siRNA然后孵化与TNF -α16 h。p65和cPLA的水平2蛋白质免疫印迹测定。(c)细胞被使用或没有Go6976 (1μSB202190(1米)μSP600125(1米)μ米),或NAC(10毫米)暴露于TNF -前1 hα在指定的时间间隔。phospho-IKK的水平α/β和phospho-p65取决于西方墨点法。细胞用Go6976预处理(1μSB201290(1米)μSP600125(1米)μ米),南汽(10毫米),或helenalin (1μ米)与肿瘤坏死因子- 1 h然后孵化α30分钟。(d)细胞被固定,然后使用一个anti-p65抗体标记和FITC-conjugated二级抗体。(e)核提取物(NE)准备和接受使用表示抗体和核纤层蛋白免疫印迹作为内部控制。暂时(f)细胞转染和NF -κB-Luc报告基因,用Go6976预处理、SB201290 SP600125, DPI, APO,南汽,或helenalin 1 h,然后孵化与TNF -α4 h。确定启动子活动。与Go6976 (g)细胞进行预处理,SB201290, SP600125, DPI或NAC与肿瘤坏死因子- 1 h和孵化α2 h。染色质免疫沉淀反应是使用一个anti-p65抗体。相关cPLA2启动子DNA扩增聚合酶链反应(PCR)。输入代表PCR产品染色质免疫沉淀反应前小球。(h)没有或cPLA细胞转染2luc报告基因,用Go6976预处理、SB201290 SP600125, DPI, APO,南汽,或helenalin 1 h,然后孵化与TNF -α6 h。cPLA的mRNA水平2(打开酒吧)和cPLA2luc启动子(阴影酒吧)测量。(我)铂族元素2水平使用铂族元素在媒体上进行了分析2EIA工具包。所有分析样本4类风湿性关节炎患者。结果是代表三个独立的实验。值在(a)、(b)、(e), (f)和(g)均值±SEM。 ; 与肿瘤坏死因子-α一个人。
3.6。监管cPLA2表达在肿瘤坏死因子-α治疗小鼠

进一步证实了我们在体外结果,我们测试了CORM-2在cPLA的表达的影响2和HO-1踝关节的老鼠与TNF -挑战α在活的有机体内。如图6(一)——(D),滑膜层TNF -α治疗踝关节cPLA强烈表达2降低了预处理与Go6976,南汽或helenalin(图6(一)- (G), J,米)。免疫组织化学染色(图的定量数据6 (b))表明TNF -α全身cPLA2表达发生两在体外和在活的有机体内,这是通过PKC介导的α端依赖氮氧化物激活/ ROS生成和NF -κB激活。

(一)
(一)
(b)
(b)
图6
监管cPLA2表达在肿瘤坏死因子-α治疗的老鼠。cPLA (a)免疫组织化学染色2波形蛋白和苏木精伊红染色(圆))在串行部分的踝关节接受pbs老鼠(虚假的;(一)- (C)), TNF -α又老鼠(TNF -α;(D) - (F)),(去/ TNF - Go6976-pretreated老鼠α;(G) - (I)),(南汽/ TNF - NAC-pretreated老鼠α;(J) - (L)), (HLN / TNF - helenalin-pretreated老鼠α;(M) - (O))所示。显微观察显示,脚踝关节的滑膜,波形蛋白和cPLA滑膜成纤维细胞重叠2表达式。箭头表示阳性染色。(b)的图解表示cPLA的定量数据2阳性细胞在小鼠的关节关节注射指定的抑制剂。结果3每个实验组小鼠的代表。在(b),值均值±SEM。 ,而细胞暴露于TNF -α一个人。
3.7。抑制效果的CO-RM2 ROS生成和NF -的活性κ肿瘤坏死因子- B诱导α在RASFs

