文摘

脂肪组织秘密发病和脂肪酸,这可能导致肥胖相关血管功能障碍和心血管疾病的风险。这项研究调查了哪些因素的协同效应负责adipokine和油酸(OA)诱导人血管平滑肌细胞(VSMC)增殖。Adipocyte-conditioned介质(CM)从人类脂肪细胞诱导VSMC的增殖相关的血管内皮生长因子(VEGF)的内容。厘米增加VEGF受体(VEGF-R) 1和2表达和VSMC的VEGF的分泌,而OA仅刺激VEGF的分泌。VEGF中和废除CM - OA-induced核扩散和大大降低扩散引起的CM和OA的组合。从内脏脂肪组织VEGF释放更高(增值税)的肥胖受试者相比,皮下脂肪组织(坐)和增值税从精益控制。此外,VEGF释放增值税与增殖的影响。血管周的2型糖尿病患者脂肪组织(PAT)释放显著更高数量的VEGF和诱发更强的VSMC增殖而坐,坐/ PAT刻意。总之,VEGF是调解CM-induced VSMC的增殖。从增值税这adipokine释放大量的肥胖病人和帕特的糖尿病患者,VEGF可能链接VSMC增殖增加脂肪组织炎症。

1。介绍

肥胖已经成为一个主要的全球健康问题,尤其是在工业化国家,并与许多代谢相关疾病和继发性并发症,包括胰岛素抵抗、2型糖尿病、动脉粥样硬化和心血管疾病(1]。完善,脂肪组织是一个内分泌器官释放脂质介质和各种蛋白质,所谓的发病(2]。越来越多的证据表明,肥胖是导致慢性低度系统性炎症状态(3,4)导致肥胖相关血管功能障碍和心血管疾病的风险5]。肥胖是人类强烈相关的动脉粥样硬化的发展以及在各种动物模型6,7]。在这种背景下,内脏肥胖带来的最高风险代谢和心血管疾病的发展8]。特别是在血管疾病的病理生理学,血管周围脂肪组织可能发挥重要作用,因为几乎所有的血管周围脂肪仓库,以及血管周围脂肪细胞因事实不分离血管壁的解剖屏障,发病的分泌的脂肪仓库可能提供一个新的肥胖和血管并发症之间的联系(9]。然而,直到现在,机制如何内脏和血管周的脂肪提高代谢和心血管疾病的风险并不是完全瓦解。除了内皮细胞、血管平滑肌细胞(VSMC)代表的一个主要的细胞类型的血管壁的血管壁保持体内平衡。动脉壁增厚是由迁移的VSMC媒体内膜及其伴随的扩散。我们先前建立的模型adipocyte-conditioned介质(CM)诱导VSMC增殖(10]。厘米的组合与油酸(OA)增加扩散通过感应伊诺表达以协同的方式,没有生产,促炎的信号。然而,直到现在的机制和因素,负责异常VSMC增殖诱导脂质介质和发病,还没有完全理解。因此,本研究的主要目的是识别潜在的候选人,调解脂肪组织之间的串扰和VSMC潜在连接肥胖和动脉粥样硬化。使用成对的内脏和皮下脂肪组织活检(增值税和坐)以及血管周围脂肪组织(PAT)来源于精益,肥胖,2型糖尿病和肥胖的患者,本研究也针对有关在体外发现更多的生理环境。我们的研究表明,血管内皮生长因子(VEGF)厘米呈正相关内容CM-induced VSMC增殖和VEGF中和完全废除厘米——OA-induced扩散。厘米,VEGF的规范表达VEGF受体(VEGF-R) 1和2。分泌的输出从增值税和帕特肥胖2型糖尿病患者和/或包含大量的VEGF和刺激增殖和VEGF-R1/2表达而坐。

