文摘
背景。我们以前报道连续激活caspase-1和增加白介素(IL) 1β早期类风湿性关节炎(RA)水平。这些观察了il - 1为假设的药物β途径,除了肿瘤坏死因子(TNF),尤其对早期RA治疗有效。我们最近发现藤黄酸作为一种很有前途的治疗候选人同时阻断il - 1β和TNF分泌。我们的主要目标是调查藤黄酸政府是否能够减弱antigen-induced关节炎的炎症(AIA)老鼠。方法。藤黄酸是友邦保险管理大鼠关节炎的早期和晚期阶段。炎症评分、脚踝周边和体重进行了评估期间的待遇。老鼠牺牲经过19天的疾病进展和爪子采集样本进行组织学和免疫组织化学评估。结果。我们发现,在关节炎症显著抑制藤黄酸后管理。组织学和免疫组织化学评价治疗的老鼠显示正常关节结构完全废除的炎性浸润和细胞增殖。结论。我们的研究结果表明,藤黄酸具有显著的抗炎作用和可能构成一个原型抗炎药治疗效果治疗炎症性疾病,如风湿性关节炎。
1。介绍
类风湿性关节炎(RA)是最常见的疾病的炎症性关节疾病,困扰世界人口的1%左右。穷人疾病可以有一个非常积极的课程和推断的结果分析其社会影响(经过10年的疾病持续时间,超过50%的RA患者无法执行的专业活动)(1),预期寿命减少10年由于疾病活动和相关并发症(2]。类风湿性关节炎是一种慢性全身性炎性疾病表现为滑膜增生造成的大量增殖的细胞浸润的白细胞,促炎细胞因子表达水平高,顺向的侵蚀关节软骨和骨骼。风湿性关节炎的治疗方法已经彻底改变了过去十年的发现具体的有针对性的治疗。然而,尽管所有可用的治疗选择,RA仍然是一个进步的,破坏性的,使人衰弱的疾病,只有20%的患者达到缓解(3]。Anakinra,拮抗剂白介素1 (IL),被批准为RA治疗在过去的十年。然而,真正的对疾病活动的影响已被证明在实践中低于预期的临床试验结果,il - 1的作用产生怀疑β作为治疗目标(4]。尽管如此,我们之前报道增加il - 1的水平β在最近出现关节炎和类风湿关节炎患者建立的滑液(5]。这个观察可以解释caspase-1激活的,我们也观察到在早期和建立RA患者(6]。因此,它是可能的,il - 1β月初起着重要的作用而不是晚期的疾病和通路调节细胞因子,如caspase-1和NF -激活,可能构成对特定药物的治疗目标。效果可能会进一步提振了如果一个抑制肿瘤坏死因子(TNF)的影响也可以实现。基于最近的药物筛选化合物的结果同时抑制il - 1βTNF分泌,我们选择了藤黄酸作为一种有前景的候选治疗治疗关节炎。藤黄酸是一个polyprenylated氧杂蒽酮树脂来源于丰富的藤黄属植物hanburyi和g . Morella在东南亚,补充和替代医学(7]。最近的研究表明,藤黄酸能够抑制多种肿瘤细胞的生长(8]。我们的目标在这个研究是研究藤黄酸政府是否能够减弱antigen-induced关节炎的炎症在鼠模型(AIA)。
2。材料和方法
2.1。道德声明
所有实验动物用户和伦理委员会批准的药物分子研究所,根据葡萄牙法律和欧洲的建议。
2.2。化合物
藤黄酸是购自圣克鲁斯生物技术(圣克鲁斯,美国)。
2.3。il - 1β和肿瘤坏死因子量化
THP-1细胞被刺激的6小时4% PFA-fixed DH5大肠杆菌(大肠杆菌)在感染复数(MOI) 20每THP-1细菌细胞的细胞,1小时后孵化藤黄酸。收集细胞上清液和il - 1β和肿瘤坏死因子细胞因子量化了酶联免疫吸附试验(ELISA)(研发系统、美国)根据供应商的指令。
2.4。友邦保险的关节炎大鼠模型和评估
