文摘
嗜酸性粒细胞在抗菌防御的角色仍不完全清楚。在ovalbumin-sensitized老鼠,嗜酸性粒细胞被抗原选择性地招募到腹腔,eotaxin,或白三烯B4 (LT),一个5-lipoxygenase 5-LO代谢物。阻止反应抗原和eotaxin 5-LO封锁。我们检查了应对eotaxin没有5-LO敏感和他们的依赖。BALB / c或不是老鼠及其突变体(5-LO-deficient ALOX;与eotaxin eosinophil-deficient GATA-1)注入ip,嗜酸性粒细胞,或两者兼而有之,白细胞积累量化24 h。显著的嗜酸性粒细胞的招聘eotaxin BALB / c, 24 h,伴随着大量招募中性粒细胞和单核细胞/巨噬细胞。这些影响被eotaxin中和废除,5-LO-activating蛋白质抑制剂MK886。在ALOX(但不是PAS)小鼠,eotaxin招聘为嗜酸性粒细胞,中性粒细胞减少一半被废除。在GATA-1突变体,eotaxin招募中性粒细胞和巨噬细胞。 Transfer of eosinophils cultured from bone-marrow of BALB/c donors, or from ALOX donors, into GATA-1 mutant recipients, i.p., restored eotaxin recruitment of neutrophils and showed that the critical step dependent on 5-LO is the initial recruitment of eosinophils by eotaxin, not the secondary neutrophil accumulation. Eosinophil-dependent recruitment of neutrophils in naive BALB/c mice was associated with increased binding of bacteria.
1。介绍
嗜酸性粒细胞是少数粒细胞人口,导致过敏性炎症的病理生理学,hypereosinophilic综合症,一些恶性肿瘤(1- - - - - -4]。在抵抗嗜酸性粒细胞的作用多细胞寄生虫(蛔虫)一直提出,基于强大的血液和组织嗜酸性粒细胞与协会的蠕虫感染和证据表明,嗜酸性粒细胞可以伤害或杀死寄生虫,在特定的实验条件5,6]。然而,通常体内保护作用对蠕虫感染仍然是难以捉摸的嗜酸性粒细胞(4),部分原因是多细胞寄生虫宿主反应代表妥协之间的竞争需要减少寄生虫负担和限制免疫介导的组织损伤,而嗜酸性粒细胞显著贡献(7,8]。
另外,嗜酸性粒细胞可以直接对抗感染的机制通过各种类的微生物(或病毒,细菌,真菌,原生动物的)病原体包括抗菌defensin-like分泌蛋白(9];释放粘性细胞内容捕捉病原体,中性粒细胞胞外陷阱(类似于10];分泌的卤素杀菌剂的衍生品(11];释放的酶与抗病毒活性和其他角色在先天免疫(12,13];和广泛的免疫调节细胞因子的分泌14]。而嗜酸性粒细胞的贡献作为直接抗菌免疫效应细胞可能是有限的稀缺,他们可能有助于条件中性粒细胞访问或巨噬细胞功能将会减少:中性粒细胞,组织条目限制在正常情况下15];有关巨噬细胞,它们的杀菌剂的效应函数是高度依赖于适当的激活信号,包括细胞因子(16]。相比之下,嗜酸性粒细胞远多比在血液和粘膜正常组织与环境界面(2- - - - - -4微生物感染],它代表了潜在的网关。他们是众多的免疫调节细胞因子的来源13和脂质介质17),这可能会扮演一个角色在招聘/激活其他白细胞亚型。
