文摘

环氧合酶和脂氧合酶是酶促炎;前者影响血小板聚集,血管收缩,血管舒张,后来动脉粥样硬化的发展。从格鲁吉亚红酒和欧洲中部和西部抑制cyclooxygenase-1 (COX-1)活动范围的63 - 94%,cyclooxygenase-2 (cox - 2)的活动范围的20 - 44%(测试5毫升/ L)的浓度,和5-lipoxygenase (5-LOX)活动范围的72 - 84%(18.87毫升/ L)的浓度。白葡萄酒抑制5-LOX在41 - 68%浓度的18.87毫升/ L和没有抑制COX-1和cox - 2。Piceatannol(集成电路₅₀= 0.76μ米)被确认为一个强有力的抑制剂的5-LOX毛地黄黄酮(IC紧随其后₅₀= 2.25μ米)、槲皮素(IC₅₀= 3.29μ米),杨梅酮(IC₅₀= 4.02μ米)。反式白藜芦醇COX-1被确认为一种抑制剂(IC₅₀= 2.27μ米)和cox - 2 (IC₅₀= 3.40μ米)。红酒作为一个复杂的混合物是一种强大的抑制剂COX-1, cox - 2,和5-LOX酶参与类二十烷酸生物合成途径。

1。介绍

适度消费的葡萄酒与冠状动脉心脏病的发病率降低(1,2]。酒在葡萄酒减少血小板聚集,导致减少了坚持的内皮表面动脉,血液凝固,血栓形成(3,4]。除了酒精,可以降低血小板聚集抑制cyclooxygenase-1 (COX-1)活动由酚类化合物存在于酒,如白藜芦醇(5]。COX-1凝血恶烷的催化从花色,二十烷类传播血小板聚集和血管收缩6,7]。因此,抑制COX-1(例如,通过阿司匹林COX-1选择性抑制剂)提出了预防心血管疾病(8,9]。另一方面,第二个环氧酶的抑制同种型(cox - 2)导致减产的内皮vasodilitator和antiaggregatory前列腺素类。因此,选择性cox - 2抑制剂(coxibs)作为抗炎药增加心脏事件的风险(10]。第二个重要的生物合成途径导致类花生酸的生产是由5-lipoxygenase (5-LOX)。最终产品的5-LOX通路,白三烯B₄(LTB₄),是一个中介的一些炎性疾病包括动脉粥样硬化(11]。还有酒等成分槲皮素能够抑制5-LOX活动(12]。与报告积极作用的酚类化合物,最近的两项研究描述强烈激活COX-1和cox - 2催化活性杨梅酮、槲皮素表明类花生酸的葡萄酒成分还可以增加产量13,14]。的报告所提到的,我们决定测试葡萄酒作为一种复杂的混合物的各种化合物抑制潜在COX-1, cox - 2和5-LOX。我们比较的活动格鲁吉亚红白葡萄酒与葡萄酒生产在中欧和西欧。此外,我们评估了33个酚类化合物抑制活动通常发生在酒,目的是确定每个化合物的贡献葡萄酒的整体效果。最后,在网上对接实验被用来提出一个绑定模式最活跃的化合物。

2。材料和方法

2.1。标准和化学物质

测试化合物从Sigma-Aldrich购买,捷克共和国(对甲氧基苯甲酸,芹黄素、咖啡酸、儿茶酸、肉桂酸、香豆酸、cyanidin-chlorid, delphinidin-chlorid, 3, 4-dihydroxybenzoic酸、表儿茶素、阿魏酸、没食子酸、山柰酚、毛地黄黄酮,米羟基酸,p羟基酸、piceatannol quercetin-dihydro,白藜芦醇,水杨酸,syringic酸酪醇,luteolin-7-glucosid,杨梅酮,柚苷配基,sinapinic酸和香草酸);注热水德国,德国(绿原酸);德国罗斯(芦丁);和多酚实验室、挪威(花翠素3 -β吡喃葡萄糖苷,malvinidin 3 -β吡喃葡萄糖苷,peonidin 3 -β吡喃葡萄糖苷,矮牵牛配基3 -β吡喃葡萄糖苷)。

