文摘

在胃肠道炎症Purinergic信号具有很强的可塑性。因此,选择性药物针对“purinome”可能有利于炎症胃肠疾病。的肠肌神经肌肉传播健康个体由腺苷作用于调整和控制兴奋性受体。在这里,我们调查了neuromodulatory腺苷在TNBS-inflamed纵向muscle-myenteric丛大鼠回肠。七天postinflammation回肠炎缺乏腺苷酸神经调节,这可能有助于加速肠胃。腺苷的损失神经调节的结果缺乏积累核苷的肠肌突触尽管增加ATP释放观察。差距ATP流出和腺苷赤字postinflammatory回肠炎是归因于前馈抑制ecto-5′核苷酸酶/ CD73高细胞外ATP和ADP。NTPDase2的再分配,而不是NTPDase3,从神经节细胞体内肠肌神经终端导致优惠从释放ATP ADP积累,从而导致长期抑制肌肉僵硬的ecto-5′核苷酸酶/ CD73和腺苷的延迟在发炎的神经肌肉突触形成。另一方面,还可能出现抑郁的内源性腺苷积累由于腺苷脱氨酶活动的增强。膜结合和可溶性形式的ecto-5′核苷酸酶/ CD73和腺苷脱氨酶被发现在发炎肌间神经丛。这些发现为炎症性肠道蠕动障碍提供新颖的治疗靶点。

1。介绍

肠神经系统(ENS)发生一系列适应性反应不同病理条件下(例如,炎症和/或缺血性侮辱)(1,2]。例如,肠神经元迅速改变他们的结构、功能、或化学表型为了维持肠道内稳态。即使炎症侮辱损害限制,其反响肠神经元可能长期导致肠道功能的显著变化,可观察到偏远地区的炎症。postinflammatory地位经常伴随着大量增加肠蠕动(3]。

胃肠道(GI)呼吸道的炎症导致显著的变化在嘌呤的释放导致后续适应性修改purinoceptors表达和/或函数(了4])。干扰purinergic调制的底层机制并不完全清楚,部分原因在于研究purinoceptors可能受到不同的核苷酸发布网站的存在,细胞表面的酶迅速分解细胞外核苷酸为核苷(5]。在健康个体,从刺激肠神经元ATP释放主要是6),但其释放nonneuronal细胞(如平滑肌纤维,卡哈尔间质细胞)也可能发生(7]。四个成员ecto-nucleoside三磷酸diphosphohydrolase (E-NTPDase)家庭,即NTPDase1, NTPDase2, NTPDase3, NTPDase8和两名ecto-nucleotide焦磷酸酶/磷酸二酯酶(E-NPP)家庭,NPP1和NPP3位于质膜和水解细胞外核苷酸(5,8,9]。独特的相对贡献ecto-enzymes purinergic调制的信号不仅取决于微分组织和细胞分布、表达调控和针对特定膜域还在衬底的偏好和可用性。

对于基质偏好,NTPDase1 (CD39或apyrase)直接脱去磷酸ATP AMP,以最小的ADP的积累。NTPDase2优惠核苷三磷酸酶(ATP酶)是一种高效hydrolises ADP 10到15次低于ATP,导致最小AMP积累(8]。NTPDase3 NTPDase8 NTPDase1之间功能性中间体和NTPDase2 [8]。因为他们参与生理过程,即凝血、血管炎症、免疫反应和某些类型的癌症,现在NTPDases视为潜在药物靶点[10]。至于NPP1 NPP3,他们释放核苷5′一磷酸从不同的核苷酸,但有趣的是,他们的磷酸化的产品(例如,AMP)结合npp与更高的亲和力比基质,从而抑制催化(9]。最后,AMP水解腺苷和无机磷酸盐ecto-5′核苷酸酶(CD73),这是集中在肠肌平滑肌细胞层(7]。有趣的是,ecto-5′核苷酸酶(CD73)可能被从细胞膜通过水解的GPI锚phosphatidylinositol-specific磷脂酶或蛋白水解作用,同时保留其催化活性可溶形式(11]。

肠肌神经肌肉突触,ATP主要代谢成AMP,然后脱去磷酸腺苷;替代ATP转化为ADP是更相关的ATP浓度较高时12]。因此,梯度ATP及其分解产物(ADP和腺苷)可能提供微调控制肠道的蠕动电动机性能在压力情况下,如持续的神经活动,缺血、炎症,当细胞外ATP达到高水平(见[13,14])。ATP是暂时性的促进乙酰胆碱(ACh)释放nonstimulated神经终端通过prejunctional P2X受体(可能P2X2)。直接水解ATP的AMP和随后形成腺苷激活抑制性₁受体在平滑肌纤维(15)和神经节神经元细胞体的肠肌(16),downmodulates释放兴奋性神经递质,如P物质(17)和乙酰胆碱(18]。除了抑制的特点是₁被赋予prejunctional受体,肠肌神经终端受体介导的便利化ACh释放(16,18,19]。

之前我们小组的发现证明了ectonucleotidase通路部分只占总间隙腺苷浓度在肌间神经丛19]。腺苷释放出神经或nonneuronal细胞似乎是内源性腺苷的主要来源在肠神经系统18]。这个版本是试图通过核苷转运蛋白是由易化扩散,可以由内源信号分子,如ACh通过毒蕈碱的M₃受体(16,19]。另一方面,我们证明了细胞外腺苷脱氨基作用的腺苷脱氨酶(ADA)代表最有效的机制调节突触肠肌腺苷水平plexus-longitudinal肌肉(LM-MP)回肠的健康的动物18,19]。艾达是一个无处不在的嘌呤代谢酶定位在细胞表面(ecto-ADA) [20.]。在从细胞膜蛋白水解乳沟,可溶性形式的ADA (exo-ADA)保留其催化活性,可以发现在间质液体21]。我们检测到一个相对较高的ADA活性(~ 0.6 U /毫升)刺激后在superfusates收集LM-MP准备,这是符合“ADA分泌”的假设可能限制内源性腺苷行动释放/生产基地附近的突触地区(19]。ADA分泌增加的各种疾病,并可能起源于单核细胞/巨噬细胞谱系,因此反映了细胞免疫系统的参与。德曼和他的同事报道,慢性肠道炎症肠收缩活动增强,部分是因为减损purinergic调制的胆碱能神经活动(14]。