由于嗜酸性粒细胞缺乏,许多重要的观测是在条件中,它们的数量已经增加,由于过敏敏化或实验寄生虫感染,如发现eotaxin (CCL11),化学引诱物,引起嗜酸性粒细胞积累在皮肤敏化(即。嗜酸性)豚鼠(2,3,18]。而其他的嗜酸性粒细胞化学引诱物,如PGD2 [19,20.]和oxo-ETE [21),也为特征,许多因素加强当前的理解eotaxin作为专业化学引诱物行为主要在粒细胞亚型有关过敏和蠕虫感染(2- - - - - -4]。这些因素包括eotaxin选择性报道的嗜酸性粒细胞(4,17,22,23[]和嗜碱性细胞20.,24,25血统,与造血细胞因子及其交互,比如IL-5 [26,27)和gm - csf (27),促进骨髓嗜酸性粒细胞生产(27)和类似网站(26),最终导致血液和组织嗜酸性粒细胞(4]。另一种观点,即eotaxin监管网络的一部分是由多个细胞群除了嗜酸性细胞和嗜碱性细胞,也建议观察各种各样的eotaxin效果,吸引中性粒细胞和巨噬细胞(包括其能力28)和平滑肌细胞(29日]。Eotaxin也由成纤维细胞(30.,31日),已经在几个设置与纤维化相关流程(32,33]。
在这种更广泛的框架内,我们已经进行了复查是否nonsensitized主机,eotaxin招募其他白细胞数量除了嗜酸性细胞和嗜碱性细胞,进一步检验其效果依赖5-lipoxygenase (5-LO),白三烯生产中的关键酶的嗜酸性粒细胞(17,27]。评估两个方面促使观察小鼠嗜酸性粒细胞,开发针对皮下植入不溶性抗原颗粒(34]。而ip的挑战与可溶性过敏原选择性移植接受者嗜酸性粒细胞招募到腹腔,这种效应被5-LO-activating蛋白抑制剂,MK886, 5-LO和重复的产品,LTB4,无论是eosinophil-selective。,重要的是,eotaxin复制过敏原的影响,也同样被MK886。同样出人意料的是LTB4的失败,一个强有力的嗜中性粒细胞化学引诱物,招募中性粒细胞,它有效地引起嗜酸性粒细胞过敏模型。这些观察提出了这样的可能性,嗜酸性粒细胞选择性效应的化学引诱物(eotaxin和LTB4)观察到体内依赖于主机被敏化。我们测试这个假说eotaxin首先,通过检查它的影响在一个天真的主机,以及5-LO封锁eotaxin的有效性的影响。我们报告eotaxin新兵混合白细胞人口天真的小鼠的腹腔和提供证据的重要作用5-LO和嗜酸性粒细胞的积累和功能激活中性粒细胞在这个模型。
2。材料和方法
2.1。试剂
RPMI 1640中(SH30011.01)和胎牛血清(SH30088.03)来自Hyclone(洛根,UT);青霉素100 U /毫升(PEN-B),链霉素100毫克/毫升(S9137),卵清蛋白(二年级和四年级),等张Percoll,并从Sigma-Aldrich Histopaque密度1.083解决方案(圣路易斯,密苏里州);重组小鼠Eotaxin(250 - 01)从PeproTech(落基山,新泽西);从研发和重组小鼠IL-5;mk - 886(475889) 1毫克/公斤从开曼群岛化学品(安阿伯市MI)、甲基纤维素溶解在0.1%,被作为胃内的丸体积0.2毫升(33]。老鼠anti-murine eotaxin单克隆中和抗体(克隆42285)和老鼠anti-murine IgG2a控制单克隆抗体与同形像(54447年克隆)来自研发(明尼阿波利斯、锰)。
2.2。动物和动物的处理
纯系小鼠,男性和女性,年龄在8 - 10周,防晒系数条件下提供CECAL-FIOCRUZ(里约热内卢)的以下特性:BALB / c;ALOX (5-LO-deficient)和pas - 129(野生型控制相同的背景)27];和BALB / c突变体缺乏一个增强器元素在启动子区域基因编码的GATA-1转录因子(35所需),嗜酸性粒细胞血统的决心(简称GATA-1老鼠,)。动物的住房,医疗,和处理遵循制度批准(CEUA L-010/04数量,CEUA L-002/09)协议。天真的动物收到eotaxin i.p。,in 0.2 mL of RPMI 1640 medium with Penicillin/Streptomycin. Controls received medium (RPMI). After the indicated times, animals were killed in a CO2室,腹膜灌洗进行10毫升冷冻RPMI。敏感的动物,看到部分2。6。
2.3。中和Eotaxin活动