Eicosatetraynoic酸(ETYA)、乙醇(EtOH) calciumionophor A23187,二甲亚砜(DMSO),花生四烯酸(AA),吲哚美辛,台盼蓝、龙胆紫,猪血色素,L-epinephrine, Na₂EDTA、甲酸、COX-1来自精囊,ram和人类重组cox - 2买来Sigma-Aldrich(捷克共和国)。右旋糖酐t - 500是从罗斯(德国)购买的。氯化铵(NH₄Cl)、磷酸氢二钠(Na₂HPO₄)、食盐(氯化钠)和磷酸二氢钾(KH₂阿宝₄)从Lachner获得信息(捷克共和国)和与被其子as Farmak捐赠。(捷克共和国)。氯化钾(氯化钾)和氢氧化钠(氢氧化钠)购买Lachema主导者——(捷克共和国)。三是购买Bio-Rad(捷克共和国)。氯化钙(CaCl₂h·2₂O)和醋酸(CH₃羧基)来自五(捷克共和国)。

2.2。葡萄酒样品

样本来自不同地区的商业葡萄酒格鲁吉亚、捷克、法国、意大利和奥地利当地生产商提供的或从超市购买或葡萄酒商店。共有26个品种黑皮诺红酒()、赤霞珠()、赤霞珠摩拉维亚(),Seperavi (),一批酿造的酒Saperavi和Saperavi Budeshuriseburi ()和Alexandrouli ()和13个品种霞多丽白葡萄酒样品(白苏维浓(),白藜芦醇含量(),以及一批酿造的酒含量和其他当地品种(化验。测试了葡萄酒的详细信息包含在网上补充表1(见补充材料http://dx.doi.org/10.1155/2014/178931)。初步筛选后,红酒被稀释比例1:9水达到5毫升/ L的最终浓度和白葡萄酒检测稀释导致50毫升的浓度/ L COX-1和cox - 2化验。未稀释的红葡萄酒和白葡萄酒样本用于5-LOX试验导致的最终浓度18.87毫升/ L。

2.3。COX-1和cox - 2化验

分析是根据过程执行先前描述的控制和鲍尔15从ram)与COX-1精囊和人类重组cox - 2。COX-1(1单位/反应)或cox - 2(0.5单位/反应)添加到180L孵化的混合物,由100毫米三羟甲基氨基甲烷缓冲液(pH值8.0),5M猪血色素、L-epinephrine 18毫米和50米纳₂EDTA。葡萄酒样品,测试了复合稀释在DMSO, 12%乙醇(葡萄酒样品在空白的情况下),或纯DMSO(在空白的情况下,对纯化组分)添加(10μL)和混合物在室温下是preincubated 5分钟。增加5L (10M AA开始反应。20分钟后的孵化37°C,反应停止了10μL 10%的甲酸。所有样本稀释1:15 ELISA缓冲和(前列腺素E的浓度₂)铂族元素₂产生的反应是由铂族元素₂酶联免疫试剂盒(恩佐生命科学,我们)根据制造商的指示。吸光度与铂族元素₂浓度是衡量标Tecan无限M200 (Tecan集团、瑞士)在405海里。结果表示为铂族元素的抑制百分比₂形成对未经处理的样品(空白)。

2.4。5-LOX化验

稍微修改版本的分析被执行先前描述的标准方法(16]。淡黄色的外套(50 mL)获得健康的捐赠者是沉淀在20毫升的葡聚糖溶液(6%右旋糖酐t - 500, 1%氯化钠)在4°C。一个小时后,上层清液收集在4°C和离心机在1600 rpm 10分钟,然后浮在表面的被丢弃。获得的颗粒是用磷酸盐缓冲盐水洗净(KH PBS, 0.02%的氯化钾,0.024%₂警察丁,0.8%生理盐水、0.288% Na₂HPO₄h·12₂O, pH值7.4)离心机。在此获得颗粒细胞溶解(NH 0.17%₄Cl, 0.2%三,pH值7.2)在室温下5分钟然后在1400 rpm离心机在4°C 5分钟。颗粒又洗了PBS和离心机在4°C 1400 rpm,持续15分钟。最后,颗粒溶解在3毫升的PBS和细胞生存能力进行了测试。这些细胞被稀释的最终浓度4500细胞/l