因为,腺嘌呤核苷酸和核苷(ADA)可能释放激活炎症细胞(22),以及从邻近神经元和nonneuronal肠细胞(23,24),有一个增加的兴趣neuromodulatory施加影响腺苷在炎症性侮辱。的治疗潜力adenosine-related化合物控制肠道蠕动和炎症(14,25)促使我们研究腺苷酸形成的动力学/失活周期为了理解整个核苷的体内平衡作用在postinflammatory肠应激性回肠炎引起的管腔内的滴剂TNBS的老鼠。

2。材料和方法

2.1。动物

老鼠的(纯种,~ 200 g)(查尔斯河,巴塞罗那,西班牙)保持在一个恒定的温度(21°)和普通光- (06.30 - -19.30 h)黑色(19.30 - -06.30 h)周期,提供食物和水)和普通光——黑暗(06.30 - -19.30 h) (19.30 - -06.30 h)周期,提供食物和水随意。所有研究涉及动物实验报告同意到指导方针。动物处理和实验按照指导方针由实验动物保健和使用委员会资源(美国国家研究委员会)和之后的欧洲共同体委员会指令(86/609 / EEC)。

2.2。TNBS-Induced肠道炎症模型

肠道炎症的滴剂是由2,4,6-trinitrobenzenesulfonic酸(TNBS)大鼠回肠的腔。禁食一段4 - 8小时后提供免费饮用水,老鼠接受麻醉下剖腹手术中位数的协会medetomidine(10毫克/公斤)和氯胺酮(75毫克/公斤)皮下注射。最后的检索过程动物atipamezole(10毫克/公斤)。末端回肠循环是轻轻的,TNBS(40毫米)是通过肠道壁注入回肠的腔,10厘米近端ileocolonic结。控制收到1毫升0.9%生理盐水。六十分钟的手术后,老鼠被允许吃的和喝的随意。手术后,疼痛控制盐酸曲马多(10毫克/公斤)。有控制时间的体重损失和恢复TNBS注入后,老鼠重TNBS之前手术后和日常管理。动物肠道炎症(TNBS)是暂时性的减肥手术后三到四天之后,恢复体重。手术后7天,动物牺牲后通宵禁食时期。

2.3。组织学结果和胃肠蠕动

的postinflammatory阶段TNBS-induced回肠炎特征在haematoxylin-eosin彩色部分使用Pontell和中国标准,在正常组织架构的损失,上皮损伤,炎症细胞的浸润3,26- - - - - -28]。评估胃肠道(GI)能动性在活的有机体内的口服含有亚甲蓝染料填喂法。染料的进展在胃肠道评估30分钟后,在控制和TNBS-injected动物:小肠的总长度是用于规范化数据。

2.4。(³H]乙酰胆碱释放实验

部分大鼠回肠不包括终端五厘米。肌间神经丛的纵行肌条连接底层的圆形肌肉分开根据佩顿和Vizi[方法29日]。这种制备高纯度在胆碱能神经元,主要是兴奋性神经元投射到纵肌(25%),从内在的初级传入纤维接收输入(26%)和从上行和下行通路(17%)30.]。

标签使用的程序准备和测量诱发(³H]乙酰胆碱([³H ach)释放以前描述(12,16,18,19),使用小的修改。LM-MP条安装在3毫升容量垂直灌注室加热在37°C。30分钟后平衡时期,肠肌神经元标记与1 40分钟μ米(³2.5 H)胆碱(具体活动μCi nmol⁻¹电场刺激下(1 Hz-frequency 1毫秒脉冲宽度)。加载后,冲刷Tyrode的解决方案包含hemicholinium-3 (10μ米),防止胆碱吸收。在60分钟时间的冲刷,浴样品(3毫升)每3分钟自动收集使用馏分收集器(Gilson、FC203B、法国)。氚含量的样品被液体闪烁测量光谱法(%计算效率:%)。

测试药物增加了15分钟年代₂。诱发(之间的比例的变化³H]乙酰胆碱释放这两个刺激时期(年代₂/年代₁)相对于观察控制情况(没有测试药物)被视作衡量测试药物的效果。没有药物改变明显()基底氚流出。

2.5。细胞外分解代谢的动力学实验嘌呤和高效液相色谱分析

动力学实验的细胞外腺嘌呤核苷酸分解代谢和腺苷,条的附加纵向肌肉的肌间神经丛(LM-MP)是安装在一个2毫升器官浴。所有的实验都在37°C。准备与加油过冷(95%啊₂和5%的公司₂)Tyrode的解决方案包含(毫米):137年氯化钠,氯化钾2.7,CaCl₂1.8,MgCl₂1,不₂阿宝₄0.4,NaHCO₃11.9,11.2和葡萄糖。30分钟后平衡期,准备孵化与Tyrode 45分钟的解决方案来消除内源性干扰化合物。冲刷时间的10分钟后,准备与30被孵化μM ATP、ADP、AMP或腺苷(零时间)。75年的样品μL收集器官浴在不同时间45分钟的高效液相色谱法与紫外检测()的变异分析衬底消失和产品形成([12,18,19];参见[31日])。底物的浓度和产品策划作为时间的函数(曲线进展)。在一些实验中,我们测量的5′核苷酸酶和腺苷脱氨酶活动后的流体留存在浴缸里移除LM-MP准备。我们遵循了类似的实验协议,用于研究细胞外的腺嘌呤核苷酸分解代谢的动力学和腺苷的准备。

2.6。释放ATP和腺嘌呤核苷(腺苷加肌苷)

实验使用一个自动灌注系统对于示例收集给定的时间段,因此改善的功效高效液相色谱(二极管阵列检测)和生物荧光分析。30分钟后平衡期,准备孵化为1.8毫升加油Tyrode的解决方案,自动改变每15分钟的清空和邻桌的器官浴使用的解决方案。准备的电刺激一次,15分钟后开始样品收集(零),使用3000 1 ms的方波脉冲持续时间交货5赫兹的频率。在这些实验中,只有在刺激之前收集的样本应用程序和两个样品收集保留刺激后进行分析。浴整除(50 - 250μL)在液态氮冷冻后立即收集,储存在−20°C(酶稳定至少4周),1周内和分析收集通过高效液相色谱二极管阵列检测(芬尼根说热费希尔科学系统LC /他是爸爸,配备一个Accela泵耦合Accela Autosample,二极管阵列检测器和一个运行X-Calibur Accela PDA软件色谱经理)。色谱分离是通过海泼斯尔合金金C18柱(5μ米,2.1毫米×150毫米)配备了警卫(5列μ米,2.1毫米×1毫米)使用一个洗脱梯度组成的醋酸铵(5毫米,pH值6调整与乙酸)和甲醇。在过程流量设定在200年μL / min和列温度维持在20°C。autosampler设置在4°C和50μL标准或样品溶液注入,一式两份,每一个高效液相色谱分析。为了获得色谱和定量分析与最大感性、二极管阵列检测波长为腺苷在259 nm和248 nm肌苷。并行,ATP内容相同的样品评估luciferin-luciferase ATP生物发光分析工具包HS II(罗氏应用科学,印第安纳波利斯,印第安纳州)(见例如,(31日,32])。发光决心使用multidetection标(协同HT、BioTek仪器)。Stimulation-evoked释放腺嘌呤核苷酸和核苷被减去计算基底释放,以刺激之前收集到的样本,从腺嘌呤核苷酸和核苷的总释放后刺激应用程序。