50 ng eotaxin孵化了5μg anti-eotaxin中和抗体或5μg isotype-matched anti-IgG2a抗体,在200年的最后一卷μL,在注入前30分钟,每个BALB / c受体。4 h后,腹腔灌洗液注入小鼠体内的收集和处理如上详细。
2.4。收集、枚举和腹膜白细胞染色
腹膜灌洗细胞被洗RPMI 500×g和resuspended 2毫升。总数量后进行血细胞计数器1:10稀释在土耳其人的解决方案。微分项进行Giemsa-stained(冰冷的methanol-fixed、脱水和Giemsa-stained 5分钟)cytocentrifuge涂片(500 rpm, 8分钟Cytospin 3,热科学、沃尔瑟姆,MA),通过计算至少300个细胞在1000 x放大石油。
2.5。细菌和吞噬作用分析
我们使用不致病的大肠杆菌细菌(z博士提供的克隆DH5,塞·伐斯冈萨雷斯,他从印加FIOCRUZ,里约热内卢)转基因持续表达绿色荧光蛋白(GFP)基因,生长在磅肉汤。获得的细胞在BALB / c小鼠腹膜灌洗,引起eotaxin或RPMI受到细胞总数以及微分中性粒细胞计数如前所述。然后在黑暗中中性粒细胞孵化了30分钟,在室温下,与细菌1:400的比例。细胞被洗了,由此导致细胞悬液运行FACScalibur流式细胞分析仪(Immunocytometry正系统,圣何塞,CA),收购至少50.000事件,分析4.3软件的帮助下峰会(Dako Cytomation,英国)。
2.6。嗜伊红的程序
嗜酸性粒细胞转移研究表明,BALB / C, ALOX或不是老鼠敏化(100μg卵白蛋白四年级和1 6毫克明矾在400年最后一卷μL盐水/动物,2 s . c .背部注射,0到7天)和挑战(卵白蛋白四年级,1μg在400年μL在第14天盐水ip)根据Ebihara和他的同事们(36]。骨髓是收集后48 h ip挑战,检查,和培养其他地方如前所述37]。短暂,骨髓的文化建立了5天在37°C在空中95% / 5%二氧化碳,在RPMI1640, 10%的边后卫和5 ng / mL IL-5,文化的密度细胞/毫升。不依从细胞上被收集并加载3毫升histopaque - 1083解决方案,紧接着在400×g离心,20°C, 35分钟,没有刹车。单核细胞环和上层清液被丢弃;granulocyte-rich颗粒收集,清洗和3毫升RPMI resuspended,用于总和微分计算如上所述。暂停中嗜酸性粒细胞≥80%,没有中性粒细胞,和小污染物人口仅由巨噬细胞,不干扰传输实验的解释。表示,天真GATA-1、ALOX或不是收件人老鼠注射吗嗜酸性粒细胞的合适的捐赠者i.p(见下文)。,followed by eotaxin 50 ng/mL, and leukocyte accumulation was monitored in the peritoneal lavage fluid 4 h after eotaxin injection, as above.
流仪研究CCR3的表达式,采用以下修改此协议,对它产生了高纯度的嗜酸性粒细胞:致敏小鼠挑战两次,最初由气溶胶暴露(1 h,卵白蛋白II级,2.5%,w / v, 14天)和7 h后可溶性卵白蛋白i.p。(四年级,1μg在400年μL盐水)。骨髓收集气溶胶挑战,培养后24小时以上,分离后Percoll梯度(75% / 60% / 45%,等张Percoll 100×g, 20分钟,室温)。45% / 60%的造血细胞接口(38)是培养IL-5浓度较低(2.5 ng / mL)的两倍长(10天),产生一个包含至少95%的嗜酸性粒细胞的人口,与成熟的形态。污染物在第十天退化(不能存活的)单核细胞和基质细胞。
2.7。统计分析
所有的数据进行了分析与Systat Windows 5.04(美国Systat Inc . Everston, IL),使用双尾t以及对成对比较。表示,方差分析也用于多个比较,与图基HSD校正和Bonferroni调整组平等和不平等的大小,分别。
3所示。结果
3.1。混合Eotaxin引起的白细胞游走