女性纯种友邦的老鼠从查尔斯河实验室购买国际(美国MA)和维护特定无菌(SPF)条件。动物接种异氟烷麻醉下皮下注射完全弗氏佐剂(CFA)包含分枝杆菌butyricum在大鼠垫导致深刻的系统性炎症导致严重的关节肿胀和破坏。藤黄酸的剂量管理4μg / g体重每天(9]。药物和车辆控制(二甲亚砜(DMSO)溶解在正常生理盐水和友邦4天后大鼠腹腔内注射(早期治疗组,)和后11天(治疗组,)疾病的感应,当关节炎已经存在。健康nonarthritic ()和vehicle-injected ()动物被用作控制进行比较。炎症评分、脚踝周边和治疗期间体重测量。炎症迹象进行评估通过计算每个关节的分数在0 - 3的规模(0:没有,1:红斑,2:红斑、肿胀和3:畸形和功能障碍)。每个动物的总分被定义为每个受影响的部分分数的总和(联合10]。疾病的老鼠牺牲后19天进化和爪子采集样本进行组织学和免疫组织化学评估。
2.5。组织学和免疫组织化学
组织病理学观察,爪子、肺、肝脏、肾脏、脾脏、胰腺样本收集的时候牺牲。样本立即修复10%中性缓冲福尔马林溶液,然后脱水用增加乙醇浓度(70%、96%和100%)。爪子样本,被固定后,也在10%甲酸脱钙。样本下嵌入石蜡,切片,苏木精和伊红染色形态学检查。爪子也用于与Ki67抗体免疫组织化学染色,细胞增殖标记。组织部分是孵化主要抗体鼠多克隆Ki67(英国Abcam)和想象+ (Dako、丹麦)。颜色是在解决方案开发包含diaminobenzadine-tetrahydrochloride(美国σ),0.5%的H2O2在磷酸盐缓冲(pH值7.6)。幻灯片与苏木精复染色和安装。所有图片都是获得使用徕卡DM 2500(德国徕卡微系统)显微镜配备了彩色摄像机。数据对滑膜细胞的增殖程度得分从0 - 3(0:不超过三层,1:三到四层,2:五到六层,和3:超过6层)。淋巴细胞浸润得分从0 - 3(0:没有扩散渗透,1:淋巴细胞聚集,2:淋巴滤泡,和3:淋巴滤泡生发中心形成)(11]。
2.6。Caspase-1和NF -B化验
THP1(写明ATCC矿- 202)macrophage-like细胞系和THP1 / NF -B细胞系培养在记者R10-RPMI媒体1640补充10% (v / v)胎牛血清,1% (v / v) penicillin-streptomycin, 1% (v / v)丙酮酸,1% (v / v)谷酰胺,1% (v / v)不必要的氨基酸,1% (v / v)消息灵通的缓冲区,和2-mercaptoethanol最终浓度为0.05 M,推荐由美国组织培养(写明ATCC)集合。细胞培养在250.000 /毫升,孵化与10μM藤黄酸的1 h在37°C公司5%2,然后用PFA-fixed刺激大肠杆菌(20大肠杆菌每个细胞)8 h和24小时37°C公司5%2。同时,nonstimulated负控制细胞同时也培养密度作为比较刺激人口。Caspase-1活动以THP1 macrophage-like细胞系使用Carboxyfluorescein FLICA检测包半胱天冬酶测定(美国免疫化学技术,LLC)试剂后指令。短暂,细胞不同的化验免受曝光而孵化为1小时37°C和30 x FLICA解决方案1:30比率。NF -在THP1 / NF - B的活性测定记者B细胞系。慢病毒粒子携带NF -B-responsive GFP-expressing报告基因(Cignal Lenti记者,SABiosciences,美国)被用来感染THP-1细胞,建立稳定的细胞系。所有样本分析流式细胞术使用流式细胞仪石中剑(美国BD生物科学)。收集的数据进一步分析使用FlowJo软件(树明星Inc .)、美国)。
2.7。统计分析
与非参数统计的差异确定克鲁斯卡尔-沃利斯和Mann-Whitney测试使用GraphPad棱镜(美国GraphPad)。被认为具有统计显著性差异。
3所示。结果
3.1。藤黄酸降低il - 1β和肿瘤坏死因子的生产
研究这种药物在抑制il - 1的影响β和TNF分泌,我们对待人类THP-1 macrophage-like藤黄酸的浓度增长的细胞株1小时前用PFA-fixed挑战他们大肠杆菌6小时。条件媒体当时对il - 1的分泌β或者使用ELISA TNF。藤黄酸显著抑制细胞因子的分泌各种浓度(图1),确认之前报道藤黄酸的影响在阻止这些细胞因子的分泌12)我们早期的发现和验证。