2.7。免疫荧光染色法和共焦显微镜观察

LM-MP片段分离的大鼠回肠如前所述。LM-MP片段被延伸到各个方向,固定到培养皿Sylgard涂层。组织,然后,被固定在PLP解决方案(多聚甲醛2%,赖氨酸0.075 M,磷酸钠0.037米,高碘酸钠0.01米)16 h在4°C。固定后,准备洗了三次10分钟每使用0.1磷酸盐缓冲剂。最后洗脱期、组织中cryoprotected 16 h解决方案包含无水甘油20%,磷酸缓冲0.1在4°C,然后储存在−20°C进行进一步处理。一旦解冻,组织碎片和tamponated磷酸盐水洗(PBS)和孵化的缓冲区阻塞缓冲区,组成10%胎牛血清,1%牛血清白蛋白在PBS triton x - 100 0.3%, 2 h;冲刷发展得益于不断搅拌的样品。阻塞和透化作用后,样品被孵化与选定主要抗体(见表1)稀释孵化缓冲区(5%胎牛血清,1%血清白蛋白,特里同x在PBS - 100 0.3%),在4°C, 48 h。双免疫染色,抗体结合之前应用程序组织样本。冲刷后主要抗体与PBS补充triton X 0.3%(3周期10分钟),组织样本和特有的二次孵化抗体在黑暗中了两个小时,在室温下。最后,组织样本被安装在光学质量玻璃幻灯片使用VectaShield安装媒体(VectorLabs)和储存在4°C。用激光扫描共焦显微镜进行观察与分析(奥林巴斯FluoView FV1000,东京,日本)。

2.8。抗体生产

在这项研究中使用的所有主要抗体之前进行验证(33- - - - - -37]:兔子rN1-6L鼠NTPDase 1,兔子rN2-6L老鼠NTPDase2,兔子rN3-1L老鼠NTPDase3,几内亚猪rN8-8C老鼠NTPDase8 rNU-9L兔子,兔子rNU-4L鼠ecto-5′核苷酸酶/ CD73。遗传免疫协议进行质粒pcDNA3.1)每个蛋白质编码,在新西兰抗体鼠NTPDase1兔子,老鼠NTPDase2,老鼠NTPDase3,老鼠ecto-5′核苷酸酶,哈特利豚鼠和大鼠NTPDase8抗体。委员会批准的所有程序都是加拿大拉瓦尔大学动物保护和动物福利委员会。

2.9。材料和解决方案

腺苷5′三磷酸腺苷(ATP), 5′腺苷二磷酸(ADP)、5′腺苷一磷酸(AMP)、腺苷、肌苷、次黄嘌呤;2、4、6-trinitrobenzenesulphonic酸(TNBS);氯化胆碱、多聚甲醛(小颗粒)、赖氨酸、高碘酸钠、无水甘油、胎牛血清(σ,圣路易斯,密苏里州,美国);血清白蛋白,特里同x - 100, metanol,磷酸二氢钾(KH₂阿宝₄)(默克公司,达姆施塔特,德国);双嘧达莫(德国勃林格殷格翰集团);1,3-dipropyl-8-cyclopentylxanthine (DPCPX)(美国研究生化药剂,纳蒂克,MA);mibefradil盐酸盐,河豚毒素(TTX)、4 - (2 - [7-amino-2 - {2-furyl} {1, 2, 4} triazolo {2, 3} {1, 3, 5} triazin-5-yl-amino]乙基)苯酚(ZM评选241385)(英国Tocris Cookson Inc .);[甲基-³H)氯化胆碱(乙醇溶液,80 Ci更易⁻¹)(英国Amersham);异食癖试剂(美国米尔福德港水域公司);ATP生物发光分析工具包HS II(罗氏应用科学,印第安纳波利斯,印第安纳州);medetomidine盐酸盐(Domitor,辉瑞动物保健);atipamezole盐酸盐(Antisedan、猎户座,埃斯波,芬兰);盐酸氯胺酮(Imalgene,梅里亚,法国里昂);氯化钠0.9%,盐酸曲马多(Labesfal, Besteiros圣地亚哥,葡萄牙)。

所有的药物都准备在蒸馏水。股票的解决方案都是存储为冷冻整除−20°C。稀释这些股票的解决方案是日常和适当的溶剂进行控制。没有统计上显著的差异控制实验,在没有或溶剂的存在的最大使用浓度(0.5% v / v),观察。灌注溶液的pH值没有改变的最大浓度的药物应用于制剂。

2.10。报告的数据和统计分析

值表示为均值±SEM,指示用于一组特定的动物数量的实验。统计分析的数据进行了使用成对的或未配对的学生的t以及或单向方差分析(方差分析)Dunnett紧随其后的修改t以及。代表显著差异。

3所示。结果

3.1。Postinflammatory回肠炎导致增加肠胃的老鼠

回肠的组织学部分TNBS-injected老鼠特征使用Pontell等提出的标准。3和中国26)(见部分2)。TNBS治疗后一周我们观察到的增殖再生粘膜的完整性。Postinflammatory浸润为主的嗜酸性粒细胞、淋巴细胞和巨噬细胞几乎没有见过但现在扩展到黏膜下层时,肠丛,肌肉层。那时,总TNBS-treated大鼠回肠壁厚增加是由于粘膜和肌肉层的厚度增加。胃肠蠕动是评估之前牺牲的动物。这样做是通过测量亚甲蓝染料的进展填喂法在30分钟。图1表明,亚甲蓝染料发展显著()快TNBS-injected动物比控制动物,表明胃肠道推进增加postinflammatory回肠炎。尽管TNBS-ileitis老鼠缺乏典型的慢性阶段,postinflammatory阶段特点是增加活性(见例如。38])。

