文摘
Secretoglobin (SCGB) 3 a2, cytokine-like分泌性蛋白质的分子量小,这可能发挥作用在肺部炎症,主要是表现在气道上皮细胞。为了理解SCGB3A2的生理作用,Scgb3a2−−/老鼠生成和特征。Scgb3a2−−/老鼠没有表现出任何明显的表型。在卵白蛋白(OVA)诱导气道过敏炎症模型,Scgb3a2−−/老鼠在混合背景显示减少OVA-induced气道炎症,而六次C57BL / 6 ncr backcrossed句Scgb3a2−−/老鼠显示略有恶化OVA-induced气道炎症与野生型相比,同窝出生的。这些结果表明,SCGB3A2的损失函数修饰基因影响(s)在混合遗传背景,表明SCGB3A2抗炎性质。结果进一步表明可能的重组体人SCGB3A2作为抗炎剂的使用。
1。介绍
Secretoglobin (SCGB) 3 a2属于SCGB cytokine-like分泌蛋白质的基因总科的小分子量(~ 10 kDa) [1- - - - - -3]。大多数SCGB成员发现高浓度的分泌物如肺癌、泪腺、唾液腺、前列腺癌、子宫,但是他们的生物功能在很大程度上是未知的(1]。在肺,SCGB3A2主要是气管上皮细胞的表达,支气管和细支气管。找到它的表达在胚胎的日益增长的提示支气管(E) 11.5天的小鼠妊娠(4),其水平达到最大的怀孕(5]。SCGB3A2扮演了一个角色在胚胎肺发展证明了体外胚胎肺器官SCGB3A2的存在和文化在活的有机体内管理SCGB3A2怀孕的雌性老鼠,接着检查早产幼崽(4]。此外,SCGB3A2展品抗炎和anti-fibrotic活动(6,7]。SCGB3A2也可以用作肺癌标记(8,9]。因此SCGB3A2似乎拥有多个活动。
SCGB3A2最初的抗炎作用提出了以下的观察:(1)Scgb3a2mRNA水平减少fungal-induced过敏炎症模型小鼠的肺部,这是几乎恢复了地塞米松治疗(6),(2)减少水平的肺Scgb3a2信使rna OVA-induced炎症模型中小鼠与促炎细胞因子水平的增加呈负相关,IL-5和IL-9支气管肺泡灌洗液(BALF) [10,11),(3)鼻内滴注法IL-5或IL-9天真的老鼠了Scgb3a2基因表达在肺10,11]。此外,当OVA-airway炎症模型小鼠经重组腺病毒表达SCGB3A2卵子挑战之前,OVA-induced气道炎症与气道过度抑制SCGB3A2 [6]。后者结果明确显示SCGB3A2有抗炎作用。
为了进一步获得洞察SCGB3A2的生理功能和抗炎活动,Scgb3a2−−/老鼠产生和特点和接受卵子气道炎症模型(6]。Scgb3a2−−/老鼠在混合遗传背景显示OVA-induced气道炎症的恶化。相比之下,六次C57BL / 6 ncr backcrossed句Scgb3a2−−/老鼠表现出稍微增加炎症相比各自的野生型的同胞。这些研究表明遗传背景的重要性,SCGB3A2肺保护作用作为抗炎剂。
2。材料和方法
2.1。一代的Scgb3a2−−/老鼠
一代的Scgb3a2−−/老鼠进行了使用同源重组的目标向量由recombineering,紧随其后的是胚胎干细胞(ES)细胞注入(图1(一))。的生产过程中Scgb3a2−−/老鼠,Scgb3a2 -有条件的老鼠的Scgb3a2 -液氧等位基因也被生成,不用于本研究;描述的细节将在别处。Recombineering进行描述(12]。总之,13 kbp包含老鼠的DNA片段Scgb3a2基因是subcloned PL253向量。第一个loxP介绍了网站的第一个内含子Scgb3a2基因。新霉素(Neo)盒两侧是两个FRT网站和一个loxP网站是插入的下游Scgb3a2使用PL451向量包含这个磁带基因。这些连续recombineering过程后,最终的目标向量是纯化和electroporated C57BL / 6 j x 129 / SvJae混合胚胎干细胞(13]。