225年的孵化混合物组成L细胞悬液,10CaCl L 2毫米₂,10L (10M ETYA 5L(测试样本(酒、化合物溶解在DMSO溶液、12%乙醇或纯DMSO的空格),10L (21米钙ionophor A23187和5L 120年M AA。反应停止后10分钟孵化与20 37°CL 10%的甲酸。样本稀释在ELISA缓冲和40倍LTB的浓度₄测量使用商业LTB₄酶联免疫试剂盒(恩佐生命科学,我们)根据制造商的指示。相对于LTB吸光度₄浓度为405 nm使用M200 Tecan无限。结果表示为抑制LTB百分比₄形成对未经处理的样品(空白)。

2.5。对接

在对接仿真、三维矫形器的分子被5-LOX绑定的口袋内,生成一组积极良好的姿势。这些姿势然后根据分数排名,对接项目分配到每个姿势,估计结合自由能。每个分子的名的姿势然后进一步优化3 d表示交互模式的计算分析结构活性关系。

可能直接相互作用的活性化合物5-LOX模拟,和3 d几何图形的化合物计算ω2.2.1。(17]。对接仿真软件包黄金5.1执行(黄金、英国)使用x射线晶体结构的5-LOX蛋白质数据库(PDB代码:3 o8y [18])。链绑定网站被选为对接。5-LOX不包含一个共晶结构的配体,所以结合位点被定义在一个6半径在催化铁(Fe2_1_A)。水分子在绑定口袋切换,旋转,这意味着程序可以使用它们作为绑定伙伴绑定网站或漠视他们是否引发空间位阻的配体结合。

得分GoldScore得分函数执行。名结果对接构成的结构活性分析,每个分子能量最小化在LigandScout使用默克分子力场94力场。3 d protein-ligand交互模式在LigandScout 3.1中生成。(19使用默认设置)。

2.6。统计分析

COX-1、cox - 2和5-LOX测试进行了在三个独立的实验中有两个复制。至少三个浓度用于集成电路的计算₅₀值的葡萄酒的化合物。酶活性的抑制葡萄酒样本平均值。集成电路₅₀值作为平均值±标准错误(标准差,SD)的意思。

3所示。结果与讨论

3.1。抑制COX-1和cox - 2的葡萄酒

红酒在5毫升/ L的浓度测试显示相当大的潜在抑制COX-1以及cox - 2与表中提供的效率1。另一方面,白葡萄酒在测试浓度高出10倍(50毫升/ L)(表几乎无所作为2)。例外是格鲁吉亚两样本,白藜芦醇含量(样品号37)和一批酿造的酒含量+ Mtsvane + Kakhuri + Khikhvi +基西人(样品没有。38),减少COX-1和cox - 2活动约95%和65%,分别为(表2)。结果表示在表1和2也证明红酒优先抑制COX-1而不是cox - 2与比率从2.1到3.7不等。COX-1选择性比阿司匹林不同作者之间的变化从1.7到42 (20.,21在化验游离。然而,提到的比率为葡萄酒属于记录范围。这些结果支持假设葡萄酒可能采取行动,与阿司匹林相似,通过抑制COX-1,减少血栓形成的风险。心血管疾病(CVD)的发病率也直接受到酒精消费的影响。每天喝少量的乙醇(20 - 30 g)减少心血管疾病发病率,过度消费导致风险增加(2,22,23]。因此,保护作用的红葡萄酒(适量)也可以解释为乙醇的影响结合抑制COX-1优惠活动。

比较不同的红酒品种显示只有细微的差别。观察更大的抑制活性的变化在个人样本。例如,半甜的Saperavi(样品号19)COX-1活动下降38%相比,平均只有84%的所有Saperavi样本。高COX-1和cox - 2抑制活性的格鲁吉亚两白葡萄酒(没有样品。37和38)可以解释为不同(Kakhetian)技术在发酵过程中使用(六个月与果渣发酵)。众所周知,葡萄皮的存在,一些茎,和种子的结果在一个较高含量的酚类化合物在酒24]。