3.2。腺苷的神经调节受损Postinflammation回肠炎

先前的报道表明,胆碱能神经的purinergic控制活动可能在慢性肠道炎症明显受损,在结肠的兔子,因为豚鼠39,40老鼠,回肠(14]。尽管差异机制用于生产肠道炎症在这些群体中,都是一致的指示需要更多的研究,以探讨底层purinergic神经调节通路负责不安。因此,我们集中我们的注意力在网上主音内源性腺苷在电诱发(³H]乙酰胆碱释放炎症肠肌运动神经元七天后大鼠回肠的侮辱。从健康的老鼠,准备一个₁受体拮抗剂,DPCPX (10 nM)的释放增加³H]哦,% ()(图2(一个))。相反,选择性腺苷的封锁受体ZM评选241385 (50 nM)显著减少诱发氚流出% ()。结果表明,内源性腺苷是一个双重角色唤起(³H]通过激活的抑制乙酰胆碱释放₁和兴奋受体大鼠回肠(cf。18,19])。然而,当进行了类似的实验LM-MP七天后回肠炎症的腺苷受体拮抗剂造成任何可测量的变化对诱发发射机释放(图2(一个))。这些结果表明,腺苷调制的胆碱能神经活动严重postinflammation回肠炎,正如前面建议使用myographic录音和电生理学方法(见上图)。

几个作者推测,在肠神经系统可以差别purinoceptors对这些发生在长时间接触嘌呤。这是预测由于嘌呤,ATP和腺苷等,可以释放激活炎症细胞(22)附近的肠肌层的神经元(24]。阐明这个论点,我们执行immunolocalization共焦显微镜的研究来评估表达式和定位的变化₁和腺苷酸受体,可能有助于解释缺乏内源性腺苷neuromodulatory强直性发炎回肠。免疫反应性对一个₁受体主要位于回肠肠肌层的神经元的细胞体的控制以及TNBS-injected老鼠(图2 (b))。纵向肌肉纤维染色积极与腺苷₁受体抗体(数据未显示)。然而,没有观察到显著差异(图之间的控制和发炎准备2 (b))。同样,受体免疫反应性,这是更明显的肠肌神经终端,控制和发炎组织之间也没有显著差异(图2 (b))。有趣的是,我们观察染色的受体在几个单核细胞(淋巴细胞)浸润神经肌肉水平,这可能负责的免疫抑制作用受体激活在实验回肠炎(41,42]。单核细胞浸润,其中包含艾滋病患者免疫细胞可能导致增加的mRNA的表达这种受体在慢性发炎的肠道组织(43]。虽然我们不能排除在这个阶段的差异引发的胞内信号通路激活腺苷受体亚型的两个高亲和力,₁和鼠LM-MP回肠,我们的数据表明,受体表达相当保守的回肠后七天炎症侮辱,显然,并不强调缺乏腺苷酸神经调节的强直性在这种情况下(见,例如,14,43,44])。

3.3。Postinflammatory回肠释放更多的ATP,这不是腺苷形成紧随其后

猜测,但尚未证实,中断ATP释放和/或故障是最可能的解释purinergic抑制的神经肌肉发炎地区传播的远端结肠40]。可能是炎症介质影响线粒体功能,因此ATP合成、溃烂地区慢性发炎的肠道。另一个可能性是ectonucleotidases的表达可能会有增加,负责分解ATP (12,45),已经证明在purinergic黏膜下血管的交感神经调节(45]。在这里,我们测量了细胞外ATP生物荧光()的积累与腺苷酸+肌苷含量(通过高效液相色谱二极管阵列检测)前后收集的样本中,电刺激LM-MP准备控制和TNBS-injected回肠的老鼠。图3表明,在健康动物,刺激LM-MP 5赫兹的频率(3000的1毫秒脉冲持续时间)的收益率增加了大量的ATP孵化液,这是紧随其后的是更高的细胞外腺嘌呤核苷的积累,通常由腺苷和肌苷。这种模式完全逆转大鼠回肠的炎症后七天。基底的ATP水平显著()增加(图3(一个)),而内源性腺苷的基线加上肌苷降低(图3 (b)),在收集到的液体从TNBS-treated LM-MP鼠回肠相比控制组织。虽然大量的ATP和腺嘌呤核苷从基线增加电刺激后LM-MP制剂在动物组织,释放ATP水平更高的价值在发炎的准备工作比在控制(图3(一个)),但相反的观察腺苷+肌苷的内容(图3 (b))。这些结果表明,与先前的假设相反,大量的ATP释放基底条件和电刺激后TNBS-treated回肠制剂显著高于控制组织,尽管不能丢弃在这个阶段,ATP积累减少也可能造成的细胞外的核苷酸(见下文)。尽管ATP积累增加,腺苷的内容+肌苷superfusates从TNBS-treated动物严重下降,这可能有助于解释缺乏内源性腺苷neuromodulatory性紧张postinflammatory回肠炎(图2;参见[43])。

在健康组织,但不是在回肠炎症侮辱后,stimulus-evoked腺苷释放部分依赖于神经元的活动。这是证明因为预处理与河豚毒素(TTX)的准备工作,应用于浓度(1μ米),基本上废除了诱发(³H]乙酰胆碱释放,减少约50%腺嘌呤核苷流出控制组织在TNBS-treated制剂(图几乎没有影响4)。这些发现表明,几乎一半的细胞外腺苷释放刺激LM-MP准备从健康老鼠来自TTX-sensitive神经元细胞,但这可能会严重影响的postinflammation阶段TNBS-ileitis由于神经功能障碍,证明了几个作者。条件下导致肠肌神经功能障碍,如慢性炎症,ATP释放可能从神经起源向其他细胞来源(例如,平滑肌纤维,神经胶质细胞,卡哈尔间质细胞,免疫细胞浸润)(见,例如,7])。事实上,诱发ATP释放TTX-resistant nonneuronal来源增加()高于基线fmol /毫克(在控制动物fmol /毫克()TNBS-treated准备。

3.4。少量的腺苷释放炎症回肠源自激活起搏器通过Equilibrative卡哈尔间质细胞的核苷转运蛋白

考虑到从nonneuronal细胞腺苷也可能释放出三方肠肌突触,我们测试是否stimulus-evoked平滑肌收缩和激活的起搏器卡哈尔间质细胞(可以)影响腺嘌呤核苷的流出控制和TNBS-injected回肠的老鼠。封锁的平滑肌收缩1 (l型)电压特异性钙通道抑制剂,硝苯地平(1 - 5μ米),并不影响腺嘌呤核苷的积累在浴前后样本收集电场刺激对LM-MP从健康的动物19]。然而,选择性的封锁3(衣架)钙通道主要坐落在可以mibefradil (3μ米)显著()抑郁流出两控制和腺嘌呤核苷(图TNBS-treated准备4)。结果表明,可以从刺激腺苷释放的主要来源LM-MP postinflammation回肠的阶段。数据还表明,可以配合肠肌层的神经元细胞外腺苷在准备健康的老鼠。