(一)
(b)
3.2。藤黄酸抑制NF -的激活B和Caspase-1
Pro-IL-1β和肿瘤坏死因子都取决于NF -B各自mrna转录的激活。Pro-IL-1β处理进一步依赖caspase-1的激活。因此,我们测试了藤黄酸对这些关键路径的影响。研究这种药物的效果在NF -的激活B,我们使用了一个NF -记者B细胞系由稳定与商业慢病毒感染THP-1细胞GFP记者最小CMV启动子的控制下和NF -串联重复序列B转录响应元素(过夜)。藤黄酸能够抑制NF- b记者激活后大肠杆菌刺激与细胞相比,也刺激了但没有接受治疗(图2(一个))。测试这种药物对caspase-1处理和活化的影响,我们使用caspase-1荧光底物和使用流式细胞仪测量相对活跃caspase-1水平。同样在此设置,藤黄酸显著降低激活caspase-1(图2 (b))。
(一)
(b)
3.3。藤黄酸能够抑制炎症在纯种老鼠Antigen-Induced关节炎
研究藤黄酸的抗炎作用在活的有机体内友邦保险,老鼠每天使用4μ藤黄酸的g / g体重后腹腔疾病已经成为症状。我们开始疾病治疗后4天的感应(早期治疗组)和经过11天的疾病感应(晚期治疗组)。炎症评分和脚踝周边进行了评估期间的待遇。如图3第四天,所有诱导动物已经出现关节炎。所有诱导动物收到车辆或藤黄酸点。6天的治疗后,vehicle-injected集团大幅增加炎症表现,然而,在藤黄酸洗老鼠,有最小的炎症活动,甚至完全废除关节炎表现。治疗组,药物管理局成立后11天疾病的进化,当动物提出了一个6炎症评分的平均值。同样在这一组,用藤黄酸治疗的第二天,炎症表现开始显著减少。这个结果表明,这种药物抗炎作用即使在后面的阶段管理的关节炎。经过15(早期治疗组)和8(晚期治疗组)治疗,藤黄酸表现出显著的抗炎作用,评估的评估炎症评分(图4)和脚踝周边(在早期组和年末组与未经处理的动物)。我们也测试了2μg / g体重每天皮下注射。使用这种疗法,治疗组早期抗炎效果显著(),但不像4戏剧性的μg / g体重腹腔内,治疗组,药物没有效果。此外,我们已经观察到的一个子集动物炎症得分很低,即使阻止药物的管理在13天。我们能够观察到这没有药物的抗炎作用,直到21天(数据没有显示)。
值得注意的是,一些治疗腹腔内的动物,我们观察到体重下降和腹水,按照以前的文献报道。在解剖,我们,一起一个兽医,宏观上观察到内部器官显示没有改变当比较藤黄酸洗,vehicle-treated和健康nonarthritic老鼠。另外,我们观察到部分收集的内部器官组织学牺牲的时候,它也没有改变比较所有实验动物组。具体来说,在脾脏的情况下,在一些RA患者和关节炎的动物模型出现脾肿大,我们发现,藤黄酸洗和vehicle-treated老鼠显示脾增生,增加细胞结构,相比之下,健康nonarthritic老鼠(见附加图S1在网上补充材料http://dx.doi.org/10.1155/2014/195327)。这个结果可能是由于这一事实藤黄酸不是调节淋巴细胞发展而是针对下游caspase-1和NF -B激活。
3.4。藤黄酸可以防止关节炎性浸润和扩散
评价关节内的免疫细胞的渗透在友邦老鼠,联合组织部分被苏木精和伊红染色。在图所示的组织学评价5显示,老鼠藤黄酸处理正常关节炎性浸润的结构完全废除(在早期治疗组与未经处理的动物)。相比之下,vehicle-treated老鼠表现出炎症细胞的浸润,骨入侵和侵蚀(图5)。我们还研究了免疫细胞的增殖水平染色与Ki67共同组织部分。免疫组织化学结果显示,大鼠藤黄酸处理提出了降低免疫细胞在关节(扩散对未经处理的动物)。此外,藤黄酸治疗预防软骨和骨破坏(图5)。
4所示。讨论
我们的研究结果表明,用藤黄酸治疗保护纯种友邦的老鼠从关节炎发展完全废除联合免疫细胞的渗透和扩散,防止软骨和骨破坏。