我们已经表明,CO-RM2抑制TNF -α全身cPLA2通过在RASFs HO-1感应(图表达1)。的upregulation cPLA2表达取决于激活NF -κB,我们下一个评估是否CO-RM2干扰这些过程。染色质免疫沉淀反应是使用一个anti-p65抗体,cPLA2启动子区域被PCR扩增。如图7(一)肿瘤坏死因子-α全身p65 cPLA绑定2启动子是由预处理抑制CO-RM2,但不是iCO-RM2。此外,TNF -α增加了NF -κB子活动由预处理与减毒CO-RM2(图7 (b))。经典的NF -κ我被激活κBα发生退化,随后IKKα/β磷酸化。调查是否抑制NF -κB启动子活性是由于IKK的抑制α/β和p65磷酸化,如图7 (c)和7 (d)肿瘤坏死因子-α刺激IKKα/β和p65磷酸化被CO-RM2但不是iCO-RM2减毒,期间观察。此外,我们表明,TNF -α刺激产生的ROS NF -负责κB转录活动由预处理抑制CORM-2(图7 (e))。另一方面,对肿瘤坏死因子- CORM-2没有影响α全身的磷酸化p38 MAPK和JNK1/2 RASFs(图7 (f))。这些数据表明,由CO-RM2 HO-1感应变弱TNF -α全身cPLA2表达式通过抑制ROS和NF -介导的κb来证实这些结果在活的有机体内研究中,老鼠关节内的管理与CO-RM2 16 h和随后TNF -α24 h。图像关节关节的免疫组织化学染色显示,cPLA的数量2细胞表达明显高于TNF -α治疗小鼠比接受pbs的老鼠(图7 (g)- (A、F))。政府与CO-RM2 TNF -α治疗导致cPLA下降2表情的关节关节滑膜层老鼠(图7 (g)- (F, K))。cPLA的水平2表达式归一化波形蛋白在条形图(图进行了总结7 (g)较低的面板)。这些结果表明,CO-RM2变弱TNF -α全身cPLA2表达小鼠的关节关节。

(一)
(一)
(b)
(b)
(c)
(c)
(d)
(d)
(e)
(e)
(f)
(f)
(g)
(g)
图7
CORM-2对肿瘤坏死因子的影响α全身的NF -κB激活和cPLA2表达式。(一)细胞使用CORM-2或iCORM-2 16 h与TNF -然后孵化α2 h。染色质免疫沉淀反应(芯片)进行了分析使用一个anti-p65抗体。(b)和NF -细胞转染κB-luc报告基因,有或没有预处理CORM-2 16 h,然后孵化TNF -α4 h。NF -κB确定启动子活动。((c)、(d)和(f))细胞被使用或没有CORM-2 iCORM-2 16 h,然后处理TNF -α在指定的时间间隔。phospho-IKK phospho-p65的水平α/β、phospho-JNK1/2 phospho-p38 MAPK和HO-1取决于西方墨点法。(e)细胞被使用或没有CORM-2 16 h与TNF -然后孵化α为90分钟。细胞被添加(5μ米)她和图像获得确定ROS生成使用荧光显微镜。所有分析样本4类风湿性关节炎患者。(f)免疫组织化学染色,HO-1 cPLA2或波形蛋白和苏木精和伊红染色(圆))串行部分的踝关节小鼠注射磷酸盐(假的)((一)——(E)),小鼠注射TNF -α((F) - (J)),和老鼠注射CORM-2 16 h TNF -紧随其后α24 h ((K) - (O))进行。箭头表示阳性染色。结果3每个实验组小鼠的代表。结果是代表三个独立的实验。(a)、(b) (c)和(g),值均值±SEM。 ; 与肿瘤坏死因子-α一个人。

4所示。讨论

炎症和氧化应激RA的发病机制中起着关键的作用。cPLA2可能代表一个致病性类花生酸的生成与炎症分子的生产发展的关节炎(5]。CO-RM执行抗炎作用已被证明在不同的细胞类型(11,16,32]。因此,在这项研究中,我们试图调查CORM-2 TNF -的保护机制α挑战RASFs和ICR小鼠。在这里,我们表明,TNF -α全身cPLA2表达式是通过一个复杂的监管TNFR1 / PKCα引发p38 MAPK的激活和JNK1/2-dependent氮氧化物/ ROS生成,导致激活NF -κ在RASFs B。此外,我们发现CORM-2阻碍p65招聘cPLA的启动子2通过IKK的衰减α/βp65磷酸化和活性氧的生产,导致肿瘤坏死因子的抑制α全身cPLA2表达式(图8)。


图8
TNF CORM-2——的影响α全身cPLA2表达式。肿瘤坏死因子-α刺激NF -κB通过TNFR1 / PKC激活α/ IKKα/β、和p38 MAPK JNK-1/2-dependent NOX / ROS途径导致cPLA2在RASFs表达式。的差别,对这些基因的肿瘤坏死因子-α全身cPLA2表达式由CORM-2减少NF -介导的κB转录活性和减少代氮氧化物/ ROS。