鉴于腺苷是存储和释放经典神经递质和以前我们的实验室结果表明ectonucleotidase通路部分只占总间隙腺苷浓度在肌间神经丛19),我们测试的参与equilibrative核苷转运蛋白,细胞外腺苷释放组织独立于控制和TNBS-injected老鼠。核苷运输抑制剂,双嘧达莫(0.5μ米),按比例下降,类似的大小与mibefradil获得(3μ米)腺嘌呤核苷的流出控制和发炎组织(图4)。因此,很可能检测到细胞外腺苷在回肠后炎症侮辱主要源自激活卡哈尔间质细胞通过equilibrative核苷转运蛋白。

另一个潜在的大鼠回肠内源性腺苷的来源可能是腺苷3′,5′环一磷酸(营)挤压激活细胞,这可能是转化为AMP然后通过ecto-phosphodiesterase腺苷ecto-5′核苷酸酶/ CD73,分别为(46]。尽管存在功能性细胞外cAMP-adenosine通路在大鼠回肠,我们无法发现任何可测量的大量的营地的高效液相色谱(二极管阵列检测)的分析样本用来量化腺嘌呤核苷,即使我们可以确定一个色谱峰对应于营地谱但保留时间高于使用30 -腺苷μ外部标准(数据未显示)。这些结果表明,在本实验条件下,cAMP-adenosine通路不大幅账户LM-MP内源性腺苷酸形成的大鼠回肠。

3.5。细胞外的腺嘌呤核苷酸分解代谢的动力学(ATP和ADP)没有不同的控制和Postinflammation大鼠回肠的准备工作

尽管发现回肠postinflammation阶段释放ATP比控制的准备工作,我们观察到细胞外腺苷含量减少收集的样本中,基底和刺激的条件下。因此,可能破坏ATP分解代谢为腺苷通过ecto-NTPDases可能发生的发炎LM-MP回肠。图5说明了时间的细胞外ATP和ADP的分解代谢LM-MP大鼠回肠的控制和TNBS-treated老鼠。没有显著差异()观察half-degradation ATP(30倍μ米)和ADP (30μ米)的控制和TNBS-treated准备,也就是说,两个腺嘌呤核苷酸的一半降解时间范围从6到7分钟独立的实验条件。细胞外ATP (30μ米)被代谢成ADP、AMP腺苷酸,肌苷,随着时间的推移和次黄嘌呤的含量增加。大量的AMP与ADP浴后各时间点检测ATP (30μ米)应用程序(图5(一个))。ADP (30μ米)分解代谢导致AMP,腺苷酸,肌苷,次黄嘌呤(图5 (b))。有趣的是,我们发现不同的AMP的积累及其降解产物、腺苷、之间的控制和postinflamed准备孵化与ATP (30μ米)或ADP (30μ米)。(橙色酒吧)细胞外腺苷酸含量增加,而腺苷(绿酒吧)减少,比例TNBS-treated孵化液的准备如下隔离控制老鼠相比孵化与ATP (30μ米)或ADP (30μ米)(图5)。增加AMP含量浴样本postinflammation回肠达到控制水平45分钟后开始孵化与ATP (30μ米)或ADP (30μ米),即当腺嘌呤核苷酸的浓度到达最低(图5)。

3.6。前馈抑制Ecto-5′核苷酸酶/ CD73腺嘌呤核苷酸腺苷控制形成Postinflammation回肠炎

数据图5清楚地表明,腺苷的差异形成的细胞外的腺嘌呤核苷酸分解代谢postinflammation回肠炎牵涉AMP脱磷酸作用由ecto-5′核苷酸酶,即利率限制酶腺苷酸形成的大鼠肌间神经丛(12]。令人惊讶的是,我们没有观察到明显的变化(AMP)一半降解时间(30μ(图)之间的控制和TNBS-treated准备6(一))。必须提到,如果任何区别是发炎的回肠积累相对较少的腺苷在细胞外环境相比,控制组织当AMP (30μ米)作为底物(图6(一))。总的来说,结果表明,腺苷正在迅速转化为肌苷ADA在细胞外空间的控制和TNBS-treated准备(见下文),考虑到化学计量的AMP转换成腺苷,肌苷和次黄嘌呤保持不变的排除核苷吸收系统的一个重大贡献(相比18])。

自ecto-5′核苷酸酶/ CD73可能从其裂解膜GPI锚定蛋白水解作用其催化活性的孵化液体,我们决定测试是否绑定的这种酶质膜在慢性炎症来解释在某种程度上影响的差异中发现腺苷腺嘌呤核苷酸的水解形成。为此,我们评估了5′核苷酸酶活动中的剩余液体浴后删除后准备每潜伏期(图6 (b))。在这些实验条件下,AMP(30的半衰期μ米)显著()降低TNBS-treated制剂(分钟,轻松慢于组织)与控制(分钟,几乎5次低于组织存在)。数据表明,postinflammation回肠炎引起的增加释放可溶性形式的5′核苷酸酶,有助于去磷酸化细胞外腺苷酸的腺苷在不改变全球酶活动的组织。尽管,功能的影响可能会从这个事实考虑ecto-5′核苷酸酶/ CD73集中在健康回肠的肠肌平滑肌细胞层(7),而游离酶可能产生的可溶性形式从细胞外腺苷AMP从最常见的网站在发炎回肠肠肌神经肌肉突触。

鉴于我们没有观察到任何显著差异之间的AMP分解代谢控制和TNBS-treated准备(见图6(一)),我们仍然发现增加ecto-5′核苷酸酶/ CD73纵向的免疫反应性神经肌肉层的炎症大鼠回肠(图6 (c);参见[43]),我们假设ecto-5′核苷酸酶/ CD73可以通过高前馈抑制细胞外ATP和ADP水平,结合酶的催化部位削弱腺苷形成AMP在发炎的准备工作(图3;参见[47])。被量化评估的ecto-5′核苷酸酶活动比率(核苷):每分钟(总核苷酸),这是一个直接衡量的活动ecto-5′核苷酸酶,使用ATP (30μ米)或ADP (30μ米)为基质。图7(一)表明,这一比率随时间逐步增加对消费孵化ATP和ADP的媒体。的活动ecto-5′核苷酸酶/ CD73明显()受损的LM-MP回肠炎症侮辱后,尤其是当ADP (30μ米)是作为衬底。这些发现同意的数据图5,表明,腺苷形成延迟补偿AMP积累增加发炎回肠相比控制准备这是符合我们的假设,ATP和ADP前馈抑制ecto-5′核苷酸酶/ CD73 postinflammation回肠炎。