我们实验室使用THP-1 macrophage-like细胞株筛选2320种药物对于那些同时抑制il - 1β和TNF分泌13]。我们选择了藤黄酸作为一种有前景的候选治疗抑制il - 1β和TNF分泌,减少由于caspase-1和NF -B激活,因此治疗关节炎。先前的报道表明,藤黄酸可以抑制多种肿瘤细胞系的生长,可能是由于其诱导细胞凋亡的能力14通过转铁蛋白受体(TfR1) []15]。此外,最近的数据表明,这种药物可以抑制NF -B信号通路在人类白血病癌细胞(8]在noncancerigenous巨噬细胞细胞系(16通过TfR1)也。因此,似乎藤黄酸介导的抗炎效应的抑制NF -B激活途径进而导致大部分的炎症基因的沉默。事实上,抑制NF -B在动物模型表明,抑制炎性关节炎的能力,表明NF -B在RA(可能是一个重要的治疗目标17- - - - - -19]。事实上,NF -B参与转录的基因编码许多促炎细胞因子和趋化因子,调节不同的免疫细胞,在粘附分子的表达和矩阵的调节基质金属蛋白酶(20.- - - - - -22]。最近,IkB激酶IKKβ至关重要的炎性细胞因子激活NF -B (23]。重要的是,它已经被报道,藤黄酸能够抑制IKKβ活动(16]。在我们的研究中,我们证明了这种药物的抗炎作用友邦老鼠不仅可能与抑制NF -的激活的能力B但是它对抑制caspase-1激活的影响。
藤黄酸具有双重的差别影响对这些TNF和il - 1β生产。有趣的是,Joosten等人显示il - 1的非耦合活动β和肿瘤坏死因子在关节肿胀和持续的软骨破坏。此外,据报道,有不同的时间对il - 1的角色β和肿瘤坏死因子的不同阶段胶原诱导的关节炎(24]。
在RA滑膜发炎扩展和破坏底层软骨和骨骼,导致不可逆的侵蚀失去正常的骨头和关节结构导致残疾(25]。藤黄酸的抑制作用细胞浸润和扩散以及骨侵蚀感兴趣的可以被证明是预防和治疗风湿性关节炎引起的结构破坏关节。此外,政府的藤黄酸友邦老鼠测试治疗策略,因为它始于关节炎的早期阶段,经过4天的疾病感应,所有的动物都已经显示炎症的迹象。进一步评价化合物的影响后一个阶段的疾病,藤黄酸也管理疾病感应11天之后,当动物显示炎症分数很高。因此,藤黄酸治疗是有效管理的关节炎的早期和更成熟的阶段,这是有关我们的发现可能的临床意义。
5。结论
总之,我们发现纯种友邦老鼠藤黄酸可以有效治疗。这种药的效果可能依赖于il - 1的抑制β和TNF分泌,可能解释的能力表达下调caspase-1和NF -B激活,通过阻断滑膜增生由于其显著的抗增殖特性。这些结果支持我们的初始假设双重抑制il - 1β和肿瘤坏死因子可以有效治疗炎症性疾病,如风湿性关节炎,并进一步表明,藤黄酸的抗增殖特性可能是必不可少的一个有效的临床控制和诱导早期RA患者的缓解。根据我们的观察表明可能的毒性在使用的一些方法,我们建议藤黄酸可能不适合直接进入第一阶段的临床试验,但是它可以作为一个原型药物寻找衍生物化合物具有类似炎症介质和细胞增殖的影响和更有利的安全性。
利益冲突
作者宣称没有利益冲突有关的出版。
资金
这项工作是支持格兰特(SFRH / BD / 40513/2007)从Fundacao para Ciencia e Tecnologia (FCT)和辉瑞的无限制的研究资助。在路易斯工作项的实验室支持FCT (PIC / IC / 82991/2007和PTDC / SAU-MII / 100780/2008)和Fundacao Luso-Americana对位o Desenvolvimento (FLAD)。投资者没有参与研究设计、数据收集和分析,决定发表或论文的准备。
确认
作者要感谢安娜洛佩斯的技术援助和安娜路易莎Caetano与流式细胞仪技术支持。若昂Eurico丰塞卡和路易斯·费雷拉项联合的资深作者。
补充材料
我们已经观察到的宏观内部器官的时候牺牲以及他们的组织部分,并认为没有改变比较所有实验动物组。具体地说,在脾脏的情况下,我们发现,藤黄酸处理和vehicle-treated鼠脾脏增生,细胞结构增加,相比之下,健康nonarthritic老鼠。