2。材料和方法

2.1。材料

试剂由Amersham了sds - page法玛西亚生物技术(德国布伦瑞克)和σ(德国慕尼黑)。多克隆抗体针对VEGF-R 1和2是由细胞信号技术(德国法兰克福)和anti-actin抗体来自Abcam(英国剑桥)。血管内皮生长因子(VEGF)中和通过预处理与1厘米μ从研发系统g / mL VEGF-neutralizing抗体(Wiesbaden-Nordenstadt、德国)1小时。HRP-conjugated山羊anti-rabbit和山羊anti-mouse免疫球蛋白抗体来自Promega(德国曼海姆)。胶原酶NB4是来自美国赛瓦(德国海德堡)。Troglitazone和BSA(分数V、自由脂肪酸、低内毒素)获得从σ(慕尼黑,德国)。人类重组VEGF从微孔购买GmbH (Schwalbach,德国)。细胞增殖ELISA (BrdU化学发光)和蛋白酶抑制剂鸡尾酒平板电脑来自罗氏公司(德国曼海姆)。VEGF ELISA试剂盒购自BioVendor GmbH(德国海德堡)。FCS是由Gibco(美国卡尔斯巴德表达载体)。钠盐的OA(σ,慕尼黑,德国)溶解在水中6毫米原液和无菌进一步稀释血清VSMC中含有4% BSA (wt / v)耦合。办公自动化应用于VSMC在100年最终浓度μmol / L 18 h。所有控件的实验涉及脂肪酸与BSA单独对待。所有其他化学试剂均最高的分析纯商业化从σ购买。

2.2。文化人类脂肪细胞和厘米的一代

皮下脂肪组织是来自健康的瘦或适度超重女性( 、体重指数(BMI) 岁, 年)接受整形手术。伦理委员会批准的程序Heinrich-Heine-University(德国的杜塞尔多夫)。所有受试者健康免费药物和没有按照常规实验室检测代谢疾病的证据。Preadipocytes被胶原酶消化分离脂肪组织由美国(如前所述11]。播种preadipocytes被诱导分化成脂肪细胞在15天由我们(如前所述10]。分化的程度是由油红染色和脂联素的诱导。分化脂肪细胞被用于生成adipocyte-CM,最近被我们(12]。简而言之,CM VSMC培养48 h脂肪细胞的生成基础培养基(PromoCell) 50 ng / mL两性霉素b和50μ克/毫升庆大霉素。每厘米检测其增殖作用和脂联素的内容(扩散)负相关10]。更详细地描述厘米被我们前面描述的12,13]。厘米的产生在体外分化的脂肪细胞是用于所有实验数据1和2。

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图1
CM-induced增殖是由VEGF介导的。(一)VSMC血清饥饿24 h和随后孵化与厘米,100μmol / L OA或厘米和OA的BrdU 18 h。BrdU进入DNA测量。数据是表示相对于控制,为100%。数据平均值±SEM的三个独立的实验。* 相对于控制或指定的治疗。(b)厘米的增殖效果明显与VEGF相关内容以ELISA。统计线性回归分析的结果显示在图。(c) VSMC血清饥饿24 h和随后孵化250 pg / mL VEGF, 100μmol / L OA、VEGF和OA的BrdU 18 h。BrdU进入DNA测量。数据是表示相对于控制,为100%。数据平均值±SEM的三个独立的实验。* 相对于控制或指定的治疗。(d-f) VSMC对待厘米,OA, 24小时的组合。总细胞溶解产物通过sds - page及免疫印迹来解决与特定VEGF-R1和2抗体。一个代表性的污点。数据平均值±SEM的三个独立的实验。所有数据归一化到肌动蛋白表达和表达水平相对于控制。
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图2
VEGF中和防止CM - OA-induced扩散。细胞治疗的250、500和1000 pg / mL VEGF (a),厘米,OA和CMOA (b和d),因此VEGF, OA, VEGFOA (c)中描述的传奇人物1存在与否的一个特定的中和VEGF抗体24 h。(a - c) BrdU并入DNA决心按照传奇人物1。数据表示相对于控制。(d)总细胞溶解产物通过sds - page及免疫印迹来解决与特定VEGF-R1抗体。VEGF-R1,车道从单个蛋白质印迹切除并显示在当前的秩序。数据平均值±SEM的三个独立的实验。所有数据归一化到肌动蛋白表达和表达水平相对于控制。* 与未经处理的控制或指定的数据。
2.3。一代的厘米从外植体的坐,增值税和帕特