G418-resistant胚胎干细胞被南方印迹基因分型使用5′,3′,Neo调查。两个正确目标ES克隆注入从C57BL / 6 ncr小鼠胚泡了。南部印迹和PCR分析证实了后代的生殖系传播Scgb3a2有针对性的嵌合小鼠与野生型小鼠C57BL / 6 ncr交叉。EIIA——的老鼠了Cre转基因小鼠(FVB背景)删除loxP网站生成一个完整的淘汰赛等位基因(14),而β-actin-driven隔爆转基因小鼠用于移除Neo盒生产Scgb3a2-floxed等位基因(15]。检测基因敲除基因的PCR引物UG1KO-F: 5′atc CTC GGG棉酚亚美大陆煤层气有限公司TTC TG-3′和UG1KO-R: 5′cta AAA柠檬酸GGG GCC AGA CA-3′, 362 bp的产品。引物检测外显子2的Scgb3a2基因(野生型和液氧等位基因)UG1EX2-F: 5′acc GTC太极拳CTG TTG TTG AC-3′和UG1EX2-R: 5′cac GTA GCA亚美大陆煤层气有限公司GCT TCT CC-3′, 227 bp的产品。在这项研究中使用的老鼠被那些复杂的遗传背景和backcrossed C57BL / 6 ncr 6代,各自的野生型的同胞。老鼠在标准specific-pathogen-free条件下维护。
(一)
(b)
(c)
2.2。印迹分析
基因组DNA分离从尾巴活检和消化Spe我5′探针或太平洋标准时间我的3′调查。消化DNA片段是运行在0.4%琼脂糖凝胶在一夜之间转移到尼龙膜。32P-Labeled (PerkinElmer沃尔瑟姆,MA) DNA标记探针与准备准备珠子(-dCTP)(通用电气医疗集团生命科学,皮斯卡塔韦,新泽西)。信号检测使用斯特罗姆840(通用电气医疗集团生命科学)。
2.3。西方墨点法
肺是均质和细胞溶解在里帕裂解缓冲(圣克鲁斯生物技术、圣克鲁斯,CA)补充完整的蛋白酶抑制剂鸡尾酒(罗氏应用科学,印第安纳波利斯)。蛋白质样品分离SDS-polyacrylamide凝胶,转移到Immobilon-P膜(EMD微孔、Billerica MA) Tris-Glycine-Methanol传输缓冲区,和阻塞TBST脱脂奶粉5% (50 mM Tris-HCl, pH值7.4,150毫米氯化钠,和0.1% Tween-20) 1小时前一夜之间孵化主要抗体在4°C。的anti-mouse SCGB3A2抗体(兔子)曾描述(3]。anti-GAPDH抗体6 c5 (EMD微孔)被用作加载控制。随后,墨迹洗在TBST然后在室温1小时孵化HRP-linked二级抗体(细胞信号技术,波士顿,MA)。墨迹是洗TBST和可视化与西方SuperSignal硬脑膜延长时间的基质SCGB3A2和西方SuperSignal Pico化学发光底物为GAPDH(热费希尔科学,罗克福德,IL)。
2.4。动物模型
雌性老鼠(6周;每周4 - 8 /组)小鼠免疫与腹腔内注射的卵子(Sigma-Aldrich,圣路易斯,密苏里州;20μg在100年的总量μL盐水)用同等体积的氢氧化铝佐剂乳化(Imject明矾,热费希尔科学)天0,7和14。卵子在生理盐水稀释1% (w / v)挑战吸入暴露是由帕里LC +喷雾器和Vios压缩机(帕里呼吸设备,Inc .)作幌子,VA)使用派笼(布伦特里科学,Inc .,布伦特里,MA)在天21日22日和23日。OVA-injected和saline-challenged老鼠被用作控制。支气管肺泡灌洗(BAL),其次是肺组织的集合,进行了25天。Cytospin准备BAL流体通过Shandon离心机在玻片Cytofunnels(热费希尔科学)在1000 rpm 5分钟。细胞分化进行显微镜下超过200细胞染色和染色(Sigma-Aldrich)。所有动物实验进行了以下指南使用批准的美国国立卫生研究院和美国国家癌症研究所(NCI)动物保健和使用委员会。