3.7。NTPDase2组织分布变化,NTPDase3, NTPDase8 Postinflammation回肠炎

相对大量的ATP和ADP附近ecto-5′核苷酸酶/ CD73,集中在肠肌平滑肌层((7];参见图6 (c)),是派拉蒙的大小来预测前馈抑制腺嘌呤核苷酸酶的释放。这可能是由表达式和colocalization NTPDases负责腺嘌呤核苷酸分解代谢的动力学控制以及发炎回肠。图8显示控制LM-MP准备针对NTPDase2仅限于神经节细胞的免疫反应性的身体和大影响(主要网络)的肌间神经丛(相比48])。这与本地化NTPDase3免疫反应性,这也是明显的肠肌的神经干和终端对应二级和三级神经元网络,分别是(49]。在这个时候,我们不能在肌内可以排除这种酶的存在。这种模式的变化postinflammation回肠。在TNBS-treated准备,NTPDase2免疫反应性也观察到在二级和三级神经元网络,这意味着从刺激肠神经元ATP公布的ADP的形成6)和平滑肌纤维(7)可能有助于延长前馈抑制肌肉僵硬的ecto-5′核苷酸酶/ CD73炎症后的肠肌神经肌肉突触的侮辱。显然没有发现显著差异的表达和定位NTPDase3 LM-MP红肿的大鼠回肠。关于NTPDase8,我们能够证明其在一些肠肌神经节的神经元细胞体,与较小的表达在神经肌肉层(图8)。NTPDase8阳性神经元细胞的表型特征的身体值得进一步调查。像NTPDase3一样,我们没有发现NTPDase8总值变化之间的免疫反应性控制和TNBS-treated动物。我们集中我们的注意力在这三种胞外酶,因为我们没有检测到免疫反应性对NTPDase1 LM-MP鼠回肠除了一些血管(图8)。

3.8。Postinflammation回肠炎是伴随着更高的腺苷脱氨酶(ADA)活动:膜结合的贡献(ecto-ADA)和可溶性(exo-ADA)形式的酶

腺苷酸浴的浓度(30μ米)收益率随时间逐渐减少,肌苷的形成和次黄嘌呤LM-MP鼠回肠(见[19])。ADO的细胞外分解代谢(30μ米)快(分钟,)在TNBS-treated控制制剂(分钟,)。细胞外腺苷失活率可以通过计算最佳欣赏腺苷脱氨酶(ADA)活性在目前的实验条件,这在图表示9(一个)。数据显示,炎症后回肠侮辱的LM-MP越来越多的艾达,我们证实了免疫荧光共焦显微镜(图9 (b))。ADA检测到免疫反应性神经水平上,以及在神经肌肉层可能与平滑肌纤维。在TNBS-treated准备,ADA染色也是单核细胞中观察到,大多数可能T淋巴细胞和巨噬细胞浸润,肌间神经丛在神经节级别(50- - - - - -52]。同样,Antonioli和他的同事们(53]证明了免疫印迹分析提高ADA的表达层面的结肠发炎组织。

像ecto-5′核苷酸酶/ CD73,细胞外ADA可以找到连接到质膜(ecto-ADA) [20.),以及以可溶性形式从细胞膜蛋白水解分裂后(exo-ADA) [21]。两种形式保留催化活性。图9(一个)也表明,可溶性的活动形式的ADA保留在孵化液是最高的在第一次5分钟后把LM-MP准备从浴。可溶性ADA活性并不是伴随着乳酸脱氢酶活动的任何修改,从而表明其活动并不是由于受损的细胞(见例如,[19])。孵化的可溶性ADA活性进一步增加流体的接触与准备接受TNBS 45分钟。这意味着ADA分泌大量的回肠发炎,从而解释缺乏腺苷neuromodulatory性紧张。尽管肌苷可能积聚在postinflammation回肠炎的增加细胞外腺苷脱氨基作用(见图5和6),我们未能发现任何变化诱发(³H]乙酰胆碱释放,当肌苷用于控制和TNBS-treated准备孵化液的浓度高达1毫米(数据没有显示)。分解退化腺苷的可溶性ADA也可能导致损伤免疫调制的内源性腺苷(通过单核细胞上的受体结合,见图2 (b))和随之而来的炎症和组织损伤的恶化53]。

4所示。讨论和结论

肠可塑性包括范围广泛的结构和/或功能改变肠神经元,神经胶质细胞,和起搏器卡哈尔间质细胞,位于肌层之间的胃肠道(GI)。不同类型的病理生理条件下开车去不同的适应性反应。众所周知,肠神经元控制所有胃肠功能。他们能够迅速改变他们的结构,功能,维持肠道内稳态或化学编码(例如,在炎症性疾病)52]。尽管肠道适应性反应的异质性,无处不在的嘌呤核苷酸的参与,和核苷提供微调控制肠道的蠕动电动机性能在压力情况下,如持续的神经活动,缺血、炎症(综述(20.])。许多研究已经描述了purinergic功能监管机构的潜在作用在炎症和免疫44,54- - - - - -56]。最近的证据表明,腺苷酸激酶的封锁,导致内源性腺苷水平增加,会使炎症反应在实验性结肠炎57]。此外,Mabley et al。58]表明,肌苷分解产生的腺苷有效降低炎症反应的小鼠结肠炎模型。尽管如此,我们在这个研究表明,肌苷积累可能不足以解释purinergic neuromodulatory改变postinflammation回肠炎。和许多其他的发现,这些表明,腺苷可以促炎(通过调解₁或受体)和/或抗炎免疫抑制剂(主要是通过活动和一个₃受体)炎症性肠道疾病,这些疾病的潜在治疗(综述(44])。然而,尚不清楚到什么程度的免疫调节作用在炎症干扰嘌呤神经调节的肠神经系统14]。