滑膜成纤维细胞已被证明古典PKC表达αDAG和Ca2 +依赖,PKCδ,不需要DAG或Ca2 +(33]。PKCδ同事与TNFR1复杂的肿瘤坏死因子刺激后(34],PKCs富含脂质筏参与TNFR1复杂所在(35]。在RASFs,我们证实TNF -α诱导cPLA2通过PKC表达α/β信号。肿瘤坏死因子-α可以直接刺激PKCα和PKCβ二世易位。我们进一步研究了物理TNFR1协会和PKCα肿瘤坏死因子-α全身cPLA2表达式。虽然细节蛋白质相互作用TNFR1和PKCα是不知道,我们的结果是第一次显示角色TNFR1 / PKC吗α复杂的地层在TNF -α全身cPLA2在RASFs表达式。

肿瘤坏死因子-α诱导表达的基因间接通过短暂的ROS中介机构包括H2O2和超氧化物阴离子11,36]。氧化氮酶的生物学功能可能导致活性氧的生产(37]。激活氮氧化物是multimeric至少三个胞质亚基组成的蛋白质复合体 , , 。的 调节亚基中扮演着一个关键的角色在急性氮氧化物的激活;的磷酸化 被认为是缓解抑制细胞内的交互和允许绑定的吗 来 ,从而增加氧化酶激活(11,37]。在这里,我们证实肿瘤坏死因子-α诱导cPLA2通过一个表达式 / NOX-dependent ROS RASFs通路。

PKC亚型,主要是PKCα和β二世,都被定性为一个重要的催化剂氧化氮(27,38]。它也被发现,PKCα,但不是PKCβ,氮氧化物需要激活39]。然而,我们观察到抑制PKCα/β显著降低TNF -α在RASFs介导的激活和ROS生成氮氧化物。因此,我们建议,在RASFs, PKCα/β在调解扮演关键角色ROS-dependent cPLA2表达式。此外,先前的研究表明一个重要的角色ROS的TNF-induced MAPKs激活(40]。它已经表明,活性氧可以诱发或调解这些MAPKs通路的激活,表明活性氧参与激活MAPKs [11,41]。然而,在我们的实验条件下,我们发现JNK1/2和p38 MAPK参与TNF -α全身的氮氧化物RASFs激活和ROS生成。类似的研究打手心和富尔顿,他们表明MAPKs可以使磷酸化氮氧化物酶和诱导活性氧生成管理单元(42]。的调节亚基 可以调节NOX1的活动,2和3,已被证明是由Erk1/2磷酸化导致增加NOX2活动(42]。它也被报道,TNF -α全身的ROS介导长期积累MAPKs活化和细胞死亡在小鼠胚胎成纤维细胞(43]。此外,相信ROS-thioredoxin-ASK1系统作为分子开关转换物氧化还原信号激酶激活(44]。这个结论是基于观察TNF -α全身的ROS生成被发现只有在野生型小鼠成纤维细胞(WT)而不是物−−/细胞(45]。虽然传统的教条ROS MAPKs上游激活的地方,值得注意的是,最近的一项研究指出,一个积极的反馈回路之间MAPKs激活和活性氧的生产。在目前的研究中,我们还证实,肿瘤坏死因子-α刺激p38 MAPK JNK1/2磷酸化并没有减毒RASFs南汽。因此,我们建议p38 MAPK和JNK1/2上游介质可以调节 在RASFs易位和ROS生成。

NF -κB发挥其功能通过调节转录的基因编码许多immunoregulators,炎症介质和细胞凋亡抑制剂。几项研究也强调了IKK / NF -的关键作用κB通路感应和维护的炎症状态(46]。PKCα已被证明是参与TNFR-mediated NF -κB信号(24]。在最近的研究中,我们发现,肿瘤坏死因子-α诱导IKKα/β和NF -κB通过PKC激活α,但不是p38 MAPK在RASFs JNK1/2, ROS。自激活MAPKs参与TNF -α刺激cPLA2表达在转录水平14),我们还研究了NF -κB-dependent转录活动受MAPKs的磷酸化。在这里,我们发现,抑制p38 MAPK JNK1/2和氮氧化物/ ROS减毒NF -κB p65与cPLA互动的推广活动和招聘2子,这意味着p38 MAPK的激活和JNK1/2-dependent氮氧化物/ ROS生成所需的TNF -α全身的NF -κB转录活动。

HO-1是一种酶,催化血红素的降解,生成胆绿素、铁,和有限公司这些副产品涉及cytoprotective反应与氧化应激(11,15,16]。除了胆绿素的抗氧化活动,它已经表明,公司在巨噬细胞抑制LPS-induced炎性因子的表达,表明公司参与抗炎效应HO-1 (47]。最近的研究表明,公司是关键分子调停HO-1的保护作用。因此,CO-RMs现在被用作调查有用的药理工具有限公司的影响(48]。然而,CORM-2的影响和潜在机制在TNF -调制α全身cPLA2表达RASFs仍有待澄清。