2.5。组织病理学
肺膨胀了10%的缓冲福尔马林,嵌入在石蜡,切成5 -μ米的部分。部分是deparaffinized和苏木精和伊红染色())。肺部病变(嗜酸性粒细胞的数量、细支气管粘液和血管周围和peribronchiolar成套与炎症细胞)在盲目的时尚分级组织学0,没有损伤;1、最小损伤;2、温和;3、中等;4、严重。组织年级取决于肺部病变的程度与病变的严重程度。免疫组织化学染色SCGB3A2(抗体稀释1:10000)(3进行5 -μm石蜡包埋部分通过avidin-biotin-peroxidase复杂方法VECTASTAIN精英ABC工具包(向量实验室,伯林盖姆,CA)。免疫反应性的可视化是3,3′-diaminobenzidine tetrahydrochloride (Dako Carpinteria, CA)和苏木精复染色。
2.6。定量rt - pcr(存在)的分析
肺总rna分离使用试剂盒(生活技术,罗克维尔市,医学博士,美国)。益生元(dT)影射的互补reverse-transcribed从2.0μg总rna通过使用上标三世逆转录酶(生命技术)根据供应商的协议。实时rt - pcr分析使用ABI棱镜7900 ht序列检测系统(技术)。引物序列用于中存在如表所示1。Ppia(peptidylprolyl异构酶(还有))是用作SYBR绿色PCR,内部控制执行在一个管一式三份。结果表示为三个独立实验的平均值。
2.7。ELISA试验
小鼠il - 4、IL-5 IL-13水平由ELISA试剂盒研发系统(明尼阿波利斯,美国)根据生产的协议。检出限是关于2 7和1.5 pg / mL。
2.8。数据分析
数据表示为±SD方法。水平的意义比较样本由学生决定t以及分布或单向方差分析使用图垫棱镜(拉霍亚,CA)。值< 0.05被认为是具有统计学意义。
3所示。结果
3.1。一代的Scgb3a2−−/老鼠
理解在OVA-induced SCGB3A2过敏性气道炎症的作用,Scgb3a2−−/老鼠的第2和第3外显子生成Scgb3a2基因是目标(图1(一))。在ES细胞同源重组后,包含一个阳性克隆loxP在(floxed-Neo)Scgb3a2等位基因被发现(图1 (b))。产生一个淘汰赛等位基因,这些老鼠EIIA——过去了Cre表达Cre重组酶的转基因小鼠受精卵阶段(14]。第二和第三外显子的缺失Scgb3a2证实了基因PCR(图1 (c))。
3.2。总特征Scgb3a2−−/老鼠
老鼠健康和肥沃的至少一年,不管他们的遗传背景。他们以正常的速度增长,没有表现出任何严重异常或临床疾病。肺部检查时正常组织学检查(图3个月的年龄2(一个)和数据未显示)。免疫印迹和免疫组织化学分析用肺组织显示Scgb3a2−−/老鼠缺乏SCGB3A2(数据的表达2(一个)和2 (b))。基因敲除小鼠被backcrossed C57BL / 6 ncr(6倍)。他们一起混合小鼠遗传背景(),用于进一步的实验与各自的野生型同窝出生的控制。
(一)
(b)
3.3。OVA-Induced气道炎症模型
Scgb3a2−−/小鼠和野生型的同胞混合遗传背景和六次C57BL / 6 ncr backcrossed受到卵巢炎症模型。组织学检查所有病变的发病率和评分较低与统计混合背景的差异Scgb3a2−−/()比野生型的同胞()(数据3(一个)和3 (c)),而他们在相似的水平和野生型的同胞OVA-challenged老鼠(数据3 (b)和3 (d))。炎症细胞的数量在支气管肺泡灌洗液(BALF)在OVA-challenged低老鼠比老鼠与统计学意义(图3 (e)),而没有明显的差异和(图后卵子的挑战3 (f))。
(一)
(b)