成对活检从皮下和内脏脂肪组织(SAT)(增值税)获得精益患者非糖尿病( ,身体质量指数(BMI) 公斤/米2岁的 ),没有糖尿病的肥胖病人( ,体重指数 公斤/米2岁的 年)和肥胖的2型糖尿病患者( ,体重指数 公斤/米2岁的 年)疝等择期手术,胆囊手术,检测不到发炎和其他迹象和良性的原因。人类血管周的(PAT),坐在活检获得的2型糖尿病患者( ,体重指数 公斤/米2,享年 年)和无2型糖尿病患者( ,体重指数 公斤/米2,享年 年)接受冠状动脉搭桥手术。在糖尿病状态的信息可从患者的医疗记录。帕特收集从冠状动脉和用于生成CM描述(14,15)使用100毫克的脂肪组织外植体产生1毫升的厘米。24 h后,厘米被收集并存储在整除−80°C,直到进一步的使用。厘米从坐,增值税是生成用于所有实验呈现在图3来自坐,厘米,帕特用于所有实验呈现在图4。

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图3
VEGF释放高从增值税相关的肥胖受试者诱导VSMC增殖。厘米(a) VEGF含量从增值税,ELISA测定坐在重复。(b和d) VSMC服用厘米从配对坐和增值税的精益非糖尿病患者(ND),肥胖和2型糖尿病和肥胖的(新)患者24 h。(d),对VSMC VEGF-neutralizing抗体的存在与否。VSMC增殖是由测量BrdU到DNA的整合。数据表示相对于基底控制价值,这是设置为100%。数据提出了均值±SEM从五个独立的实验。(d),所有数据归一化到肌动蛋白表达和表达水平相对于控制* 相对于控制或指定的数据。(d),车道切除从单个免疫印迹和显示在订单。(c)厘米从增值税相关的增殖效果明显的VEGF内容以ELISA。统计线性回归分析的结果显示在图。
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图4
VEGF释放从帕特高的2型糖尿病患者与VSMC增殖和VEGF-R1/2表达相关。厘米(a) VEGF含量从帕特,ELISA测定坐在重复。(b) VSMC治疗与CM的配对和帕特坐在2型糖尿病患者(新)和刻意控制(ND) 24 h。扩散是由测量BrdU到DNA的整合。数据表示相对于基底控制价值,这是设置为100%。数据提出了均值±SEM从五个独立的实验。(汉英)总细胞溶解产物通过sds - page及免疫印迹来解决与特定VEGF-R1和2抗体。数据平均值±SEM三到五个独立的实验。所有数据归一化到肌动蛋白表达和表达水平相对于控制。* 相对于控制或指定的数据。
2.4。文化人类血管平滑肌细胞(VSMC)

主要从PromoCell获得人类冠状动脉VSMC(德国海德堡)。VSMC从四个不同的捐助者(高加索,男,23岁,31岁和40岁;女性,56岁)被用作subconfluent细胞通道3。细胞被认为是VSMC由形态学标准和疣状平滑肌α肌动蛋白。

2.5。在体外分析VSMC增殖

监控DNA合成,VSMC被播种在96 -文化菜和允许附加24 h,紧随其后的是血清饥饿为额外的24小时周期。细胞被刺激了18 h上面列出的BrdU (10μ米)。每15毫米10.000 VSMC²孵化有35.000厘米的脂肪细胞。BrdU的酶联免疫试剂盒用于确定扩散根据制造商的协议。信号被可视化和评估光民成像仪工作站(勃,曼海姆,德国)。

2.6。免疫印迹

VSMC被视为表示包含50 mM玫瑰和细胞溶解在缓冲,pH值7.4,1% TritonX100,完整的蛋白酶抑制剂,和PhosStop磷酸酶抑制剂鸡尾酒。在4°C孵化2 h后,暂停离心机在10.000 g为15分钟。此后,5μg蛋白的溶解产物分离使用水平10% sds - page凝胶和转移到聚乙二烯氟化物过滤器在半干的吸水装置(16]。与Tris-buffered盐水过滤器被封锁,包含0.1%的渐变和5%的脱脂奶粉,一夜之间,随后孵化1:1000稀释适当的抗体。洗后,过滤器与二次孵化HRP-coupled抗体和加工使用止动剂增强化学发光检测合衬底(美国Billerica微孔)。信号被可视化和评估VersaDoc工作站(Bio-Rad实验室、德国慕尼黑)。

