文摘

lipoxins是第一个proresolution介质识别和描述为内生的制动信号炎症。我们评估抗炎和proresolution bioactions lipoxin的₄在我们的脂多糖(LPS)诱导肺损伤模型。我们证明了lipoxin₄显著提高大鼠肺组织学和抑制il - 6和TNF -α在LPS-induced肺损伤。此外,lipoxin₄增加肺泡液体间隙(亚)和lipoxin的效果₄在亚足联被废除(CFTR特定抑制剂的检测)。此外,lipoxin₄可能会增加囊性纤维化跨膜电导调节(雌性生殖道)蛋白表达在体外和在活的有机体内。在初选鼠肺泡II型(ATII)细胞,有限合伙人减少雌性生殖道通过激活PI3K / Akt蛋白表达,并lipoxin₄抑制LPS-stimulated一种蛋白激酶的磷酸化。这些结果显示,lipoxin₄CFTR增强检测蛋白表达和增加亚足联通过PI3K / Akt通路。因此,lipoxin₄可以提供一个潜在的急性肺损伤的治疗方法。

1。介绍

急性肺损伤(ALI)是一个重要的疾病综合症表现为渗透率的增加alveolar-capillary障碍导致损伤肺泡液体间隙(亚)。阿里是脓毒症的发展主要原因,其中革兰氏阴性细菌是一位著名的原因。脂多糖(LPS),革兰氏阴性细菌的外膜,是肺损伤的主要炎性反应的因素,导致中性粒细胞招募和肺水肿(1]。患者肺泡液体间隙阿里和急性呼吸窘迫综合征(ARDS)是大多数病人受损,和最大肺泡液体间隙与更好的临床结果(2]。

亚足联取决于活性离子运输,导致一个渗透梯度驱动的运动流体从肺泡空间回间质,最终是血液循环(3]。囊性纤维化跨膜电导调节(雌性生殖道是一个氯离子通道表达在肺泡I型(ATI)和肺泡II型(ATII)细胞(4- - - - - -6]。最近的研究表明,upregulation鼠和老鼠肺部肺泡雌性生殖道功能的速度清除多余的液体从空域和雌性生殖道影响活跃Na⁺运输需要该项受体,可以被非特异性的氯离子通道抑制剂(7]。此外,缺乏或抑制雌性生殖道的缺乏将会增加肺泡液体间隙在回应β肾上腺素能受体激动剂(8,9]。这个证据表明雌性生殖道氯通道有助于亚足联。

虽然取得了重大努力药物上调肺泡液体间隙逆转肺损伤的发展,这些方法并没有被证明是有效的。先前的研究已经证明了β肾上腺素能受体受体激动剂、糖皮质激素和一些生长因子刺激肺泡液体间隙在阿里的动物模型10- - - - - -12]。基于在活的有机体内和在体外工作中,我们表明,舒喘灵刺激肺泡上皮修复,减少肺血管外的水(13,14]。然而,在一个多中心、随机对照试验,我们发现静脉注射舒喘灵增加28天ARDS患者的死亡率(15]。因此,需要提供新见解阿里和ARDS的新治疗方法。

lipoxins是第一个proresolution介质识别和描述为内生炎症的“制动信号”(16]。Lipoxins引出不同的抗炎和proresolution bioactions,包括抑制中性粒细胞功能反应,激活t细胞,释放促炎细胞因子(17]。我们以前演示了lipoxin的两相的作用₄在表达cyclooxygenase-2 (cox - 2)在LPS-stimulated肺成纤维细胞和lipoxin的治疗效果₄在LPS-induced阿里(18,19]。然而,无论是lipoxin₄可以增加亚足联刺激有限合伙人,如果是这样的话,底层机制是什么,仍不明朗。

在目前的研究中,我们审查的影响lipoxin₄在亚足联LPS-induced阿里老鼠。此外,我们还研究了它对雌性生殖道的影响鼠肺主ATII细胞蛋白表达。最后,为了更好地理解的机制,我们研究了监管的信号通路的影响lipoxin₄。

2。材料和方法

2.1。试剂

Lipoxin一₄从开曼群岛化工公司,是存储在使用前−80°C。有限合伙人(e .线圈血清型055:B5),埃文是蓝色的,LY294002, U0126,脱氧核糖核酸酶我买来σ。il - 6和TNF - ELISA试剂盒α从研发系统购买。DMEM、FCS和胰蛋白酶EDTA是从Gibco购买的。青霉素和链霉素柠檬酸盐缓冲来自表达载体。Anti-CFTR和反β肌动蛋白是购自圣克鲁斯。Anti-phospho-ERK和anti-phospho-Akt购买从细胞信号技术。