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(d)
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(f)
促炎细胞因子的表达如il - 4、IL-5, IL-13由存在决定为肺组织mRNA水平和ELISA BALF中蛋白质含量(图4)。这三种细胞因子水平降低与统计学意义或显示低水平的趋势在肺组织以及从OVA-challenged BALF老鼠比同窝出生的(图4(一))。mrna水平编码其他细胞因子参与了过敏性气道炎症,如CCR3 CCR4, CCL11, CCL17, CCL22 [16)也由存在决定的。低水平的这些mrna在OVA-challenged被发现老鼠比同窝出生的(图4 (b))。相比之下,六次C57BL / 6 ncr backcrossed句老鼠,信使rna编码il - 4和il - 4水平的蛋白质明显高于肺组织和BALF OVA-challenged老鼠分别OVA-challenged相比老鼠。IL-5 IL-13信使rna和蛋白质含量相似的两条线之间(图4 (c))。此外,信使rna编码IL-9和CCR4 OVA-challenged更高老鼠比OVA-challenged老鼠(图4 (d))。的mrna水平编码其他细胞因子、CCR3 CCL11, CCL17和CCL22类似OVA-challenged这两条线之间的老鼠。结果表明,老鼠不太敏感OVA-induced气道炎症与野生型相比,控制,老鼠表现出增加敏感度OVA-induced气道炎症。
(一)
(b)
(c)
(d)
4所示。讨论
本研究描述了生成和表征Scgb3a2−−/老鼠。这些老鼠是健康的和肥沃的,不需要证明SCGB3A2发展和肺内稳态。然而,当受到卵巢气道炎症模型混合遗传背景基因敲除小鼠表现出更严重的过敏炎症,而六次C57BL / 6 ncr backcrossed句话敲除小鼠显示出类似的或增加水平的炎症与各自的野生型相比同窝出生在肺组织学方面,BALF炎性细胞数量,肺癌和BALF和炎性细胞因子的水平。
嗜酸性粒细胞聚集在气道壁和内腔是哮喘的一个代表性的特征(16,17和卵子小鼠气道炎症模型6]。嗜酸性粒细胞是被CCL11 (eotaxin)发布的上皮细胞通过CCR3表达在细胞表面的嗜酸性粒细胞(16]。在我们的模型中,il - 4的表达中起着重要的作用在过敏炎症反应明显高于OVA-challenged BALF中老鼠从OVA-challenged相比老鼠,炎性指标确定基于肺和炎性细胞的组织学特性数字矿山OVA-challenged之间没有显著差异和老鼠。两行之间的类似炎症指标发现老鼠也可能被解释成CCL11和CCR3的水平没有显著不同和老鼠;这两组的老鼠有类似水平的嗜酸性粒细胞招募。
怀特黑德et al。18)检查卵子敏化后的气道代和炎症的发展和挑战在不同时间点(24、48和72小时后挑战)使用9基因多样化的小鼠(129 / SvIm / J, BALB / cJ, BTBR + (T) / tf / tf,演员/ Ei,摘要:HeJ, C57BL / 6 J, DBA / 2 J和FVB / NJ)。卵子的挑战后,129 / SvIm和C57BL / 6 j菌株有最大数量的白细胞浸润在72小时后BALF挑战(~ 420000 ~ 310000细胞/毫升,职责),在细胞之间的其他菌株~ 1000 ~ 10000细胞/毫升。至于il - 4的表达,只有6个9株致敏的卵子(129 / SvIm / J, BTBR + (T) / tf / tf, BALB / cJ, C57BL / 6 J,和DBA / 2 J)有显著增加的BALF中il - 4的表达在一个或多个时间点在72小时的曝光后评估;水平测量在24和72小时曝光后6 ~ 35和129 pg / mL / SvI和6和4对C57BL / 6 j pg / mL,分别。结果表明炎症反应的巨大差异,这取决于鼠标菌株和检查时间点。在基因敲除小鼠表型遗传背景的影响已经被很好地记录下来了(19,20.]。
