CD14介导绑定高剂量的有限合伙人,但对肿瘤坏死因子-是可有可无的α生产

文摘

激活巨噬细胞的脂多糖(LPS)包括一个连续接触血清LPS-binding蛋白质(LBP),质膜CD14和TLR4 / MD-2信号复杂。我们分析了CD14参与TNF -α生产刺激1 - 1000 ng / mL的平滑或粗糙的有限合伙人(slp或针对和slp绑定RAW264和J744细胞。肿瘤坏死因子- CD14是不可或缺的α代由低浓度诱导1 ng / mL,得到和针对。在高剂量LPS的形式(100 - 1000 ng / mL), TNF -α释放要求CD14程度要低得多。在两种形式的有限合伙人,rLPS-induced TNF -α生产少CD14-dependent并可能继续在没有血清作为枸杞多糖来源。另一方面,CD14的参与是至关重要的绑定1000 ng / mL的slp从anti-CD14抗体的抑制作用。绑定的slp也强烈抑制硫酸葡聚糖,竞争清道夫受体配体(SR)。葡聚糖硫酸酯的存在,sLPS-induced TNF -的生产α是调节约1.6倍。数据表明,CD14和SR一起参与高剂量的slp的绑定。然而,TNF - CD14的贡献α生产高浓度的slp和针对是有限的。

1。介绍

先天免疫的机制确保快速反应针对微生物已成功地克服身体障碍保护身体。这些反应是触发在识别微生物的进化保守选民命名其为分子模式(pamp)不同的细胞受体其中toll样受体(TLR)是非常重要的1]。内毒素原型PAMP时脂多糖(LPS),革兰氏阴性细菌的外膜的主要组成部分。LPS激活TLR4白细胞和启动信号级联,导致生产的促炎介质以肿瘤坏死因子-α(肿瘤坏死因子-α),像MIP-2趋化因子和咆哮,I型干扰素(2,3]。有限合伙人在血液中浓度高和下面的夸张TNF -的生产α和其他炎性介质会导致系统性炎症反应,称为脓毒症(4,5]。

有限合伙人分子由三部分组成:多糖链叫o抗原,核心的低聚糖和脂质与后者决定内毒素的促炎的活动。LPS结构中观察到的最大的可变性O-specific链和关切的化学性质和多糖的糖残基组装数量,以及位置和立体化学的O糖苷联系(6,7]。在某些物种或突变体的革兰氏阴性细菌,或在不同的生长条件,O-specific链可能缺席导致所谓的针对(从“粗糙”的细菌菌落表型)与“平滑”的典型表型殖民地与o抗原合成得到。缺乏O-specific链的调节过程的有限合伙人由细胞免疫系统的识别,最终会导致不同的细胞因子的大小生产,作为有限合伙人来自发现沙门氏菌sp。,布鲁氏菌sp。,大肠杆菌(8- - - - - -10]。

巨噬细胞的最优响应有限合伙人需要合作的一些细胞外和质膜蛋白质,包括血清LPS-binding蛋白质(LBP) monomerizes有限合伙人和有限合伙人分子转移到等离子体membrane-anchored CD14 [11]。CD14 56 kDa蛋白质形成为NH和结合脂质部分有限合伙人₂终端疏水口袋(12,13]。蛋白质融入质膜的外层膜通过glycosylphosphatidylinositol锚和不含跨膜和胞质域。CD14和腰痛的原因是认为仅仅是一个作用的传感器有效地捕获有限合伙人组成的分子,将其转移到一个信号复杂MD-2蛋白质与TLR4有关。二聚TLR4 / MD-2复合物对LPS诱导绑定触发两个TLR4信号通路根据协会MyD88 / TIRAP或TRIF /电车适配器蛋白质,分别为(14- - - - - -17]。最近的研究表明,CD14是重要的促炎的起始信号引发了slp而不是针对[10]。然而,CD14也可能实现其他功能的过程中细胞刺激比简单的有限合伙人的认可。在巨噬细胞CD14基因突变的小鼠对隔绝,TRIF-dependent TLR4信号通路是无效(9]。这个残疾的通路与CD14-dependent内吞作用的LPS-activated TLR4 [18]。CD14也参与有限合伙人内化的途径导致有限合伙人的胞内解毒。有限合伙人吸收主要原因是清道夫受体(SR)的活动和合作的SR CD14表示19- - - - - -22]。

另一方面,CD14不是唯一coreceptor LPS-stimulated TLR4的细胞。测量之间的共振能量转移荧光标记的膜蛋白在LPS-stimulated单核细胞显示激活与CD14和TLR4 coclustered热休克蛋白70年和90年,CD55, CD11 / CD18,趋化因子受体4 (CXCR4) [23,24]。这些蛋白质可以参与LPS-induced TNF -的生产α通过功能LPS-binding CD14分子相似;然而,趋化因子受体CXCR4信号特性也表示25,26]。