2.2。动物和准备

男性Sprague-Dawley老鼠(200 - 300 g)从上海SLAC实验动物有限公司购买所有的动物实验被动物保护委员会允许温州医学院。

老鼠被分为四组():(1)对照组,大鼠治疗0.1%乙醇(lipoxin的工具₄5毫升/公斤,(四)6 h后用0.9%盐水治疗(车辆有限合伙人,4毫升/公斤,(四);(2)有限合伙人组与对照组相同,除了有限合伙人(20毫克/公斤,iv)是管理,而不是其车辆;(3)lipoxin₄治疗组是相同的除了lipoxin LPS组₄(2μ克/公斤,iv)是管理,而不是其车辆;(4)组与lipoxin相同₄治疗组,但(1)嗯,气管滴注法)在lipoxin管理₄。

的实验中,不同浓度的有限合伙人包括10毫克/公斤,15毫克/公斤,20毫克/公斤,lipoxin₄包括1μ1.5克/公斤μ克/公斤,2μ2.5克/公斤μ克/公斤,3μ克/公斤测量亚足联治疗。

2.3。测量的亚足联活老鼠

制备的肺泡instillate如下:5%白蛋白instillate解决方案是由溶解50毫克/毫升的牛血清白蛋白在修改后的乳酸林格氏液解决方案:137毫米氯化钠,氯化钾4.67毫米,1.82毫米CaCl₂ 2 h₂啊,1.25毫米MgSO₄ 7小时₂啊,5.55毫米葡萄糖,玫瑰和12毫米。pH值调整到7.4在37°C。白蛋白溶液与0.15毫克/毫升伊文思蓝标签。亚足联在生活评估老鼠如前所述[12,20.,21)做了一些调整。简而言之,在注射后6 h有限合伙人或盐水通过尾静脉,老鼠用2%戊巴比妥钠麻醉(50毫克/公斤,ip)。一个气管导管插入气管切开术。老鼠通风体积恒定通风机(模型tkf - 200 c;TeLi麻醉呼吸设备公司、江西、中国)启发氧气比例的100%,峰值气道压力8 - 10厘米的H₂O和积极结束呼气压力3厘米的H₂O基线时期。手术后的老鼠被允许稳定10分钟。动物被放置在左侧卧位位置和滴剂油管(16 G硬膜外导管)温柔地通过左肺气管切开术。然后1.5毫升(5毫升/公斤)的instillate解决方案有或没有是灌输0.08毫升/分钟的速度使用注射泵。后滴注法完成0.2毫升的空气实现完整的沉积的流体注入肺泡空间。注射器的剩余instillate解决方案收集作为初始样本。滴注法后,导管期间替代了60分钟。最后通过安装导管肺泡样本收集。伊文思蓝标记的白蛋白的浓度的灌输和吸气式解决方案由分光光度计测定波长621纳米。亚足联计算使用以下方程:(12),之前的蛋白质浓度instillate滴剂和样品的蛋白浓度获得60分钟后机械通气。亚足联表达灌输总额的比例(% / 60分钟)。

2.4。测量的il - 6和TNF -α在肺组织匀浆

对肺组织样本均质在50 mM磷酸钾缓冲(铅、pH值6.0)。三冻结和解冻周期后,声波降解法之间的周期,样本在12000转离心20分钟在4°C,然后整除,储存在−80°C。il - 6和TNF -α通过ELISA试剂盒测定。所有的程序都是按照制造商的指示。

2.5。Haematoxylin-Eosin())的染色分析肺

组织学检查,对肺组织和4%多聚甲醛固定24小时,嵌入在石蜡切片(5μ米厚度)。肺组织幻灯片被苏木精和伊红染色,光学显微镜检查使用(尼康eclipse 90 i,东京,日本)。分析肺组织幻灯片是由盲法观察评估(一)肺泡充血;(b)出血;(c)渗透或中性粒细胞聚集在空域或血管壁;和(d)肺泡壁厚度/透明膜形成。结果分级从0到4对每项产品,如前所述[22]。四个变量是总结代表肺损伤评分(总分,约)。

2.6。免疫组织化学

在二甲苯清蜡后,部分患者,被安置在一个压力锅与柠檬酸缓冲,pH值6.0,1分钟后到达沸点检索抗原掩饰了福尔马林固定的网站。经过淬火的内源性过氧化物酶3%的H₂O₂15分钟,部分CFTR孵化与兔多克隆抗体检测(1:100稀释)或preimmune血清是一种消极控制染色一夜之间在4°C,随后被孵化1 h在室温下与生物素化的anti-rabbit免疫球蛋白和peroxidase-conjugated链霉亲和素,与diaminobenzidine (DAB)作为衬底。幻灯片和苏木精复染色30秒。幻灯片和显微镜观察和拍摄(尼康eclipse 90 i,东京,日本)。