这些结果表明,该处理方法抑制活性的影响超过了各种各样的葡萄酒或其地理起源。

3.2。抑制5-LOX的葡萄酒

红和白葡萄酒检测5-LOX抑制浓度为18.87毫升/ L (5L 265年未稀释的葡萄酒L反应混合物)。与考克斯抑制,红酒(表15-LOX抑制剂)强于白葡萄酒(表2),尽管红色和白色之间的区别并不明显。红酒是弱环氧酶抑制剂(如赤霞珠摩拉维亚)强烈5-LOX抑制剂,反之亦然强COX抑制剂(特酿Saperavi + Saperavi Budeshuriseburi葡萄酒)很弱5-LOX抑制剂。这些结果表明,抑制COX-1和cox - 2的影响不同化合物的抑制5-LOX或者相同的化合物在各自的酶有不同的影响。

3.3。抑制COX-1和cox - 2的葡萄酒成分

33个酚类化合物(酚酸、黄酮类化合物和对称二苯代乙烯)追究COX-1和cox - 2抑制活动来解释他们对葡萄酒的整体效果的影响。只有反式白藜芦醇强烈抑制COX-1 cox - 2与各自的IC₅₀值2.27和3.40M(表3)。弱活动被记录为槲皮素(IC₅₀= 43.82米)和山柰酚(IC₅₀~ 60米)COX-1。

葡萄酒的最终稀释样本(200次)考克斯化验导致估计的浓度反式白藜芦醇约0.06m .这个浓度计算值2.7 mg / L (11.8米)的平均值书目数据内容的白藜芦醇在红酒25]。显然,即使是在一个更高浓度的10倍反式在葡萄酒中白藜芦醇样本无法解释活动考虑到集成电路₅₀的值反式白藜芦醇。槲皮素和山柰酚的活性可以忽略不计,没有其他抑制剂筛选确定。按照文献的数据,我们建议一些其他化合物可能有助于葡萄酒的整体效果。我们认为可能造成的影响(−)儿茶素(在我们的研究中(+)儿茶素是不活跃的50岁M)和(+)-浓度ε-viniferin张等人孤立这些化合物从葡萄皮,声称他们的COX-1和cox - 2抑制活动(26]。然而,他们测试了这些化合物在高浓度100g / mL只有模糊的信息对他们的真正潜力。其他候选人可能有助于葡萄酒的活动是原花青素。Garbacki两考克斯等人记录显著抑制由儿茶素二聚体形式,gallocatechin-epigallocatechin二聚体,儿茶素三聚物在10 - 100M浓度(27]。从红酒中总含有花青素含量范围从250到2300 mg / L (28,29日),似乎这些化合物可能会发挥更重要的作用在整个考克斯。

3.4。抑制5-LOX葡萄酒成分

Piceatannol、木樨草素、槲皮素、杨梅酮抑制5-LOX与效率比参考抑制剂与(IC₅₀值在表3)。然而,根据浓度发生在红酒(piceatannol = 5.8 mg / L;杨梅酮、槲皮素= 8.3 mg / L;毛地黄黄酮= 1.0 mg / L;平均值的书目数据采用(25,30.]),集成电路₅₀价值观和稀释5-LOX葡萄酒样品的测定(53次)只有piceatannol(估计浓度测定混合物= 0.44M;集成电路₅₀= 0.76米)的整体活动可以促进红酒。槲皮素的作用(估计浓度= 0.52M;集成电路₅₀= 3.290.34 M),杨梅酮(估计浓度M;集成电路₅₀= 4.020.07米),毛地黄黄酮(估计浓度M;集成电路₅₀= 2.25M)在葡萄酒似乎微不足道的整体活动由于其低浓度的测定混合物。白葡萄酒通常是可怜的酚类化合物。Piceatannol,槲皮素、杨梅酮和木樨草素存在于非常低的浓度下或检测限制在白葡萄酒31日,32]。虽然目的和Abeywardena记录了抑制5-LOX(在酶反应),葡萄籽萃取物(IC₅₀= 13g / mL)和商业犯罪(IC红酒多酚类化合物₅₀= 35g / mL),有效成分负责其活动并没有确认或建议在他们的研究33]。然而,正如考克斯的酶,galloylated原花青素能够抑制5-LOX活动与IC₅₀从6.6到18.7不等米(34]。这个假设适用于红葡萄酒,但白葡萄酒原花青素浓度低近100倍(35]。因此,负责整体5-LOX抑制活性的化合物尤其是白葡萄酒仍然未知。