的复杂性TLR4-accompanying质膜受体可能参与LPS识别促使我们分析CD14在TNF -的参与α刺激方案得到和针对生产大肠杆菌在得到绑定。我们发现CD14 TNF -轻度影响α高剂量的slp和针对生产。另一方面,CD14和SR一起参加了高剂量的slp的绑定。数据显示,CD14的参与是很重要的方案得到认可和绑定。然而,TNF - CD14的贡献α生产引起的高剂量的slp,针对可以是有限的。

2。材料和方法

2.1。细胞培养和激励

RAW264 J774A。1cells were cultured in DMEM medium supplemented with 10% fetal bovine serum (FBS) at 5% CO₂。细胞被刺激与超纯光滑的有限合伙人(slp)大肠杆菌0111:B4(生物实验室列表)或粗糙的有限合伙人(针对)大肠杆菌515年血清型,再保险突变(恩佐),或年代-(2,3 -二(palmitoyloxy)丙基]- (R()半胱氨酰)- lysyl 3-lysine (Pam₂埋头₄),或N棕榈酰-年代-(2,3 -二(palmitoyloxy)丙基]- (R()半胱氨酰)- lysyl 3-lysine (Pam₃埋头₄),或者polyinosinic-polycytidylic酸(poly(我:C))从InvivoGen(所有)。当表示,细胞暴露在slp贴上Alexa萤石488酰肼(分子探针)或hydrazide-LC-biotin(热科学)根据[27]。LPS浓度后标签估计使用皮尔斯LAL生色内毒素定量工具(热科学)。确定AF488内容LPS-AF488样本,在492 nm测定吸光度。5:1标签AF488-to-LPS比。标签的有限合伙人证实了生物素点状绑定的分析streptavidin-peroxidase(σ)应用到一个硝基LPS-biotin 5-50 ng / mL的范围。标签的slp AF488或生物素没有减少内毒素活性,所表示的能力产生TNF -α生产前相比得到标签。

2.2。TLR4基因的沉默

RAW264细胞(1.5×10⁵)停牌1毫升的RPMI中补充5%的边后卫,与1毫升的混合血清RPMI包含20μL (TrueFect-Lipo(联合生物系统)和200年pmol TLR4的小干扰RNA (siRNA)或控制小干扰RNA (Ambion)炒,并播种到35毫米文化板块。6小时后,改变了媒介DMEM / 10%的边后卫,和细胞培养24 h,镀在96 -孔板(0.5×10⁵/),并为进一步的实验培养了20 h。

2.3。肿瘤坏死因子-α咆哮,MIP-2化验

细胞(0.5×10⁵/ 96 -孔板)与1 - 1000 ng / mL的刺激方案得到或针对邮局,或10 - 100μPam的g / mL₃埋头₄,或10 - 100μPam的g / mL₂埋头₄或5 - 20μ克/毫升的聚(我:C)在37°C的存在与否10%的边后卫。当表示,刺激细胞孵化前30分钟在37°C和10μ克/毫升的函数阻塞anti-CD14老鼠IgG2b,克隆4 c1,或10μg / mL isotype-matched控制老鼠IgG2b(正),或50μg / mL硫酸软骨素从牛气管,或50μg / mL硫酸葡聚糖明串珠菌属ssp。(500000 MW)(σ)或组合的抗体和硫酸软骨素或硫酸葡聚糖。后续的刺激细胞与有限合伙人或其他上述配体进行适当的药物和抗体。浓度的硫酸盐和抗体有限合伙人增加后减少一半。水平的肿瘤坏死因子-α文化和MIP-2上层清液测定4 h后6 h后咆哮的刺激时,应用程序的小鼠ELISA试剂盒(研发系统、Biolegends Peprotech)。产品的吸光度测量使用日出板读者(Tecan组)。

2.4。LigandTracer绑定化验

J774细胞(1×10⁶3毫升的DMEM / 10%的边后卫)被播种在当地区域倾斜8.7厘米细胞菜根据(28)和培养公司5%₂,37°C。6 h后,盘子被补充7毫升的DMEM / 10%的边后卫和细胞几乎在一夜之间长大。实验之前,细胞被洗一次DMEM / 10%的边后卫补充20毫米玫瑰,pH值7.4,分层和2毫升的混合物中含有10μg / mL anti-CD14鼠IgG2b(克隆4 c1)和50μ50 g / mL硫酸葡聚糖或μg / mL硫酸软骨素和孵化15分钟37°C。盘子被放置在一个倾斜的,旋转的支持工具LigandTracer绿色(仪器AB声誉卓著,乌普萨拉,瑞典)37°C / 5%孵化器有限公司₂对于基线设置。30分钟后,40μL sLPS-AF488被添加到媒体最终的浓度3μ克/毫升的有限合伙人和实时LPS-cell协会监视1 h。在这一次,重复测量的荧光菜区域覆盖和缺乏细胞进行生成一个输出信号定义为不同的荧光cell-containing区和周围的参考区域的荧光。切除介质和洗涤后,菜充满2毫升的DMEM / 10%的边后卫/ 20毫米玫瑰,pH值7.4,用适当的药物,和另一个1小时的测量进行了上述保留有限合伙人的细胞。后增加100μ克/毫升的伴刀豆球蛋白A-FITC介质,测量持续了30 - 40分钟,评估协会与细胞的凝集素。