我们最初检查腹腔注射不同剂量的eotaxin是否招募嗜酸性粒细胞相对较短的时间内(4 h)和嗜酸性粒细胞积累是否会有选择性,如前所观察到激活的老鼠,或伴有其他白细胞迁移人口。如图1(一),白细胞累积50和100 ng /腔eotaxin,大量RPMI显著不同的控制(0 ng /腔)以及低剂量的eotaxin(10到25 ng /腔)。这些白细胞包括变量数量的嗜酸性粒细胞(图1 (b))、单核细胞/巨噬细胞(39,40)(图1 (c))和中性粒细胞(图1 (d))。所有三个白细胞数量的形态学辨认没有歧义,如一个代表性的显微照片(补充图1所示的网上http://dx.doi.org/10.1155/2014/102160)。淋巴细胞和嗜碱细胞迁移并没有显著的这些剂量(没有显示)。,重要的是,中性粒细胞和巨噬细胞数量大大超过嗜酸性粒细胞计数,分别为8.2和9.9倍大的所示的实验中。为所有三个白细胞数量,相同的剂量反应关系,并在随后的实验中50 ng / mL用作标准刺激,因为没有改善观察高剂量。
(一)
(b)
(c)
(d)
尽管招募白细胞人口的异质性,eotaxin与特定的单克隆抗体的中和了白细胞积累-控制水平(图2;与图1(一)为0-25 ng eotaxin剂量范围),而控制相同的同形像不相关的特异性抗体没有效果。这证实了招聘的所有三个白细胞数量的刺激是eotaxin本身,没有任何身份不明的污染物,通过定义不会被特定的中和抗体。
的招聘动力学混合白细胞eotaxin人口的天真的BALB / c小鼠显示了重要的积累早在2 h,最多4 h,此后下降但剩下的12和24小时(图3(一个))。我们可以观察到早期的嗜酸性粒细胞(重要从2 h和剩下的所以在12和24小时,图3 (b))。相比之下,积累的单核细胞/巨噬细胞(图3 (c))和中性粒细胞(图3 (d)只在4 h)成为重要的。重要的积累也观察到12和24小时12 h单核细胞/巨噬细胞和中性粒细胞。因此,单核细胞/巨噬细胞和中性粒细胞聚集后嗜酸性粒细胞条目。嗜酸性粒细胞比中性粒细胞,但单核细胞/巨噬细胞,在观察期间。为后续实验,4 h观察时间被选中,因为它显示显著积累的嗜酸性粒细胞,单核细胞/巨噬细胞和中性粒细胞在天真的BALB / c小鼠。
(一)
(b)
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(d)
3.2。关系5-LO
我们第一次评估的影响eotaxin天真的BALB / c小鼠使用皮瓣抑制剂MK886或车辆。由eotaxin MK886废除混合白细胞招募(图4(一))。相比之下,vehicle-pretreated控制动物显示显著的白细胞招募。MK886非常有效预防嗜酸性粒细胞聚集(图4 (b))。BALB / c小鼠回应eotaxin 4 h,积累大量单核细胞/巨噬细胞由MK886废除(图4 (c))。MK886-pretreated BALB / c小鼠没有表现出中性粒细胞迁移eotaxin,迁移是重要的在vehicle-treated控制(图4 (d))。
(一)
(b)
(c)
(d)
接下来,我们评估的影响在天真ALOX eotaxin老鼠,缺乏5-LO,野生型不控制。在ALOX老鼠,eotaxin对白细胞总数没有显著影响。相比之下,大量招聘不是控制(图中观察到5(一个))。重要的是,ALOX老鼠,不像不是控制,显示没有明显的嗜酸性粒细胞招聘(图5 (b))。在这种遗传背景,与BALB / c不同,没有明显的单核细胞/巨噬细胞招聘eotaxin观察在这个时间点(4 h;图5 (c)),不管老鼠5-LO-deficient或野生型;此外,单核细胞/巨噬细胞在ALOX人数高于不是老鼠。相比之下,中性粒细胞招募在不重要的控制和抑制≈55% ALOX老鼠,但残余中性粒细胞招募依然显著(图5 (d))。在一起,这些观察结果显示,在这种遗传背景,嗜酸性粒细胞,中性粒细胞的要求不同5-LO eotaxin,迁移是总前只有部分后者。
(一)
(b)
(c)
(d)
3.3。Eosinophil-Dependent嗜中性粒细胞和单核细胞/巨噬细胞迁移