控制嘌呤的细胞活性的激活依赖于两个家庭的膜结合purinoceptors, P1和P2,敏感腺苷和腺嘌呤和/或尿嘧啶核苷酸,分别。有趣的是,P1和P2 purinoceptors也存在免疫细胞和有证据表明,腺苷和ATP生成网站的炎症(看,审查59])。Purinoceptors激活的细胞外转换调整受腺嘌呤和尿嘧啶核苷酸释放导致其他生物活性产品的形成,也就是说,ADP / UDP和腺苷,通过一连串的膜结合ectonucleotidases [8,60]。因此,细胞ectonucleotidase酶的表达和拓扑,以及外在的因素影响他们的催化活性(如离子浓度、核苷酸绑定)创建渐变的腺嘌呤核苷酸及其分解产物,这可能歧视附近purinoceptor更有可能被激活。例如,ATP是暂时性的基底条件下促进乙酰胆碱从nonstimulated肠肌层的神经元通过prejuctional P2X受体(可能P2X2);然而,增加ATP的释放刺激神经元突触在肠肌ADP积累创造有利条件,通过P2Y发射机的差别导致对这些基因的释放₁受体(12]。战略操纵ectonucleotidases的活动已被建议作为一种新型治疗方法修改致病性purinergic信号级联(了61年])。

肌间神经丛,限制酶负责细胞外腺苷生成速率从发布腺嘌呤核苷酸ecto-5′核苷酸酶/ CD73 [12,18]。这种酶作用以一致的方式与腺苷失活途径,细胞吸收和腺苷脱氨酶(ADA),控制细胞外的核苷和水平,因此,硝唑P1受体的激活(19]。有趣的是,尽管少了很多从功能角度,探索酶最相关的控制细胞外环境中腺苷含量,同时ecto-5′核苷酸酶/ CD73和ADA,可能从他们的锚裂解质膜,同时保留其催化活性的可溶性形式(20.]。巧合与否,显著增加ecto-5′核苷酸酶/ CD73和ADA mRNA表达观察结肠发炎组织(62年]。脆弱的对接这些酶的质膜的上下文中更可能发生炎症反应,考虑到招聘的炎症细胞释放大量细胞因子,趋化因子和酶,这些蛋白水解活性。这些酶之一是glycosylphosphatidylinositol-specific磷脂酶,它在炎症过程中发挥作用,因为它可以水解GPI锚的几种膜蛋白及其水解产物调控的细胞因子表达在巨噬细胞63年]。可溶性的广泛分布形式的ecto-5′核苷酸酶/ CD73和ADA创造条件不平衡的批量生产和/或失活的腺苷酸从其原始位置,从而影响器官功能。同样,炎性浸润包括T淋巴细胞,它被赋予NTPDase1 / CD39和ecto-5′核苷酸酶/ CD73酶,另外可能导致积累腺苷干扰和不可预知的P1-receptor-mediated反应炎症组织。根据这些引人注目的假设,这项工作的目的是探讨腺嘌呤核苷酸的分解代谢动力学和腺苷酸积累的肌间神经丛回肠后炎症的侮辱。

这项研究证明的数据差距细胞外液中检测到大量的ATP释放TNBS-treated回肠准备和赤字的腺苷水平测量同一样品,在基线条件下和电刺激后。这个令人困惑的矛盾并没有被发现。相反,间接证据由其他作者假设中断了ATP释放可能是由于炎症介质引起的线粒体功能障碍(40,45),本研究证实。在postinflammation回肠炎,更高的ATP含量可以起源于浸润免疫和non-neuronal细胞,如神经胶质细胞,卡哈尔间质细胞和平滑肌收缩(见例如,[7];综述了在64年]),考虑到提出炎症性神经功能障碍。Hemichannels包含pannexins可能作为ATP释放管道non-neuronal细胞生理和病理刺激的反应。这些渠道能够形成信号复合物的purinergic P2X7受体,激活导致大量孔隙的形成,因此,进一步释放ATP (65年,66年]。这些作者提出了一个模型,高细胞外ATP水平长期激活神经元P2X7, pannexins,还存在。这P2X7和pannexins之间的关系与肠神经元的损失在炎症条件下(52,66年,67年]。此外,我们的数据添加一些信息来解释purinergic信号在肠道炎症的损伤检测到在其他报告14,39,40)已扩大在这项研究中,缺乏腺苷neuromodulatory控制乙酰胆碱释放postinflammation肌间神经丛。我们提供令人信服的证据,大多数腺苷起源于发炎的大鼠回肠肌间神经丛源自刑事法庭的激活释放的核苷等通过dipyridamole-sensitive equilibrative转运蛋白。这也同意之前我们小组的发现表明,腺苷释放ATP形成,部分通过ecto-nucleotidase级联,只占总间隙腺苷浓度在健康老鼠的肌间神经丛19]。

腺苷明显扰动产生的细胞外释放ATP的分解代谢可能是由于前馈抑制ecto-5′核苷酸酶/ CD73由于细胞外ATP水平高,特别是ADP,积累在炎症肠肌突触(cf。47])。ATP和ADP的竞争性抑制剂ecto-5′核苷酸酶/ CD73抑制常数较低的微摩尔的范围。这意味着他们可以绑定到这种酶的活性部位,像AMP,但他们不能水解11,68年];恢复ecto-5′核苷酸酶/ CD73活动发生一次细胞外ATP和ADP水平下降低于微摩尔的范围。再分配的NTPDase2神经节细胞的身体,这种酶在健康动物的优惠定位,对肠肌神经终端提供了最可能的解释出乎意料的ADP postinflammation神经肌肉突触的积累。这是可能的因为NTPDase2优惠核苷三磷酸酶水解ADP少10到15倍比ATP (8),我们发现没有变化的分布NTPDase3 NTPDase8出现在肌间神经丛。值得注意的是,没有证据表明NTPDase1表达检测大鼠肌间神经丛,除了几血管。因此,在postinflammation回肠炎肠肌的ATP水解为腺苷突触可能是暂时性的打断了前馈抑制ecto-5′核苷酸酶/ CD73,这使得从P1受体激活(腺苷)优惠P2受体激活(通过ATP和ADP)。这些数据与ATP水解的协议NTPDase2和ecto-5′核苷酸酶/ CD73鼠肝脏(69年]。事实上,根据与NTPDase亚型ecto-5′核苷酸酶/ CD73硝唑不同数量的生成腺苷(69年]。为了证明的功能解释这些发现的增加胃肠蠕动可能干扰复杂的划分是通过释放大量的可溶性形式的酶(11,20.]。然而,我们的研究结果完全同意其他作者暗示ecto-5′核苷酸酶/ CD73可能发挥重要作用的调制purinergic信号在肠道炎症(44,55]。