2.7。隔离和文化主要ATII细胞

ATII细胞被隔绝Sprague-Dawley雄性老鼠重200 - 300克,之前报道作了一些修改(23,24]。老鼠用2%戊巴比妥钠麻醉(50毫克/公斤,ip),然后下主动脉腔静脉被削减。肺灌注与解决方案(5.2毫米133毫米氯化钠,氯化钾,2.59毫米磷酸盐缓冲剂,10.3毫米消息灵通的缓冲区,1毫克/毫升葡萄糖,pH值7.4)使用20毫升注射器装有23-gauge针通过右心室直到肺部完全变成了白色。肺部和气管切除,灌洗十倍与解决方案B(解决方案+ 1.89毫米CaCl₂和1.29毫米MgSO₄)通过气管切除巨噬细胞,然后完全注满0.25%胰蛋白酶为20分钟37°C。气管、主支气管和大型航空公司被丢弃,肺部被放置到无菌培养皿中。每个肺都碎成1 - 2毫米在10分钟。5毫升的边后卫了停止胰蛋白酶反应和组织暂停准备最后一卷20毫升的哈佛商学院含有脱氧核糖核酸酶(250 U /毫升)。切碎的肺组织被转移到一个50毫升离心管在水浴8分钟37°C。悬架是透过150年和75年μ不锈钢网格然后离心机在1000 rpm 8分钟。层包含ATII细胞悬浮在DMEM包含10%的边后卫,100 U /毫升青霉素,链霉素100毫克/毫升。这些细胞被镀成75厘米²瓶和孵化2 - 3 h在37°C的氛围中公司空气95% - 5%₂使成纤维细胞坚持。不依从细胞收集和丰富ATII微分坚持IgG-coated塑料盘子的1 h。最后,独立的细胞在DMEM resuspended包含10%的边后卫,100 U /毫升青霉素、链霉素和100毫克/毫升的密度2×10⁶上培养的细胞/毫升和塑料six-well盘子。文化时期仅限于48 - 72 h,以减少去分化。

2.8。免疫荧光

老鼠主要ATII细胞种植在盖玻片孵化与DMEM LPS刺激的存在与否lipoxin₄在37°C 6 h。这些细胞被固定为5分钟4%多聚甲醛在PBS,并与PBS清洗三次。固定细胞洋溢着5分钟特里同x - 100为1%,并与PBS清洗三次。非特异性结合的抗体预防5%的牛血清白蛋白在PBS 30分钟37°C。细胞被孵化的CFTR抗体检测(1:100)在一夜之间在4°C。3 PBS洗后,细胞培养2小时fluorescein-conjugated山羊anti-rabbit免疫球蛋白g(1: 500),在室温下在5% BSA / PBS。与PBS洗涤三次后,细胞核被柜台沾染了赫斯特(1:1000)15分钟,其次是三PBS洗涤。细胞被安装在一个幻灯片和可视化使用显微镜。

2.9。免疫印迹分析

免疫印迹分析从冷冻肺部和细胞匀浆进行如前所述[25]。在等量的蛋白质被加载在每个车道和10% sds - page分离,蛋白质被转移到聚乙二烯二氟化物膜。2 h的膜被封锁5%脱脂奶,也是作为中小学抗体孵化缓冲区。主要的抗体被用于稀释1:1000或1:2000年,孵化一夜之间在4°C。辣根peroxidase-conjugated二级抗体,山羊anti-mouse或山羊anti-rabbit,用于1:2000稀释和成像图像量化拉斯维加斯4000迷你(通用电气医疗集团生物科技AB,乌普萨拉,瑞典)。量化了AlphaEaseFC软件(CA)αInnotech,圣莱安德罗。

2.10。测量营地ATII细胞

营水平测量一式三份的商用酶联免疫吸附试验(ELISA);从研发系统、明尼阿波利斯、锰)。根据制造商的协议进行了分析。

2.11。统计分析

所有的值被报告为±SEM手段。由单向方差分析的数据进行了分析,其次是学生Newman-keuls事后考验定义为具有统计学意义。统计分析和图表进行5.0 GraphPad棱镜(GraphPad,圣地亚哥,CA)。