2.5。LPS-Biotin绑定和内化

细胞被镀在4×10⁴/ 96 -孔板在DMEM / 10%的边后卫。经过18 h,细胞被孵化的10μg / mL anti-CD14抗体或10μ50 g / mL控制老鼠IgG2b,或μ硫酸软骨素或50克/毫升μg / mL的硫酸葡聚糖或组合这些化合物在DMEM / 10%的边后卫(30分钟,37°C)。随后,在文化与sLPS-biotin补充1μg / mL抗体和硫酸盐的浓度减少一半。1 h (37°C)后,细胞与PD洗两次缓冲区(125毫米氯化钠,氯化钾,4毫米NaHCO 10毫米₃1毫米KH₂阿宝₄消息灵通的,10毫米葡萄糖,20毫米,pH值7.4)和促进吸收sLPS-biotin他们孵化DMEM / 10%的边后卫为另一个1小时的适当的药物或抗体。与PD缓冲区,最后洗后细胞暴露于150年μEGTA L的低渗的溶液2毫米,2毫米EDTA, 20毫米玫瑰,pH值7.4(10分钟、4°C),用在冰上5分钟0.25周期,振幅25%使用UP200S Hielscher声波降解器(德国)。匀浆被转移到埃普多夫管和离心机(10分钟,10 000克,4°C);上层清液在稀释TBS缓冲区和应用于100年的两倍μL在硝化纤维膜数量。阻塞后3%牛血清白蛋白在TBS缓冲区包含0.05%渐变20,屁股被孵化streptavidin-peroxidase和免疫反应性的点被化学发光可视化,使用西方SuperSignal Pico衬底(皮尔斯)。

评估sLPS-biotin的约束力,但为了防止其内化,细胞preincubated为30分钟37°C南为0.05%₃之前添加5 - 15μg / mL anti-CD14抗体,或10μ老鼠IgG2b或50克/毫升的控制μ硫酸软骨素或50 g / mLμ克/毫升的硫酸葡聚糖或5的混合物μg / mL anti-CD14抗体和50μ克/毫升硫酸葡聚糖。30分钟后(37°C)、文化与1补充μg / mL的sLPS-biotin 1 h (37°C)的0.05% NaN₃。细胞被洗两次与PD缓冲和处理点状分析如上所述。墨迹densitometrically使用ImageJ分析软件。对于正常化,点强度值中发现nonstimulated细胞和反射的非特异性结合streptavidin-peroxidase细胞匀浆减去从那些LPS-treated细胞。数据表达与LPS水平细胞暴露于cIgG和任意平衡的100。

2.6。免疫印迹

整个细胞溶解产物的蛋白质sds - page分离10%,转移到硝基和探索兔anti-TLR4(圣克鲁斯生物技术)和鼠标anti-actin抗体(BD生物科学)其次是山羊anti-rabbit或anti-mouse免疫球蛋白与过氧化物酶共轭。免疫反应性的乐队进行了可视化和分析densitometrically如上评估TLR4规范化水平对肌动蛋白含量样品。

2.7。数据分析

组间差异的意义使用学生的计算以及。被认为是具有统计学意义。

3所示。结果

3.1。CD14适度影响TNF -α生产由高剂量的有限合伙人

在LPS-induced信号驴CD14的参与,我们检查了中和CD14的对生产的影响TNF -α和咆哮。肿瘤坏死因子-α是合成MyD88-dependent咆哮在TRIF-dependent TLR4信号通路(3]。RAW264细胞被刺激与1 - 1000 ng / mL slp或针对大肠杆菌在4 c1抗体排除有限合伙人绑定到CD14 [29日]。我们发现这个阻塞的函数CD14近废除TNF -α和咆哮生产诱导得到的1 ng / mL。在细胞刺激10 ng / mL的slp抗体明显,51%和88%,减少生产TNF -α和咆哮,分别为(数字1(一)和1 (b))。相比之下,有一个明确的差异CD14参与TNF -α和咆哮生成引起的高,100和1000 ng / mL,剂量的得到。在这种情况下,有限合伙人的阻塞4 c1 / CD14交互的抗体抑制TNF -的生产α只有25 - 27%(图1(一)),同时咆哮一代降低了58 - 76%(图1 (b))。相比之下,当刺激细胞是在一种媒介缺乏的边后卫进行枸杞多糖来源,生产的TNF -α和咆哮诱导1 - 1000 ng / mL slp大大抑制接近前发现在细胞水平的刺激。当细胞被剥夺的边后卫和另外暴露在anti-CD14函数抑制性抗体,细胞因子释放仍然非常低(数字1(一)和1 (b))。