2.7。报告的数据和统计数据

数据表示为±SEM。单向方差分析(事后测试:Bonferroni多重比较检验)是用来确定统计学意义。所有统计分析都使用棱镜(美国拉霍亚GraphPad)考虑 值小于0.05的统计学意义。相应的数据重要性水平表示。

3所示。结果

3.1。VEGF CM与CM-Induced扩散有关的内容

我们曾表明,厘米在体外分化人类脂肪细胞诱导人类冠状动脉VSMC增殖的大部分CMs测试诱导显著超过2倍而扩散控制(10]。而厘米和OA诱导同样强烈的VSMC增殖,增加了他们的组合协同的方式扩散(图1(一)),先前报道(10]。厘米的增殖作用与脂联素浓度负相关,但与il - 6厘米(不存在相关性10]。内容关联厘米CM-induced扩散增长的诱导因素,我们发现CM-induced扩散强烈与VEGF的内容各自厘米(图1 (b))。当替换厘米VEGF的平均浓度测试中发现的CM(人类重组VEGF 250 pg / mL), CM的增殖效果可以模仿(图1 (c)按照以前的数据()10]。厘米,治疗OA,或结合CMOA诱导VSMC的VEGF分泌(控制 pg / mL, CM-treated pg / mL, OA-treated pg / mL, CMOA-treated细胞 pg / mL, )如前所述10]。这些数据表明,VSMC大大有助于扩散通过释放VEGF自分泌/旁分泌刺激。厘米,CMOA的组合也VEGF-R1和2的表达增加,而办公自动化对其表达式(数据没有影响1 (d)- - - - - -1 (f))。

3.2。厘米的VEGF是一个重要的因素——OA-Induced VSMC增殖

为了评估中VEGF的重要性CM-induced增殖,VEGF与一个特定的抗体中和。建立有效的VEGF中和,应用VEGF浓度从250 pg / mL到1μg / mL,模仿在CM中平均VEGF浓度和跨越最高VEGF释放VSMC CMOA治疗后观察到的(图2(一个))。中和VEGF阻止CM, VEGF和OA-induced扩散完全(数字2 (b)和2 (c)厘米),突显出我们的假设和OA增加通过VEGF VSMC增殖。VEGF阻塞CMOA显著降低的增殖效应组合,仍然是升高比未经处理的控制(图2 (b)),说明在这个条件下VEGF不是唯一因素参与增殖的效果。此外,诱导VEGF-R1厘米和CM和OA也完全阻止了VEGF阻塞(图2 (d))。

3.3。VEGF释放更高的增值税肥胖受试者相比,坐和增值税从精益控制与VSMC增殖相关

VEGF释放增值税相比,明显高于坐在肥胖受试者无2型糖尿病和2型糖尿病(图3(一个))。另一方面,VEGF版本很低,可比从增值税和坐精益的主题。因此,VSMC增殖是厘米从增值税的肥胖引起的主题,但不是通过从坐厘米,从精益病人增值税,从肥胖病人(图坐3 (b))。类似于CM源自人类脂肪细胞(见图1 (b)厘米),VEGF含量从增值税相关显著的增殖效应各自厘米(图3 (c))。然而,VEGF厘米从坐不相关内容扩散(数据没有显示)。中和VEGF阻止扩散引起的CM增值税的肥胖与2型糖尿病(图对象3 (d))。

3.4。帕特的2型糖尿病患者释放大量VEGF和诱发显著增加VSMC的增殖

VEGF的释放相当坐和帕特的非糖尿病患者为主题,从坐的2型糖尿病患者(图4(一)帕特),而发布的2型糖尿病患者显著增加。因此,厘米从帕特的2型糖尿病患者诱导最强的VSMC增殖的影响(图4 (b))。在两组患者中,厘米从帕特诱导较强的增殖相比从坐到CM。此外,厘米从帕特的2型糖尿病患者诱导的2 - 4倍增加VEGF-R1和2表达VSMC(数字4 (c)和4 (d))。相比之下,帕特的刻意各自坐产生了类似的影响。我们的研究结果表明,VEGF可能是一个重要的生产adipokine PAT尤其是2型糖尿病患者可能直接诱发VEGF-R1 VSMC的增殖和表达式。