和老鼠用在当前的研究中有复杂的背景129 sv, C57BL / 6, FVB(来自EIIA -Cre老鼠),每个不同的两条线之间的百分比。很有可能,OVA-induced过敏性气道炎症模型中使用这些混合背景老鼠,应变差异可能是一个更强的司机比的损失Scgb3a2基因在炎症的发展,出现了像SCGB3A2 OVA-induced过敏性气道炎症中扮演了一个角色。然而,在6次回交C57BL / 6 ncr,句话老鼠显示炎性表型可以同相反基因的老鼠,这表明一个修饰词(s)来自其他宿主基因相比Scgb3a2OVA-induced过敏性气道炎症中扮演重要角色老鼠。回交的Scgb3a2−−/等位基因转移到另一个如129 sv的老鼠和FVB比较之间的表型不同品系小鼠卵子后挑战结合基因映射可能识别潜在的基因修饰符(s)在主机影响OVA-induced小鼠气道炎症。这种修饰基因识别被形容为多囊肾疾病使用凯特2 j(kat:肾、贫血和睾丸表型)突变小鼠(21)和多个肠道肿瘤最小值(多发性肠瘤)突变小鼠22]。另一方面,转移到一个不同的遗传背景突变小鼠表型,显示一个小窗口,根据天生的背景,这狭窄的窗口可以朝着更温和或更严重的形式的疾病。一系列不同遗传背景的老鼠,这可能构成一个范围广泛的表型,这可能与人类患者的症状观察到由于其遗传异质性。修饰基因的识别老鼠可能提供候选基因(s),控制人类疾病的严重程度(19,20.]。
尽管OVA-induced气道炎症的严重程度似乎减弱老鼠比老鼠,当前的结果与句老鼠不过表明SCGB3A2最有可能有抗炎活性。这是在良好的协议与我们的研究证明SCGB3A2展品抗炎活动早些时候卵子气道炎症模型小鼠经重组腺病毒表达SCGB3A2 [6]。注意,OVA-induced气道炎症表现老鼠不健壮。对造成这一现象的原因可能是由于这一事实(1)卵子可能不是最适合产生明显差异为过敏性气道炎症实验模型;(2)在Scgb3a2−−/小鼠,基因参与炎症可能已经改变,其中一些SCGB3A2补偿活动;和(3)前(高水平的SCGB3A2表达式通过体内接种病毒)和当前实验(SCGB3A2缺乏内源性表达)是两个不同的系统,不能直接比较。其他方式生产气道炎症可能需要清楚地表明SCGB3A2具有抗炎活性,和这种蛋白质的缺乏使得肺更容易发炎。
SCGB3A2 homeodomain最初认定为下游目标转录因子NKX2-1,的一个关键的转录因子负责发展的肺和lung-specific基因的表达(3,5,23- - - - - -25]。Nkx2-1零小鼠严重与退化的支气管肺发育不良(23]。以前SCGB3A2被证明胚胎肺生长因子活性,促进发展,管理SCGB3A2Nkx2-1零小鼠部分恢复肺上皮组织学(4]。幼稚的原因Scgb3a2−−/老鼠没有任何明显的肺组织学异常还不清楚。可能是因为SCGB3A2许多NKX2-1下游目标负责的开发和内稳态肺,这可能产生冗余和重复的活动,其他基因产物可以弥补缺乏生长因子SCGB3A2的活动。
5。结论
Scgb3a2−−/建立了小鼠和特征。当受到OVA-induced气道炎症模型,和分别老鼠减少,增加气道炎症。SCGB3A2函数的结果表明,损失是由一个修饰基因影响(s)的混合遗传背景和SCGB3A2有抗炎活性。结果显示句的重要性使用基因敲除小鼠来了解感兴趣的基因的作用。结果进一步表明可能的重组体人SCGB3A2作为抗炎剂的使用。
利益冲突
作者宣称没有利益冲突。
作者的贡献
Taketomo Kido和Mitsuhiro Yoneda同样导致了这项工作。
确认
这项研究由美国国家癌症研究所支持,癌症研究中心,校内的研究项目。