(一)

(b)

(c)

(d)

(一)
(b)
(c)
(d)

图1

α μ α 适度干扰有限合伙人/ CD14交互影响TNF -生产引起的高浓度的slp或针对。RAW264细胞使用10g / mL anti-CD14抗体的克隆4 c1,或isotype-matched控制老鼠IgG2b(30分钟,37°C)和随后的刺激与1 - 1000 ng / mL slp (a, b)或1 - 1000 ng / mL针对(C, d)在10%的存在与否的边后卫,表示。肿瘤坏死因子的浓度,(c)和咆哮(b, d)测量通过ELISA测试上层清液的细胞。数据显示意味着±SEM形式三个或四个实验每次运行一式三份。*显著不同细胞刺激相应的LPS浓度在控制免疫球蛋白和的边后卫。

有限合伙人可以调制的信号特性的o抗原多糖链(9,10),我们接下来研究CD14参与rLPS-induced细胞因子的生产。与针对细胞刺激,TNF -α生产更少的依赖比细胞CD14接触得到。中和CD14和4 c1抗体抑制TNF的生产——65%α由1 ng / mL针对。然而,在细胞刺激针对10 - 1000 ng / mL, TNF -的生产α只是减少了5 - 30%(图1 (c))。使用时浓度更高,尽管CD14-neutralizing抗体的存在,100或1000 ng / mL的针对能够引发高达77 - 82%的咆哮生产中控制细胞(图1 (d))。进一步得到相反,即使没有的边后卫,针对在100或1000 ng / mL诱导肿瘤坏死因子——的生产α和咆哮,走近47 - 66%的控制水平(数字1 (c)和1 (d))。缺乏的边后卫结合中和CD14减弱强烈TNF -的生产α和咆哮诱导针对1 - 100 ng / mL。然而,在这些条件下针对1000 ng / mL仍能够诱导合成TNF -α和咆哮达到约51%和58%的控制值,分别为(数字1 (c)和1 (d))。综上所述,数据显示如下:(i) CD14对TNF -是可有可无的α生产由高(100 - 1000 ng / mL)针对和slp的浓度;(2)针对邮局,在高剂量使用时,可以绕过不仅CD14而且枸杞多糖参与激活TLR4-dependent释放肿瘤坏死因子-α和咆哮。

然后我们检查是否细胞因子引起的生产方案得到和针对这些线的实验确实是归因于TLR4激活。TLR4-encoding基因表达沉默的RAW264细胞抑制肿瘤坏死因子-α生产引起的海平面气压或针对47 - 59%不管LPS浓度(数字2(一个)和2 (c))。TLR4的差别值得注意的是,对这些基因的抑制咆哮发布55 - 61%类似抑制作用对肿瘤坏死因子-α生产(数据2 (b)和2 (d))。这相当甚至抑制细胞因子的生产与减少50 - 55%的TLR4水平细胞转染相比,由特定的核细胞治疗炒siRNA(图2 (e))指向TLR4介导炎症反应得到和针对这些研究。

(一)

(b)

(c)

(d)

(e)

(一)
(b)
(c)
(d)
(e)

图2

α α 沉默的TLR4基因表达明显会使生产TNF -并在细胞刺激与slp或针对咆哮。RAW264细胞转染TLR4-specific siRNA或小干扰rna和炒,50 h后,刺激与10 - 1000 ng / mL slp (a, b)或10 - 1000 ng / mL针对(c, d)。生产TNF -(c)和咆哮(b, d)的细胞被ELISA测试估计。从三个实验数据显示意味着±SEM每次运行一式三份。*显著不同的细胞治疗与炒核和刺激相应的LPS浓度。(e)的免疫印迹分析TLR4蛋白质含量和肌动蛋白水平细胞转染TLR4-specific或炒(sc)核。nt:不是转染细胞。在左边,一个分子量标记(prestained磷酸化酶b, 101 kDa)表示。数据来自两个独立的实验。

我们也分析了CD14的中和是否会影响生产的TNF -α和其他配体引起的咆哮在RAW264细胞通常。anti-CD14抗体诱导部分抑制TNF -α生产反应合成lipopeptides, Pam₂埋头₄和帕姆₃埋头₄,配体TL2 / TLR6和TLR2 / TLR1、分别。没有抑制TNF -α释放被发现在细胞暴露于100 ng / mL的Pam₂埋头₄或帕姆₃埋头₄。然而,在低剂量,10 - 50 ng / mL, lipopeptides TNF -的生产α抑制了大约50%的细胞和Pam刺激吗₃埋头₄当Pam和15 - 24%₂埋头₄(使用数据3(一个)和3 (b))。这些结果与建议CD14在协议作为传感器的两亲水脂分子(30.- - - - - -32),尽管数据反对鼠标CD14的参与在TLR2 / TLR1信号应注意(9]。另一方面,生产细胞刺激5 - 20的咆哮μ克/毫升的保利(我:C)的配体endosomal TLR3,被anti-CD14抗体(图没有改变3 (c))。数据表明,CD14没有参与的内吞作用TLR3配体可以交付给受体通过清道夫受体(SR-A) [33]。