动力学混合天真的BALB / c小鼠白细胞招聘提出的问题是否eotaxin-stimulated嗜酸性粒细胞招募其他类型的白细胞。如果是这样,中性粒细胞和单核细胞/巨噬细胞迁移在回应eotaxin将没有嗜酸性粒细胞减少。因为天真的老鼠携带的高亲和性GATA-1结合位点的突变基因的启动子编码GATA-1转录因子缺乏嗜酸性粒细胞(4),我们评估了eotaxin对白细胞的影响数字4 h ip注射后GATA-1突变小鼠和BALB / c野生型控制。GATA-1小鼠,与BALB / c控制,白细胞数量的腹膜腔没有显著增加了eotaxin(图6(一))。正如所料,嗜酸性粒细胞被察觉GATA-1老鼠,和有效地招募了eotaxin在BALB / c控制(图6 (b))。RPMI-treated和eotaxin-treated GATA-1小鼠单核细胞/巨噬细胞(白细胞常住人口是主要的)两倍多的RPMI-treated BALB / c控制(图6 (c)),达到数量同那些生活在eotaxin-treated BALB / c。重要的是,中性粒细胞数没有显著增加了eotaxin(图6 (d))GATA-1小鼠,与BALB / c控制,表明嗜中性粒细胞招聘通过eotaxin eosinophil-dependent。排除的可能性在这个应变中性粒细胞迁移是有缺陷的,单独控制GATA-1老鼠注射巯乙酸汤,导致强烈的中性粒细胞在4小时内积累。GATA-1巯乙酸和BALB / c小鼠同样回应(未显示),表明失败GATA-1小鼠中性粒细胞招募的eotaxin反应的特性,不是一般的缺陷在中性粒细胞迁移的证据。
(一)
(b)
(c)
(d)
(e)
(f)
(g)
(h)
(我)
我们进一步探讨这个问题通过重组GATA-1小鼠腹膜嗜酸性粒细胞人口转移的纯度(90%)BALB / c嗜酸性粒细胞,缺乏嗜中性粒细胞的污染。总白细胞数没有显著不同GATA-1老鼠给eotaxin,嗜酸性粒细胞,或者eotaxin +嗜酸性粒细胞(图6 (e)),这是由单核细胞/巨噬细胞计数十分吻合,占所有组(图中最白细胞6 (f))。正如所料,可以恢复GATA-1接受者的嗜酸性粒细胞嗜酸性粒细胞,eotaxin并没有大幅增加它们的数量,作为接受者产生没有自己的嗜酸性粒细胞(图6 (g))。重要的是,中性粒细胞数明显增加了嗜酸性粒细胞转移和进一步显著增加协会的嗜酸性粒细胞转移和eotaxin(图6 (h))。在一起,这些数据表明,在天真的老鼠嗜酸性粒细胞调解eotaxin引起的中性粒细胞的积累。
前面所显示的结果,如果中性粒细胞和单核细胞/巨噬细胞积聚在GATA-1老鼠嗜酸性粒细胞活化的结果,而不是直接接触eotaxin,应该期望从腹腔白细胞收获GATA-1小鼠显示CCR3的很少或根本没有表达,与嗜酸性粒细胞。我们因此而腹膜灌洗CCR3的表达白细胞从BALB / c和GATA-1老鼠收集4 h eotaxin注射后(图6(我))。平均荧光强度在粒细胞监控区域,因为我们的传输协议重组中性粒细胞迁移,而不是单核细胞/巨噬细胞(见上图)。没有观察到eotaxin-induced招聘CCR3 +粒细胞GATA-1老鼠(虚线),与BALB / c小鼠(细线)。确保CCR3 +细胞检测,如果出现在一个暂停GATA-1粒细胞,我们还增加了纯化BALB / c嗜酸性粒细胞GATA-1白细胞作为控制(图6(我)粗线)。体内添加CCR3 +细胞很容易检测到在这些条件。
我们利用嗜酸性粒细胞转移的有效性检查的关系5-LO嗜酸性粒细胞的迁移,以及二次招募中性粒细胞和单核细胞/巨噬细胞。混合白细胞数量累积的腹膜腔ALOX收件人不是嗜酸性粒细胞(图7(一)),4 h后eotaxin管理局。没有观察到显著的改善不是收件人不是嗜酸性粒细胞在相同的条件下,表明在ALOX招聘是有效的收件人在野生型。招募白细胞的数量从ALOX收件人包括嗜酸性粒细胞(图7 (b)),包括嗜酸性粒细胞和那些被eotaxin政府转移到接受者,再次达到水平可比的不是收件人不是嗜酸性粒细胞。二次招募巨噬细胞(图的观察7 (c))和中性粒细胞(图7 (d)),类似的效果相比,不是不转移。
(一)
(b)
(c)
(d)
(e)