3所示。结果

3.1。Lipoxin的有利影响₄在LPS-Induced阿里

对照组正常肺组织学(图1(一))。相比之下,LPS组明显受损的肺组织肺泡混乱和严重的炎性细胞浸润(图1(一))。所有表示,阿里在这个模型。温和的组织学变化观察治疗后的大鼠肺组织lipoxin₄(图1(一))。与这些组织病理学观察结果一致,LPS组的肺损伤评分显著高于对照组,有限合伙人+ LXA₄组(图1 (b))。肿瘤坏死因子-α(图1 (c))和il - 6(图1 (d))浓度在LPS组与对照组相比显著增加()。这在TNF -增加α明显(在lipoxin)减少₄组。lipoxin中il - 6的浓度₄组(67.24±24.56)低于LPS组(82.74±14.04),尽管不同的不显著()。

3.2。Lipoxin的效果₄在LPS-Stimulated亚足联

不同浓度的有限合伙人被用于实验。我们发现10毫克/公斤有限合伙人在亚足联的影响在老鼠身上是不稳定的。然而,15毫克/公斤有限合伙人可以抑制亚足联,并达到显著的影响在20毫克/公斤,所以我们选择20毫克/公斤有限合伙人在我们的实验。我们也有不同浓度的lipoxin执行₄包括1μ1.5克/公斤μ克/公斤,2μ2.5克/公斤μ克/公斤,3μ在我们的实验中克/公斤。我们发现1μ克/公斤lipoxin₄没有影响提高亚足联降低有限合伙人;1.5μ克/公斤lipoxin₄改善了亚足联降低有限合伙人,并在2达到最大的效果μ克/公斤,lipoxin的效果₄2之间的相似μ和2.5克/公斤μ克/公斤,3μ克/公斤,所以2μ克/公斤lipoxin₄选择在我们的实验(数据未显示)。

亚足联被发现明显减少有限合伙人(20毫克/公斤)组与对照组()。降低显著(在lipoxin)减少₄(2μ克/公斤)组(图2)。接下来,我们试图阻止氯离子通道使用(1),一个特定的雌性生殖道的抑制剂。我们发现lipoxin的效果₄亚足联被废除的治疗(图2)。

3.3。Lipoxin的效果₄CFTR蛋白表达的检测体内和体外实验

在活的有机体内,雌性生殖道的表达蛋白在肺组织匀浆通过免疫组织化学方法检测分析,减少了LPS刺激,但lipoxin增强₄治疗(图3(一个))。免疫印迹分析的变化类似于免疫组织化学分析结果(图3 (b))。雌性生殖道lipoxin一个蛋白表达明显增加₄治疗组较LPS组大鼠初级ATII细胞(图4(一))。导致免疫荧光试验符合,在免疫印迹分析(图4 (b))。

3.4。有限合伙人减少CFTR蛋白表达的检测通过PI3K / Akt信号通路在初级ATII细胞

调查哪些信号通路参与了调节有限合伙人在雌性生殖道蛋白表达,首先,我们测试了一种蛋白激酶的磷酸化ERK在鼠主要ATII细胞被LPS刺激。ERK的磷酸化和Akt在30分钟(图达到了顶峰5(一个))。其次,ATII细胞使用PI3K / Akt激酶抑制剂(LY294002)和ERK抑制剂U0126 30分钟。雌性生殖道的差别只有添加LY294002废除LPS-induced对这些基因的蛋白表达(图5 (b))。

3.5。Lipoxin一₄一种蛋白激酶的抑制LPS-Stimulated磷酸化

一种蛋白激酶的磷酸化在lipoxin显著降低₄治疗组相比,LPS组。一种蛋白激酶的磷酸化也减少LY294002管理细胞(图6)。实验重复了四次与相似的结果。

3.6。Lipoxin的效果₄在细胞内营LPS-Stimulated ATII细胞

我们测量了ATII细胞后的细胞内营水平1 h(有限合伙人或有限合伙人+ lipoxin₄(图7)。营水平降低LPS组与对照组(),但是有限合伙人+ LXA₄集团增加了营水平与LPS组()。

4所示。讨论

阿里和更严重的形式,急性呼吸窘迫综合征(ARDS),是相对常见的症状在危重患者与高发病率和死亡率[26]。没有特定的治疗是目前调节炎症反应,保护肺。实验策略阻止prophlogistic介质没有成功(27)由于多个冗余路径启动炎症。这些策略也减少主机的能力充分处理感染,因为天生的炎症反应是一个有益的防御性事件(28]。传统上,这是认为促炎介质分解代谢是足以让炎症关掉,后续反应结束被动。新的证据表明,决议的炎症和恢复体内平衡不是被动的,而是一种积极监管进程(29日]。特别是在阿里,分辨率的特点是间隙的中性粒细胞肺和重吸收的肺泡液体(30.]。在解决阶段,内生proresolving脂质介质,如lipoxins,可counter-regulate宿主炎症反应,促进解决(31日]。从这些数据来看,我们的目的是评估是否lipoxin₄有防护行动LPS-induced阿里和促进牙槽液的再吸收。