(一)

(b)

(c)

(一)
(b)
(c)

图3

μ _{2 4 3 4} α 中和CD14对细胞因子的影响在激活期间生产TLR2 / TLR6 TLR2 / TLR1、TLR3。RAW264细胞使用10g / mL的anti-CD14抗体或isotype-matched控制老鼠IgG2b(30分钟,37°C)和暴露于浓度Pam表示埋头(一)或Pam埋头(b)或聚(我:C) (C)在10%的边后卫。大量的肿瘤坏死因子-(a, b)和咆哮(c)测定在上层清液的细胞ELISA测试。数据显示每次运行意味着±SEM形成两个或三个实验一式三份。*显著不同细胞刺激与相应的配体浓度的控制免疫球蛋白。

3.2。CD14和清道夫受体参与高剂量的有限合伙人的绑定

中CD14效应产生的中和抗体在肿瘤坏死因子-α生产100或1000 ng / mL的诱导下,有限合伙人可以表明CD14并非高剂量的内毒素的绑定的关键。为了验证这个假设,我们测量1000 ng / mL的绑定和内化slp与生物素结合RAW264细胞(图4)。阻止得到内化,内毒素的绑定进行南的0.05%₃(1小时),之后细胞均质和量的sLPS-biotin绑定到细胞表面点状的分析测定。在这些条件下,细胞治疗5 - 15μg / mL anti-CD14抗体的强烈抑制1000 ng / mL的slp的绑定。绑定方案得到的金额是5点减少了约72%μ克/毫升,在10 - 15约86 - 88%μg / mL的anti-CD14抗体相比,细胞治疗isotype-matched控制抗体(数字4(一)和4 (b))。我们建立了中和的效果对slp绑定CD14 RAW264细胞相媲美,50μ葡聚糖硫酸酯的g / mL,老竞争类的配体(34)介导的吸收和排毒的大量的有限合伙人。葡聚糖硫酸酯在50岁μg / mL抑制sLPS-biotin绑定约80%,而同时行动的5μanti-CD14抗体和50 g / mLμ克/毫升的硫酸葡聚糖废除了绑定(数字4(一)和4 (b))。anti-CD14抗体和硫酸葡聚糖也抑制类似的程度,超过了60%,1000 ng / mL sLPS-biotin的内化。联合这两个代理的影响强烈减少得到吸收,建议部分分离CD14和SR-dependent国际化路线的有限合伙人(数字4 (c)和4 (d))。综上所述,这些数据表明,CD14和SR参与大量的绑定和内化slp而CD14-mediated slp绑定只是部分有助于TLR4信号导致TNF -α的一代。

(一)

(b)

(c)

(d)

(一)
(b)
(c)
(d)

图4

₃ μ μ μ μ μ μ μ ₃ μ μ μ μ μ 绑定的高剂量的slp RAW264细胞是由表面CD14和老(a, b)绑定sLPS-biotin RAW264细胞表面的。细胞被preincubated南为0.05%(30分钟,37°C)和不及时治疗(ns)或5或10anti-CD14抗体或10 g / mL免疫球蛋白g / mL isotype-matched控制(cIgG)或50g / mL硫酸葡聚糖(DS)或50g / mL硫酸软骨素(CS),或者5的混合物g / mL anti-CD14抗体和50克/毫升硫酸葡聚糖。30分钟后(37°C),细胞被刺激与1g / mL sLPS-biotin (1 h, 37°C)的常数存在0.05%的南。sLPS-biotin绑定到细胞表面的数量是由点状评估分析的细胞匀浆使用streptavidin-peroxidase (a)。(c, d) sLPS-biotin的内化。细胞被preincubated 10g / mL anti-CD14抗体或1050 g / mL isotype-matched控制免疫球蛋白或50 g / mL硫酸葡聚糖或g / mL硫酸软骨素或anti-CD14和硫酸葡聚糖的混合物为30分钟37°C。随后,样本补充1克/毫升sLPS-biotin 1 h和清洗和孵化之前另一个1 h在37°C均化和点状分析(C)。(b, d)量化的细胞表面束缚(b)和内化(d) sLPS-biotin dot-blots基于光密度分析。从三个实验数据均值±SEM。*从细胞暴露于控制免疫球蛋白明显不同。