4所示。讨论

肥胖是心血管疾病的发展密切相关,并已经提出发病分子链接在这种关系4,17]。本研究旨在阐明机制如何从脂肪组织分泌的输出是与VSMC增殖有关。我们可以在厘米的一项研究在体外分化脂肪细胞诱导VSMC的增殖负相关的脂联素含量厘米(10]。寻找一个活跃的组成部分,CM负责VSMC增殖,我们发现在CM中VEGF与扩散显著相关。VEGF是传统上称为内皮特异性生长因子,诱导内皮调节血管疾病的扩散主要通过VEGF-R2 [18]。然而,增加VEGF和VEGF-Rs可以观察到在其他受伤的动脉壁细胞如单核细胞和VSMC [19]。血管炎症和内皮细胞以及VSMC的增殖是通过血管紧张素II-induced增强VEGF的释放和表达VEGF-R [20.- - - - - -23]。

在这里,我们报告,厘米和OA以及他们的组合诱导VSMC的VEGF也发布,进而可能autostimulate扩散。这种效应类似于低氧诱导VSMC增殖,在自分泌增殖VEGF被描述(24]。此外,它被描述,促炎的刺激与血管紧张素ⅱ和IL-1beta和激活物诱导VEGF释放的VSMC [25,26]。可能会猜测,促炎发病出现在厘米,因此,负责VEGF的感应。此外,VEGF可能autostimulate它的释放可能是将来值得研究。除了从VSMC刺激VEGF的释放,CM诱导VEGF-R1和2表达调解VSMC的增殖和迁移(27]。我们的数据表明,VEGF-Rs都受VEGF本身,作为中和VEGF阻止CM-induced平行扩散这些受体的表达。事实上,监管的VEGF-R2 VEGF已经提出(28]。有趣的是,OA刺激VEGF分泌而不是VEGF-Rs的表达。油酸对VSMC有着复杂的影响,只能推测,它直接或间接地影响VEGF-R言论仍然未知的机制。

VEGF促炎因子(29日,30.之前),我们证明了CM激活NF -κB信号,对CM-induced扩散至关重要(10]。VEGF主要不是激活NF -κB在浓度测量和本研究中使用29日]。然而,CM包含各种发病包括MCP-1和chemerin [12,31日),描述了强烈激活NF -κNF - b .激活κB可以反过来导致VEGF表达和释放所述文献[32]。因此,在CM中促炎因子可能导致增殖诱导VEGF通过NF -κb .阻断VEGF与特定的中和VEGF-antibody减少CM, OA,完全VEGF-induced VSMC的增殖。相比之下,强大的增殖效应厘米和OA并不完全预防,说明VEGF不是CMOA合作的唯一重要因素。CM包含各种发病如il - 6,引发或MCP-1 [12),可能其中一些因素诱导增殖除了VEGF和这些因素也可能参与CM和OA的协同效应。发病数影响瘦素、抵抗素等VSMC增殖和功能(33,34),但不可能在这个场景中扮演一个角色。瘦素释放脂肪细胞分化在体外太低解释CM-induced扩散(35],抵抗素只是从鼠标而不是从人类脂肪细胞分泌12]。