之前我们小组的发现表明,细胞外脱氨基作用,艾达是最有效的机制调节突触腺苷水平,因此,主音facilitatory激活受体在肠肌神经终端的健康大鼠(18]。除了ecto-ADA非常高水平的活动,一个低效的核苷双嘧达莫交通系统敏感也可能导致失活的细胞外腺苷。由于失活机制的有效性,内源性腺苷的行动可能会限制发布/生产地区肠肌胆碱能突触,而体内腺苷似乎激活优先extrajunctional抑制₁受体(16,18]。一个问题仍未得到回答关于主音内源性腺苷对低亲和力兴奋性的影响₃受体,虽然这种受体选择性受体激动剂已被证明有益影响炎症实验模型(53,70年]。串联本地化的腺苷₃(细胞体)沿着肠肌层的神经元(神经静脉曲张)受体解释了为什么一个₃受体的激活可能会阻止ZM评选241385 (50 nM),选择性和低亲和力受体拮抗剂₃受体(μ米)。这意味着内源性腺苷徒prejunctional优先在正常情况下使低亲和力的激活₃通过腺苷受体可能在postinflammatory阶段高TNBS-ileitis由于抑制/失活的核苷(本研究)。假定的激活₃受体通过ADA内生形成肌苷时也不能解释的损失neuromodulatory核苷的影响在postinflammation回肠炎。当我们不确定关于细胞外腺苷水平在两个特定的位置,两者兼而有之在活的有机体内和在体外模型表明,抑制之间的平衡₁和兴奋可能是重要的调节肠道蠕动。例如,德曼等人报道,慢性肠道炎症肠收缩活动增强,部分原因的胆碱能神经调节介导的丧失₁受体(14]。值得注意的是,人类post-ganglionic肠肌层的神经元co-express腺苷₁和受体,它表现出一个异构分布(71年]。因此,有一个相当大的兴趣在神经保护效应产生的腺苷炎症(缺血)侮辱,可想而知,腺苷堆积干扰可能导致肠时其病理条件。

除了提出中断ectonucleotidase级联的水平ecto-5′核苷酸酶/ CD73导致AMP积累和低腺苷的肌间神经丛发炎,形成我们的数据也表明,ADA活性显著增强postinflammation回肠炎从而导致减少细胞外腺苷水平,因此,主音P1受体的激活。ADA的酶腺苷酸的脱氨基作用肌苷。这种酶广泛的系统发育分布和其氨基酸序列高度保守,认为ADA是嘌呤代谢的关键酶。据报道,除了经典的细胞内形成,ADA绑定到T淋巴细胞的细胞表面,通过激活细胞标记CD26 [72年]。ADA神经终端的存在也被证明在许多大脑区域和假设ADA-containing终端可以释放腺苷酸或酶本身,这可能有助于调节purinergic神经传递(73年,74年]。大鼠肌间神经丛,我们首先描述ADA活性增加浴后样品收集组织刺激与间质积累腺苷及其代谢物(19]。这意味着大量的腺苷之后发现刺激的制备主要是低估的水平相比biophase核苷。分泌的ADA可能发生在几种疾病,即那些影响造血和免疫(75年]。据我们所知,这是第一个研究报告增加可溶性ADA的活性在慢性炎症大鼠回肠肌间神经丛。我们的研究结果揭示的机制抑制ADA可能减弱炎症实验结肠炎(76年]。

总之,数据表明postinflammation回肠炎抑制腺苷酸神经调节,这可能导致增加肠胃蠕动。腺苷酸神经调节障碍是最有可能由于缺乏积累核苷的肠肌突触尽管矛盾增加ATP释放。ATP流出之间的差异和缺乏腺苷的慢性发炎回肠可以归结于前馈抑制ecto-5′核苷酸酶/ CD73细胞外ATP和ADP水平高。NTPDase2再分配,有趣的是,但不是NTPDase3,从神经节细胞的身体到肠肌神经终端导致优惠ADP积累释放ATP,从而延长抑制肌肉僵硬的ecto-5′核苷酸酶/ CD73和推迟腺发炎神经肌肉突触的形成。另一方面,抑郁的内源性腺苷积累也可能出现由于ADA活动的增强。我们观察到显著增加可溶性的活动形式的ecto-5′核苷酸酶/ CD73和ADA TNBS-ileitis postinflammatory阶段,这可能会导致不平衡的批量生产和/或失活的腺苷从它的位置在本地组织从而影响器官功能。因此,我们的研究表明,药物抑制ADA,和/或使用AMP-derived高活性化合物能够选择性地激活P1受体硝唑与ecto-5′核苷酸酶/ CD73,代表有前途的治疗策略来改善运动性障碍和固有免疫反应性炎症性肠道疾病。

缩写

哦:	乙酰胆碱
艾达:	腺苷脱氨酶
ADO:	腺苷
ADP:	二磷酸腺苷
AMP:	腺苷酸
ATP:	三磷酸腺苷
中枢神经系统:	中枢神经系统
决策支持系统:	葡聚糖硫酸钠
E-NTPDase:	三磷酸Ectonucleoside diphosphohydrolase
E-NPP:	Ecto-nucleotide焦磷酸酶/磷酸二酯酶
EFS:	电场刺激
实体:	肠神经系统
GI:	胃肠
谷歌价格指数:	Glycosylphosphatidylinositol
高效液相色谱法:	高效液相色谱法
HX:	次黄嘌呤
炎症性肠病:	炎症性肠病
刑事法庭的:	卡哈尔间质细胞的
伊诺:	肌苷
LM-MP:	纵向muscle-myenteric丛
分钟:	分钟
PBS:	磷酸盐水缓冲
PLP:	Periodate-lysine-paraformaldehyde
TTX:	河豚毒素
TNBS:	2、4、6-trinitrobenzenesulfonic酸。

利益冲突

作者宣称没有利益冲突有关的出版。

确认

作者承认的有价值的合作教授Margarida Duarte-Araujo TNBS-induced肠道炎症大鼠模型的实现在我们的实验室。盲目的组织学特征的炎性浸润的回肠控制与TNBS-treated老鼠最初是由教授贾丝廷娜奥利维拉(Departamento de Ciencias Veterinarias, UTAD,维拉真实,葡萄牙)(数据没有显示)。作者也要感谢夫人玛利亚海伦娜科斯塔e Silva和技术援助Belmira席尔瓦。这项研究部分由FCT (FCT项目Pest-OE /分/ UI215/2011)与菲德尔的参与资金。Catia维埃拉和伊莎贝尔席尔瓦被FCT收到博士学位助学金(SFRH / BD / 79091/2011和SFRH / BD / 88855/2012,职责)。j·科洛收到加拿大卫生研究院研究的支持(CIHR;拖把- 102472),他也是一个高级奖学金的接受者溺爱de矫揉造作的du Quebec-Sante(FRQS)。