我们下一个检查是否这个模型的关键步骤要求5-LO最初的嗜酸性粒细胞的积累,而不是二级招募中性粒细胞,嗜酸性粒细胞。如果是这样的话,人会预测ALOX嗜酸性粒细胞的直接转移到eosinophil-deficient GATA-1接受者应该在应对eotaxin恢复中性粒细胞积聚。当从ALOX骨髓净化嗜酸性粒细胞文化被转移到GATA-1接受者(图7 (e)),招募中性粒细胞是非常有效的。这个规则的可能性极度依赖5-LO步生成的嗜酸性粒细胞嗜中性粒细胞化学引诱物。另一方面,如上所示为BALB / c嗜酸性粒细胞转移到GATA-1接受者,单核细胞/巨噬细胞并没有增加ALOX嗜酸性粒细胞转移在这个时间点。
3.4。影响粒细胞与细菌
我们进一步检查是否eosinophil-mediated反应eotaxin在这个模型中有影响的能力其次招募中性粒细胞和细菌的目标。,混合引起的白细胞数量eotaxin (RPMI控制)收集从天真的BALB / c小鼠在注射后4 h,统计,和混合与GFP-expressing 30分钟大肠杆菌在细菌/白细胞比例调整到400:1,之前通过流式细胞术分析。细胞粒细胞地区封闭的大小和复杂性的基础上,进行绿色荧光,结果从绑定和内化的细菌。图8(一个)表明eotaxin-stimulated粒细胞绑定/内化荧光大肠杆菌细菌比来自RPMI-injected更有效地控制老鼠。效率的提高可检测作为一个增加粒细胞绑定细菌(图的分数8 (b)(图)和增加平均荧光强度8 (c))。这表明eosinophil-mediated招募中性粒细胞伴随着增加绑定和/或摄取能力的细菌。
(一)
(b)
(c)
4所示。讨论
我们在这里描述混合白细胞积累发生在腹腔注射eotaxin天真的老鼠。据我们所知,这是第一个实验证据招募中性粒细胞和巨噬细胞在nonsensitized eotaxin动物是由嗜酸性粒细胞。对中性粒细胞,招聘是绑定/摄取细菌增加能力,因此可能会在特定条件下影响抗菌防御。因为嗜酸性粒细胞作为有效的抗菌防御的能力是有限的稀缺,这些发现也突出条件,通过招募大量细胞良好的杀菌剂的函数,嗜酸性粒细胞实际上克服这种理论上的缺点。
下面我们将解决一些重要的特定点让我们在一个合适的角度观察。
4.1。角色的Eotaxin Eotaxin受体和嗜酸性粒细胞
所有三种类型的白细胞的迁移BALB / c小鼠被eotaxin诱导,如图所示,相同的剂量反应关系和重叠的动力学,以及与特定的抗体中和eotaxin相同的影响。这个迁移到CCR3的表达的关系,相比之下,比较复杂。淋巴细胞,其中一些已被证明由他人来表达CCR3 [41,42),没有受到eotaxin天真的小鼠的腹腔重要的数字。另一方面,尽管人们普遍认为CCR3表达仅限于嗜酸性粒细胞(4,18,20.,22,23),嗜碱粒细胞(24,25),嗜酸性粒细胞和嗜碱细胞祖细胞/前体(26,27),T细胞亚群(41,42],平滑肌细胞(29日),几项研究表明,人类和小鼠中性粒细胞和巨噬细胞也可以表达CCR3,至少在特定的实验设置(28,32中性粒细胞[],所建议的研究43]。这将意味着所有三个白细胞数量在我们的研究证明是招募野生型(BALB / c, PAS)小鼠可以简单地回应eotaxin绑定CCR3在单个细胞层面,没有涉及嗜酸性粒细胞的细胞相互作用的贡献。如果是这样的话,应该没有通过消除嗜酸性粒细胞,中性粒细胞和巨噬细胞积累减少,但一个人应该期望中性粒细胞和巨噬细胞表达CCR3在显著水平即使在eosinophil-deficient GATA-1老鼠。这种可能性,然而,直接排除了示范,eotaxin GATA-1突变小鼠不招募中性粒细胞和巨噬细胞。细胞间的相互作用在中性粒细胞反应的证据eotaxin强化了实验使用相同的应变,这显示中性粒细胞招募后转移高纯度BALB / c嗜酸性粒细胞。最后,我们观察到无显著积累CCR3 +粒细胞eotaxin-injected GATA-1老鼠。