我们这里显示VEGF释放更高的增值税肥胖受试者不论他们的代谢状态。先前的研究已经表明,VEGF表达增加与增加炎症发病在增值税的儿童相比,坐36]。在成人中,VEGF表达肥胖病人在增值税比坐高37]。VEGF表达增加可能与更高的炎症相关增值税VEGF的表达,并分泌刺激等炎性细胞因子il - 6 (38]。最近,它也被认为缺氧可以诱导VEGF表达增加脂肪组织(39]。VEGF在脂肪组织是最近讨论了作为一个“坏”和一个“好”的人。VEGF在脂肪组织的一个重要作用是刺激血管生成,增加毛细血管的关键在扩大脂肪组织通过刺激内皮细胞生长。VEGF是描述为有利于防止脂肪组织缺氧和炎症。事实上,几组表明,诱导VEGF的过度脂肪组织防止obesity-induced缺氧和炎症在平行于脂肪组织改善代谢表型(40- - - - - -42]。相反,adipose-specific一起消融VEGF增加血管化和减少炎症恶化代谢控制高脂肪diet-treated老鼠(42]。在现有的背景下肥胖、VEGF表达增加,而被视为另一个刺激促炎脂肪细胞进一步恶化脂肪组织功能。这里,诱导VEGF的消融脂肪组织保护从肥胖和诱发小鼠棕色脂肪组织在白色脂肪组织(43]。结合另一个类似的研究使用不同的小鼠模型41),它已经表明,VEGF的影响在脂肪是上下文相关的。虽然VEGF高表达已经扩大了脂肪组织代谢控制恶化,增加了VEGF诱导的血管生成活性在脂肪组织的扩张有利于维持正常的代谢功能。因为没有详细研究VEGF的表达人类脂肪组织在肥胖发展存在,进一步的工作是需要扩大这一观点对人类状况。

已经提出,帕特参与与血管壁细胞旁分泌相声,发病机制的主要球员帕特与炎症和血管功能障碍(44,45]。在这里,我们表明,帕特从2型糖尿病患者的特征是显著提高VEGF释放比坐着也从刻意相比,帕特。VEGF高版本是平行的强大感应VEGF-R1和2。使用成对的活检从人类坐和帕特进一步加强VEGF的概念从帕特释放潜在的旁分泌相声。厘米的VEGF含量从坐着帕特从非糖尿病患者以及坐2型糖尿病受试者相似但没有相同的对VSMC增殖的影响。应该注意的是,脂肪组织外植体的使用是一个更复杂的设置比使用厘米从脂肪细胞分泌脂肪组织外植体的输出还包含因素来自其他细胞存在于脂肪组织preadipocytes和巨噬细胞。需要进一步研究来阐明adipokine表达和分泌的差异之间的帕特和其他脂肪仓库在健康和疾病,以确定其他公认的因素负责PAT-induced血管功能障碍。

这项研究的一个限制是,少量的CM,可以准备从帕特不允许手术活检实验评估VEGF中和抗体的影响。在这方面,应该注意的是,人类脂肪细胞和脂肪组织活检的分泌状况是复杂的,作为例子,说明了疾病和depot-specific发病差异[发布15,46]。VEGF含量和PAT-derived条件媒体诱导VSMC增殖的潜力似乎并不完全相关发病表明其他的贡献不能被排除在外。例如,苯丙酸诺龙,释放大量从心外膜脂肪组织,这是高度相关的帕特(15,47),也与VSMC增殖(48]。值得注意的是,激活素释放升高在2型糖尿病患者心外膜脂肪组织,因此可以解释更高的VSMC增殖对待厘米从帕特的2型糖尿病患者和帕特的非糖尿病患者相比,坐在没有糖尿病的患者尽管类似这些CMs中VEGF含量。不同于PAT-induced VSMC增殖,VAT-induced扩散可以解释为在CM中VEGF含量较高,从增值税的肥胖2型糖尿病患者,VEGF中和完全阻止。因此,仍需要进一步的研究来进一步详细发病PAT-derived对VSMC增殖的影响。

总之,我们的结果表明,VEGF是调解CM-induced VSMC的增殖。作为adipokine和生长因子释放大量从增值税的肥胖病人和帕特的2型糖尿病患者坐精益和非糖尿病患者控制相比,VEGF可能是脂肪组织炎症和VSMC增殖异常之间的关系。

利益冲突

作者没有利益冲突声明。

确认

这项工作是支持的Bundesministerium皮毛一厢情愿,欧洲经济共同体委员会(合作项目调整,合同编号。健康- f2 - 2008 - 201100),和德国研究委员会(SE-1922/2-1)。作者要感谢美国整形手术,Florence-Nightingale-Hospital杜塞尔多夫,支持获得脂肪组织样品中脂肪细胞隔离。安德里亚·克莱默的技术援助和Angelika Horrighs和秘书协助Birgit Hurow感激地承认。