数据被分析钢筋CD14参与slp绑定和TNF -α生产J774细胞数量的表面CD14表达高于RAW264细胞(没有显示)。J774细胞的应用程序允许我们驴的sLPS-biotin绑定到南的表面₃处理细胞后1 h(孵化(数字5(一个)和5 (b))。此外,我们还可以进行实时分析的绑定和内化的sLPS-AF488 LigandTracer绿色仪器需要细胞坚持基础(图5 (c))。绑定的点状分析1000 ng / mL sLPS-biotin显示剂量依赖性抑制anti-CD14抗体绑定。绑定是影响5μ中和抗体的g / mL;然而,它降低了10 58%μ在15 g / mL,约77%μ抗体的g / mL(数字5(一个)和5 (b))。相比之下,50μg / mL硫酸葡聚糖抑制slp绑定J774细胞约40%但联合行动的5μanti-CD14 50 g / mLμ克/毫升的硫酸葡聚糖绑定进一步减少了61%(数据5(一个)和5 (b))指向的参与CD14和SR绑定中得到大量的细胞。一个控制聚阴离子硫酸软骨素在50岁μg / mL并不影响slp的绑定或内化RAW264 J774细胞(数字4,5(一个),5 (b))。

(一)

(b)

(c)

(d)

(e)

(一)
(b)
(c)
(d)
(e)

图5

α ₃ μ μ μ μ μ μ μ ₃ μ μ μ μ μ α μ 不同要求CD14参与高剂量的有限合伙人的绑定和TNF -生产在J774细胞。(a, b)绑定sLPS-biotin J774细胞表面。细胞被preincubated南为0.05%(30分钟,37°C)和不及时治疗(ns)或补充5、10或15anti-CD14抗体或10 g / mL免疫球蛋白g / mL同形像匹配控制(cIgG)或50g / mL硫酸葡聚糖(DS)或50g / mL硫酸软骨素(CS)或5的混合物g / mL anti-CD14抗体和5030.分钟的g / mL硫酸葡聚糖(37°C)。随后,1g / mL sLPS-biotin添加到文化的南1 h的0.05%。(一)点状的sLPS-biotin分析细胞匀浆。(b)的光密度分析dot-blots例证(a)。从三个实验数据均值±SEM。(c) LigandTracer sLPS-AF488绑定和内化的实时分析。细胞preincubated 15分钟在37°C的混合10g / mL anti-CD14抗体和50g / mL硫酸葡聚糖(DS)或50g / mL硫酸软骨素(CS)和转移到LigandTracer。经过30分钟的基线设置(37°C),细胞暴露于3g / mL的sLPS-AF488 1 h(协会阶段),洗去释放有限合伙人和监视另一个1 h测量保留sLPS-AF488细胞。痕迹闭着开放的符号和符号反映CS-treated sLPS-AF488绑定和内化和anti-CD14 / DS-treated细胞,分别。伴刀豆球蛋白A-FITC (100g / mL;ConA)添加到anti-CD14 / DS-treated文化40分钟,确保细胞仍附着。肿瘤坏死因子- (d, e)生产(d)和咆哮(e)细胞使用10g / mL anti-CD14抗体或isotype-matched控制老鼠IgG2b和刺激方案得到的10 - 1000 ng / mL。从三个实验数据均值±SEM。*从细胞暴露于控制免疫球蛋白明显不同。

这些数据与细胞CD14和SR参与slp协会经分析实时绑定和内化LigandTracer sLPS-AF488 J774细胞表现生活的工具。对于这个分析,J774细胞使用10μanti-CD14抗体和50 g / mLμ50克/毫升的硫酸葡聚糖或μ硫酸软骨素的g / mL控制。随后,这些细胞被放置到LigandTracer在37°C和暴露于3μsLPS-AF488 g / mL。在这些条件下,一个协会的sLPS-AF488细胞(包括有限合伙人绑定和内化)监测1 h,洗了之后sLPS-AF488过多和内毒素的保留细胞评估另一个1 h。我们可以看到在图5 (c)葡聚糖硫酸酯,同时阐述细胞和CD14-neutralizing抗体抑制协会和保留3μg / mL sLPS-AF488细胞中,显然是废除其细胞中积累。缺乏保留sLPS-AF488并非由于分离细胞的基础,因为他们仍然能够绑定FITC-labeled伴刀豆球蛋白(图5 (c))。综上所述,数据表明,CD14和SR调解大量有限合伙人的绑定和内化。尽管CD14参与大量的slp的绑定,中和CD14的10μg / mL J774 4 c1抗体的细胞抑制肿瘤坏死因子-α100或1000 ng / mL的诱导下,生产得到了27 - 35%。函数阻塞anti-CD14抗体产生,然而,对肿瘤坏死因子-强抑制性影响α发布的J774细胞在slp 10 ng / mL,符合RAW264细胞(图中的结果5 (d)相比之下,图1(一))。J774咆哮生产引起的细胞得到明显抑制了anti-CD14抗体(图5 (e))。综上所述,干扰绑定的数据表明,大量的slp CD14已经更加明显对有限合伙人的协会与细胞的抑制作用比TNF -α生产。