相比之下,GATA-1小鼠腹腔巨噬细胞数量的持续增加,由4 h eotaxin影响政府,既与无嗜酸性粒细胞和转移。GATA-1突变可能影响细胞功能,组织分布、和/或周转率单核细胞/巨噬细胞,防止反应eotaxin,无论这些是介导的嗜酸性粒细胞。因此,我们不能从我们目前的观测结论仅在GATA-1老鼠,嗜酸性粒细胞招募单核细胞/巨噬细胞。单核细胞/巨噬细胞是嗜酸性粒细胞招募的直接证据,然而,通过嗜酸性粒细胞的不是捐助者转移到ALOX老鼠。重要的是,在缺乏嗜酸性粒细胞转让、ALOX老鼠嗜酸性粒细胞和单核细胞/巨噬细胞由eotaxin招聘。有趣的是,尽管在直接刺激协议ALOX老鼠像GATA-1老鼠,在缺乏单核细胞/巨噬细胞积累4 h,很可能不同的机制构成这些类似的结果,因为(a)类似的故障响应eotaxin单核细胞/巨噬细胞聚集在野生型不是控制,因此不能归因于缺乏活跃5-LO;(b)实验表明,嗜酸性粒细胞转移转移不是捐助者允许单核细胞/巨噬细胞的一个重要招聘eotaxin ALOX接受者。这些观察表明,一个活跃的5-LO不是必需的单核细胞/巨噬细胞(或中性粒细胞)回应eotaxin,嗜酸性粒细胞存在提供。
总的来说,数据表明eotaxin新兵混合白细胞人口天真的老鼠通过一种机制依赖于嗜酸性粒细胞。提供的证据表明,嗜酸性粒细胞发挥积极作用是全面影响的观测需要嗜酸性粒细胞和嗜酸性粒细胞转移实验eotaxin,不会预期如果嗜酸性粒细胞仅仅扮演了一个被动或宽松的角色。另一方面,在转移实验中约10%的转移嗜酸性粒细胞恢复了4 h eotaxin刺激接受者。这就提出了一个问题,是否剩余转移嗜酸性粒细胞接受改变脱粒等(4)或细胞外释放陷阱(10),这可能代表一个显著差异相对于直接(nontransfer)协议在最初的实验中使用。
4.2。5-LO的作用
混合白细胞eotaxin招聘的天真的小鼠显示了相同的依赖5-LO在致敏小鼠观察选择性嗜酸性粒细胞招募。因此,嗜酸性粒细胞积累本身,很可能在这两个模型,共享特性是5-LO-dependent一步。这是符合ALOX嗜酸性粒细胞的观察,当直接移植到腹腔GATA-1接受者(无法应对eotaxin中性粒细胞)的积累,能够调节中性粒细胞招聘eotaxin引起的。重要的是,进一步招聘嗜酸性粒细胞发生在eotaxin-stimulated ALOX收件人不是嗜酸性粒细胞,轴承,唯一的细胞功能5-LO转移嗜酸性粒细胞。这表明,嗜酸性粒细胞可源以及目标5-LO通路产品,如LTB4。LTB4以前有选择地吸引嗜酸性粒细胞,模型中eotaxin 5-LO-dependent方式复制的影响抗原(33]。此外,有明显的证据表明,招聘涉及细胞因子之间的相互作用和脂质介质(44]。LTB4代表一个信号继电器在中性粒细胞迁移,提高的可能性,它同样在嗜酸性粒细胞(45]。无论机制有关,嗜酸性粒细胞生成5-LO-derived中性粒细胞化学引诱物不需要eotaxin-injected eosinophil-dependent二级招募中性粒细胞的天真的老鼠。在先前的研究致敏小鼠、LTB4抗原和eotaxin,选择性地招募了嗜酸性粒细胞(34),它还有待决定快速嗜酸性粒细胞占招聘的腹膜腔eotaxin-injected nonsensitized老鼠在目前的研究中。进一步调查的一个相关的问题是是否需要5-LO有效性的增加细菌绑定在BALB / c白细胞中发现,作为LTB4激活以及吸引中性粒细胞(45]。
4.3。先天和后天免疫的关系
尽管常见要求5-LO,白细胞招募eotaxin天真与致敏小鼠之间在几个方面有所不同,尤其是缺乏嗜酸性粒细胞选择性前者,而不是后者。在致敏小鼠,观察选择性嗜酸性粒细胞招募广泛不同的化学刺激(过敏原,eotaxin或LTB4)。不太可能,因此,这种选择性eotaxin反映出一些特征信号和更少的LTB4信号(这应该是非常有效的正常小鼠中性粒细胞数量)。另外,eotaxin的失败和LTB4招募中性粒细胞和单核细胞/巨噬细胞在致敏小鼠可能包括粘附蛋白的表达变化在内皮表面,这将阻止他们的移民从血管到腹腔,无论LTB4或eotaxin化学引诱物。我们没有研究这种可能性,因为我们目前的观察,集中在nonsensitized动物的反应,不依赖于澄清机制并不适用于现状。