3.5。对接研究

进一步阐明抑制模式最活跃的化合物,他们停靠5-LOX的晶体结构。Piceatannol,最有力5-LOX抑制剂,显示几个交互绑定的口袋里,最明显的是氢键和Asn425 Gln557(图1)。

毛地黄黄酮(图2(一个)),槲皮素(图2 (b)),和杨梅酮(图2 (c))所有显示一组交互模式非常相似。协调所有三个化合物的催化铁和形成稳定的氢键His367和Thr364。槲皮素、杨梅酮还与Asn407形成氢键。如果一个羟基吡喃环(槲皮素、杨梅酮),与Gln363形成氢键。

考克斯,我们只记录了重要活动反式白藜芦醇。其绑定模式已经描述(36,37]。在这里,应该提到,Murias piceatannol IC等人记录₅₀= 4.713M和0.0113M COX-1和cox - 2,分别导致cox - 2选择性指数4175]。相比之下,没有任何抑制COX-1或cox - 2记录在我们的化验。我们的研究结果是一致李等人,他们记录没有抑制piceatannol(考克斯的这两种形式的38)和Gerhauser等人与IC测试COX-1抑制₅₀= 81.4米(39]。很难解释为什么使用酶相似的研究分析产生了不同的结果。然而,它还应该记住piceatannol可能是一个潜在的COX抑制剂存在于酒。更详细的研究,侧重于研究piceatannol应该揭示了考克斯这个有趣的化合物的抑制能力。

4所示。结论

红酒是一种有效的测试这三个酶的抑制剂的功效降低COX-1 5-LOX通过cox - 2。证据表明,红酒是一种更好的COX-1比cox - 2抑制剂可能会导致其保护作用。白葡萄酒比红葡萄酒弱5-LOX抑制剂,不抑制cox。两个例外是格鲁吉亚和果渣发酵样品(皮肤、茎和种子)传统Kakhetian方法。处理方法抑制活性的影响超过了各种各样的葡萄酒或其地理起源。反式白藜芦醇证明是一个重要的COX-1和cox - 2抑制剂,但这种化合物的活性就不能负责红酒的总体抑制活动。同样,尽管piceatannol,毛地黄黄酮、槲皮素和5-LOX杨梅酮是一种有效的抑制剂,考虑比率之间的集成电路₅₀价值观和浓度的酒只有piceatannol可以大大有助于红酒的整体活动。由于在我们的研究中确定的化合物不能完全解释葡萄酒的整体活动,我们假设,基于文献数据(27,34),原花青素在酒也可能导致其整体的潜力。然而,进一步的研究需要确定所有COX-1, cox - 2, 5-LOX抑制剂中包含的葡萄酒。

利益冲突

作者宣称没有利益冲突有关的出版。

确认

作者感谢博士Temur Gonjilashvili从酒厂Kindzmaraulis Marani从格鲁吉亚葡萄酒样品的捐赠。本研究在经济上支持捷克教育部青年和体育项目LD11005和由奥地利科学基金(S10711)。Daniela舒斯特是由Erika克莱莫资助的资格程序因斯布鲁克大学的。我们的研究也支持了成本行动FA1003葡萄藤多样性“东西方合作勘探和动员育种的适应性特征。支持的“协作与奥地利奥地利交换Dienst (OeAD)项目CZ14/2013捷克教育部,7 amb13at008青年和体育项目。

补充材料