3.3。调制的肿瘤坏死因子-α生产的老

干扰有限合伙人/ CD14 4 c1抗体相互作用的只是部分降低TNF -α生产引起的高剂量的有限合伙人(100 - 1000 ng / mL),建议其他LPS受体的参与,像老,在这个过程中。为了测试这个假设我们测量TNF -α生产RAW264细胞刺激与10 - 1000 ng / mL的slp在硫酸葡聚糖的存在。细胞因子释放的衰减在这些条件表明LPS的重要性/ SR交互TNF -α生产。然而,阻止老slp绑定的硫酸葡聚糖被发现移植而不是抑制TNF -α生产诱导得到的100或1000 ng / mL。在这些条件下,50μg / mL葡聚糖硫酸酯单独或结合一个控制抗体增强TNF -α释放(图20 - 70%6(一))。类似MIP-2增强被发现,另一个细胞因子产生主要以MyD88-dependent方式(图6 (b)),咆哮中生成MyD88-independent方式(图6 (c))。葡聚糖硫酸酯的存在并不影响显著的生产TNF -α和10 ng / mL的诱导下,MIP-2 slp在咆哮生产适度抑制这些条件(数据6(一)- - - - - -6 (c))。值得注意的是,刺激效应对TNF -α,MIP-2,咆哮生产硫酸葡聚糖100 - 1000 ng / mL有限合伙人同时干扰扭转了4 c1抗体(有限合伙人/ CD14交互的数据6(一)- - - - - -6 (c))。在这种情况下,肿瘤坏死因子-的生产α达到的水平发现仅在细胞暴露在anti-CD14抗体(图6(一))。这些数据表明,有限合伙人的约束力增强TNF - CD14需要支持α刺激生产硫酸葡聚糖的存在。

(一)

(b)

(c)

(一)
(b)
(c)

图6

α μ μ μ μ α ^# 职业的老葡聚糖硫酸酯上调sLPS-induced TNF -生产CD14参与。RAW264细胞使用5050 g / mL硫酸葡聚糖或硫酸软骨素或10克/毫升克/毫升anti-CD14或10g / mL isotype-matched鼠IgG2b (cIgG)或代理的组合,表示,随后被暴露于10 - 1000 ng / mL的海平面气压(37°C)。代的肿瘤坏死因子-(一),MIP-2 (b),咆哮(c)估计在文化上层清液由ELISA测试。向上箭头指示的增强细胞因子刺激生产的100或1000 ng / mL slp在硫酸葡聚糖的存在而向下箭头指示显示细胞因子生成的抑制anti-CD14相比细胞暴露于slp伴随着硫酸葡聚糖。数据显示从三个或四个均值±SEM实验每次运行在一式三份。*显著不同细胞暴露于硫酸软骨素和slp;显著不同于细胞暴露于硫酸葡聚糖和得到。

4所示。讨论

肿瘤坏死因子-α是一个重要的促炎细胞因子产生的哺乳动物在感染革兰氏阴性细菌。这种细胞因子生成主要由巨噬细胞存在于许多组织和触发一系列入侵病原体的先天免疫反应在遇到[35]。Monocyte-to-macrophage分化伴随着upregulation CD14表达(36]。因此,巨噬细胞容易识别有限合伙人单体(LBP)提供的绑定的脂质部分有限合伙人的CD14分子疏水口袋里内毒素可以转移到TLR4 / MD-2 [11,12,37]。一行进行活细胞的研究表明LPS诱导形成多分子的复合物的质膜组成的TLR4 / MD-2 CD14、其他蛋白可能参与LPS识别(23- - - - - -25]。驴CD14参与信号通路导致LPS-induced TNF -α生产RAW264我们进行研究和J774 macrophage-like细胞。我们的初步数据显示,这些细胞不同极大地在其表面CD14表达水平;仪分析表明,荧光信号归因于J774细胞CD14是2.6倍强于RAW264细胞(没有显示)。在这两种细胞系CD14不可或缺的TNF -被发现α生产1 ng / mL的诱导下,得到或针对。然而,肿瘤坏死因子-α生产更高浓度的slp和针对(100或1000 ng / mL)要求CD14程度更低。的抑制TNF -α代CD14产生的中和抗体达到25 - 27%在1000 ng / mL的slp RAW264和J774细胞。这些数据表明,在较高LPS浓度CD14参与TNF -α生产部分可以省略。另一方面,减少细胞TLR4水平减半与抑制肿瘤坏死因子- 50 - 60%α和咆哮生产诱导得到的1 - 1000 ng / mL和针对。这表明TLR4-dependent细胞因子生成的方式,虽然这些结果进一步证实需要TLR4的研究^−−/巨噬细胞。我们的数据与结果对人类单核细胞暴露在函数阻塞anti-CD14抗体MY4和骨骨髓来源树突状细胞或巨噬细胞CD14^−−/老鼠与针对刺激或得到,分别18,25]。似乎,在高剂量LPS,内毒素分子可以直接绑定到TLR4 / MD-2复杂或被转移到其他LPS-binding蛋白质局部信号复杂的等离子体膜蛋白(24]。近日有报道称,白蛋白还与LPS单体形成复合物,可以直接传输内毒素MD-2蛋白(38]。