我们的数据清楚地表明,老鼠与lipoxin待遇₄显著抑制il - 6、TNF -α生产和增加亚足联的结果减少肺水肿在肺部组织。雌性生殖道的抑制剂能够废除lipoxin的有利影响₄。此外,我们表明,lipoxin治疗₄调节雌性生殖道蛋白表达在活的有机体内主要ATII细胞。最后,我们的数据提供了证据,有限合伙人CFTR减少检测蛋白表达通过PI3K / Akt信号通路和lipoxin₄可以抑制LPS-stimulated一种蛋白激酶的磷酸化。

LPS刺激巨噬细胞、中性粒细胞和其他免疫细胞产生不同的介质包括肿瘤坏死因子等细胞因子-αil - 6,多形核中性粒细胞招募到受伤的网站(32]。此外,激活中性粒细胞轮回穿越内皮表面进入肺部释放活性氧,导致肺泡毛细血管屏障渗漏、间质和肺泡水肿33]。积累数据表明upregulation增加雌性生殖道亚足联[7,34]。缺乏CFTR功能检测ΔF508老鼠可能会限制他们的能力清除肺泡水肿(8]。转化生长因子β₁抑制雌性生殖道的差别亚足联通过对这些基因的蛋白表达(35]。

雌性生殖道蛋白表达是由一个复杂的信号通路网络,包括一种蛋白激酶ERK途径(35,36]。一种蛋白激酶信号转导的重要中介在蛋白质合成和PI3K的下游激酶(37]。PI3K / Akt通路已被证明调解TGF -β₁CFTR诱导减少检测蛋白表达在初级ATII细胞(35]。众所周知,有限合伙人可以绑定到toll样受体4 (TLR4),作为受体,激活下游信号通路包括PI3K / Akt (38]。目前的研究显示,与有限合伙人主要ATII细胞导致的文化快速Akt和ERK的磷酸化。ERK的磷酸化和Akt 30分钟内达到了顶峰。只有添加LY294002 (PI3K / Akt抑制剂)废除LPS-induced雌性生殖道的蛋白质表达的下调。这些发现表明,LPS抑制雌性生殖道通过激活蛋白表达的PI3K / Akt通路。

我们发现lipoxin₄表达下调LPS-stimulated磷酸化Akt在初级ATII细胞。先前的研究已经表明,lipoxin₄抑制结缔组织生长因子(CTGF)全身扩散的人类肺成纤维细胞通过下调PI3K / Akt (39]。Aspirin-triggered lipoxin一₄也抑制髓过氧化酶(MPO)中性粒细胞通过下调细胞凋亡的抑制PI3K / Akt (40]。在最近的研究中,lipoxin的影响₄模仿的抑制PI3K / Akt LY294002,表明PI3K / Akt通路也调节lipoxin的效果₄在LPS诱导雌性生殖道蛋白表达减少。

夏令营是一个无处不在的第二信使调节大多数细胞内功能。细胞外信号与GPCRs激活腺苷酸环化酶,增加细胞内营的水平。十二指肠上皮细胞实验表明,营地不仅增加了雌性生殖道的活动,而且雌性生殖道蛋白质转移到等离子体(41]。之前的研究报道,预处理的支气管上皮细胞与盐酸MDL(腺苷酸环化酶抑制剂)或(Rp)流派(cAMP-dependent蛋白激酶抑制剂)抑制Ca^{2 +}应对lipoxin₄。百日咳毒素治疗完全废除了Ca^{2 +}lipoxin引起的反应₄在细胞(42]。这些发现表明,lipoxin₄向上调节雌性生殖道表达可能通过营地的途径。

总之,这项研究表明lipoxin管理₄系统增加亚足联在有限合伙人老鼠肺部受伤。我们也证明增强亚足联CFTR与增强检测蛋白表达与lipoxin治疗后₄。机制可能是通过PI3K / Akt信号通路。我们的研究结果揭示了小说肺水肿液再吸收和lipoxin的机制₄可能提供新的机会来设计“重吸收目标”疗法与高度的精密控制ALI / ARDS。

利益冲突

作者没有利益冲突声明。

确认

赞助的这项工作是由中国国家自然科学基金(没有。30772088,没有。81070061,没有。81270132),浙江省级自然科学基金(Y2100885)和浙江省高级创新卫生人才的培养和支持浙江省科学技术部(2011 r10060)。