我们认为我们的研究结果是先天免疫的表现,因为(a)嗜酸性粒细胞和嗜中性粒细胞积累的快速动力学;(b)招募中性粒细胞和巨噬细胞在缺乏重要的淋巴细胞积累;(c)活细胞外细菌的检测增加粒细胞绑定在缺乏抗体。另一方面,单核细胞/巨噬细胞的快速招聘eotaxin-exposed嗜酸性粒细胞提出的问题是否嗜酸性粒细胞也可以提高保护更专门的病原体,如胞内分枝杆菌和原生动物引起慢性感染,这通常是由单核细胞/巨噬细胞。较少受到关注的可能性,嗜酸性粒细胞在战斗中发挥作用的微生物病原体的帮助下其他类型的白细胞。我们的观察表明,少量嗜酸性粒细胞可能招募大量中性粒细胞和巨噬细胞浸润。而这将使嗜酸性粒细胞出奇的有效玩家在先天免疫,这可能矛盾掩盖他们的贡献,如果他们的贡献被视为符合它们的数量在炎症浸润,他们常常总白细胞的数量不超过十分之一。因此,幸运的是,在实验的野生型和突变体嗜酸性粒细胞转移到eosinophil-null GATA-1老鼠,嗜酸性粒细胞招募中性粒细胞可以明确表明。的天真和致敏模型之间的差异在这方面,它是确定这是否感兴趣的嗜酸性粒细胞功能的过敏原致敏能力修改主机和这样的先天免疫功能的变化是否可以重复的被动或主动地通过敏化主机。
4.4。可能的细胞机制嗜酸性粒细胞的作用
一些,但不是全部,观察报道与之前的研究相一致,由其他组在不同的实验模型。Eotaxin招聘混合白细胞的人口,包括中性粒细胞和巨噬细胞,是人体中描述28];达斯和他的同事们(46)报道,eotaxin时有效注入小鼠的腹腔中但不背空气袋,将人们的注意力吸引到重要的区别网站应对定义的相同的化学刺激的挑战。反应后的空气袋发生局部接种桅杆cell-containing腹膜细胞的数量,但过敏原致敏是必要的地方应对eotaxin这转移模型。此外,嗜中性粒细胞迁移陪同在特定条件下招聘的嗜酸性粒细胞。哈里斯和他的同事们(47)证实,肥大细胞是重要的充分反应eotaxin,进一步表明eotaxin反应被5-LO抑制剂。这些研究表明eotaxin有效性是限制体内由几个因素可能缺席体外(e . g。、迁移室或流仪)的研究。这些限制包括肥大细胞和5-LO。然而这些发表的研究,评估自己招募的嗜酸性粒细胞的贡献。
我们建议一种细胞因子,而不是5-LO导数,嗜酸性粒细胞释放的腹腔,一旦他们已经被eotaxin积极5-LO的存在,或者,或者,直接接种腔通过传输协议。候选人将包括细胞因子TNF -α和TGF -β1,两个强有力的中性粒细胞化学引诱物。一个假设可以协调我们的观察与Das和哈里斯和他们的同事46,47)需要放大的作用与居民腹腔肥大细胞,嗜酸性粒细胞通过交互由于肥大细胞中性粒细胞化学引诱物的重要来源,包括TNF -α(48]。
利益冲突
作者宣称没有利益冲突有关的出版。
确认
本文由奖学金支持从CNPq accf(本科奖学金,PIBIC-UFRJ),里卡多·阿尔维斯Luz(博士生奖学金),和佩德罗Xavier-Elsas和玛丽亚Ignez五车二Gaspar-Elsas(研究生产力奖学金)研究经费从CNPq(没有。470377/2011-9 Edital通用)和FAPERJ (E-26/103.138/2011 Cientista Nosso Estado)和e - 26 - 112.694 - 2012协作网络佩德罗Xavier-Elsas免疫调制剂。由于他们同样重要贡献的执行和设计实验,分别里卡多·阿尔维斯Luz和佩德罗Xavier-Elsas应视为共同第一作者。作者希望表达他们的负债博士Sergeijs Berdnikovs,芝加哥大学有用的意见和建议,以及坚定的鼓励在这方面的研究。
补充材料
补充图:代表图像的混合收集到的BALB / c小鼠白细胞浸润,4 h i p .注射后50 ng eotaxin染色和染色。在中间,一个嗜酸性粒细胞,辨认orange-stained细胞质和环状的核,没有细分。字段包含三个中性粒细胞,辨认显然苍白的细胞质染色和分段核,从强烈的彩色,凝聚染色质固缩。在中心有一个可辨认的淋巴细胞。字段包含许多细胞与单核细胞/巨噬细胞形态、大于粒细胞,显示clearly-stained细胞质,椭圆或圆形的细胞核与松散凝聚染色质。在相同的页面上,请注意,图6(我)已经被修改的方式为读者很难确定哪些或显示的两个连续线厚,薄,显得非常相似。我建议你把文件寄给你,以确保你,粗线的连续线越高,并且没有混淆,并试着描述这两个连续的行更独特的方式,以避免混淆读者。