CORM-2变弱的表达ICAM-1蛋白质通过干扰NF -κB激活肾组织(33]。它也抑制趋化因子il - 1引起的生产β在OA synoviocytes [16]。我们的数据清楚地表明,CORM-2 HO-1和展品的有力诱导物对肿瘤坏死因子-抑制的影响α全身cPLA2在RASFs表达式。的差别,对这些cPLA2信使rna /蛋白质含量CORM-2可以由减少NF -κB转录活动。以前的研究已经表明CORM-2减少ROS生产和NF -κB细胞因子激活诱导的OA synoviocytes [16]。实际上,我们还发现CORM-2抑制TNF -α监管p65和IKKα/β磷酸化和ROS生成。因此,我们建议对TNF - CORM-2有保护作用α——炎症反应。据报道,CORM-2起到了监管作用的磷酸化Erk1/2和JNK1/2 OA synoviocytes [16]。然而,RASFs CORM-2未能减弱p38 MAPK和JNK1/2磷酸化。因此,抗炎作用的CORM-2 RASFs发生,至少在某种程度上,通过其减弱氧化应激和NF -的能力κB转录活动对cPLA可能参与其抑制的影响2表达诱导肿瘤坏死因子-α。此外,我们确认CORM-2介导的抑制效应HO-1 TNF -α全身cPLA2表达式通过有限公司。我们的数据表明,iCORM-2不解放有限公司未能诱导HO-1表达和降低TNF -α全身cPLA2在RASFs表达式。相比之下,TNF -α全身cPLA2表情略增强HO-1击倒。

我们发现CORM-2减毒cPLA2但不是cox - 2(数据未显示)表达式通过抑制NF -介导的κB激活。与他人一致,CORM-2减少伊诺表达式而不是264.7 LPS-induced原始细胞cox - 2 (48]。相反,不在et al。32)记录CORM-2能够表达下调cox - 2表达和铂族元素2通过抑制NF -生产κ在il - 1 B激活β刺激骨关节炎软骨细胞,而调制的cox - 2 mRNA表达并不重要。同样地,我们发现CORM-2单独增加cox - 2 mRNA表达在16 h(数据未显示)。在这项研究中,CORM-2显著减毒TNF -α全身cPLA2表达式而不是cox - 2表达和铂族元素2生产。在cytokines-induced CORM-2 cox - 2表达的影响和铂族元素2生产仍然是有争议的,这些影响在不同细胞类型可能是由于不同的实验条件和细胞类型。

5。结论

总之,如图8肿瘤坏死因子-α诱导NF -κB通过TNFR1 / PKC激活α/ IKKα/β和p38 MAPK JNK-1/2-dependent氮氧化物/ cPLA ROS途径2在RASFs表达式。我们揭示了TNFR1 / PKCα端依赖参与IKKα/β和氮/ ROS通路在易位和NF - dna结合蛋白的能力κB在肿瘤坏死因子-α挑战RASFs。此外,我们演示了第一次的差别,对这些cPLA2蛋白质/ mRNA CORM-2可以由减少NF -κB转录活动将依赖IKK的抑制α/β磷酸化导致核易位NF -衰减κb .这些结果阐明CORM-2的药理作用和分子机制可能导致小说RA的治疗策略的发展。

术语表

肿瘤坏死因子-α: 肿瘤坏死因子-α
cPLA2: 胞质磷脂酶一2
RASFs: 类风湿性关节炎滑膜成纤维细胞
TNFR1: 肿瘤坏死因子受体l
MAPKs: 增殖蛋白激酶
兵: Extracellular-regulated蛋白激酶
物: c-Jun-N-terminal激酶
核: 小干扰RNA
rt - pcr: 逆转录-聚合酶链反应
NF -κB: 核factor-kappa B。
ROS: 活性氧
氮: NADPH氧化酶
HO-1: 血红素加氧酶1
CORM-2: 一氧化碳释放molecule-2。

利益冲突

作者没有利益冲突披露。

确认

这项工作是由nsc101 - 2321 - b - 182 - 011, nsc101 - 2320 - b - 182 - 039 my3和nsc101 - 2314 - b - 182 - 182 - a - 112从美国国家科学委员会,台湾;从教育部EMRPD1D0231, EMRPD1D0241,台湾;,CMRPD1B0383 CMRPD1C0102和CMRPG3B1091长庚医疗研究基金会、台湾。