的干扰有限合伙人/ CD14交互anti-CD14抗体抑制rLPS-induced TNF -α生产相对较弱的相比,肿瘤坏死因子-α代由二(图1;比较(a)和(c))。此外,有限合伙人的形式表现出显著的区别的边后卫要求启动的TNF -α生产,缺乏无效方案得到活动。这些数据表明海平面气压和针对模式之间的差异的行动仅仅是感激。2005年布鲁斯的团队表明,针对活动少CD14-dependent相比得到诱导肿瘤坏死因子-α生产小鼠腹腔巨噬细胞,最近这些观察被研究得到加强,rLPS-induced TNF -α生产在小鼠树突状细胞(9,39]。参与CD14和不同要求的边后卫(枸杞多糖来源)slp -或rLPS-induced il - 6生产也被发现在小鼠肥大细胞缺乏CD14表达(10)和肿瘤坏死因子-最近α生产在人类巨噬细胞(40]。这些不同的要求得到和针对辅助蛋白质调节细胞的激活可以归因于不同的这两种形式的有限合伙人之间的物理化学性质。建议高度疏水性针对可以直接合并到一个访问的质膜TLR4 (10]。此外,结果表明,针对聚合而不是单体的生物活性形式内毒素(41]这就可以解释为什么针对有限合伙人不参与行动monomer-binding蛋白质。针对人们很容易推测总量(100 - 1000 ng / mL)也可以负责CD14和FBS-independent生产RAW264咆哮的细胞(图1 (d))。最近,渡边等人证明LPS-liposomes可以诱导咆哮一代没有CD14的参与(42]。否则,CD14 sLPS-induced所需的内吞作用激活TLR4紧随其后TRIF-dependent合成细胞因子如咆哮([18];参见图1 (c)摘要)。

与条件sLPS-induced CD14的细胞因子参与生产、CD14似乎绑定方案得到的大量的关键RAW264和J774细胞的表面。阻塞后CD14 10的功能μg / mL RAW264 anti-CD14抗体的细胞,1000 ng / mL的绑定和内化sLPS-biotin减少了约90%和64%,分别,TNF -α生产1000 ng / mL的诱导下,二只减少25%(比较数据4 (b),4 (d),1(一))。类似的差异的大小得到绑定和抑制肿瘤坏死因子-α生产中发现J774细胞暴露于10μg / mL anti-CD14抗体(数字5 (b)和5 (d))。更明显的敏感性得到绑定在RAW264 anti-CD14抗体的抑制细胞比J774可以归因于这些细胞CD14表面数量之间的差异。综上所述,这些数据表明,在巨噬细胞CD14参与大量slp的绑定和内化,同样为单核细胞(表示21,43]。然而,CD14-mediated绑定和slp的内化是只需要在一定程度上对TLR4信号和TNF -α生产。TRIF-dependent slp服务可能作为活化剂的内化的TLR4信号通路核内体或者是解毒的指示。CD14参与高剂量的slp的内化是反映在持续减少的细胞表面CD14的水平,达到21%,1 h和38% 2 h后J774细胞刺激1000 ng / mL的海平面气压(没有显示)。

很大一部分得到可以绑定和内化的参与SR从硫酸葡聚糖的衰减过程,竞争配体之间的老清道夫受体,SR-A早些时候表示,调解吸收大量的有限合伙人在巨噬细胞有保护作用对过度的炎性反应有限合伙人(19,20.,44]。SR参与清除多余的slp可以解释为什么TNF -αMIP-2,咆哮生产增加条件SR /有限合伙人绑定时被硫酸葡聚糖(图6)。最近的数据表明,然而,更复杂的场景SR-A参与LPS-induced细胞因子的生产(22,45]。我们早些时候报道,激活SR-A通过硫酸葡聚糖可以上调CD14和TLR4表达在细胞表面,这种方式有助于高TNF -α生产时,有限合伙人和硫酸葡聚糖存在(22]。函数阻塞anti-CD14抗体逆转增强TNF -α引起的一代100 - 1000 ng / mL slp伴随着硫酸葡聚糖(图6)表明参与CD14 SR-related活动是一个限制因素。应该注意的是,CD14和SR调解以来高剂量的slp的绑定这个过程被anti-CD14强烈抑制抗体和硫酸葡聚糖(数字4和5)。虽然这两个代理的累加效应表明部分分离CD14 - slp SR-dependent绑定,这两个受体之间的合作是可能的。考虑到CD14质膜筏蛋白(46)和SR-A伙伴小窝/筏(47]这些区域的等离子体膜可以作为公认的CD14和SR-A之间的互动平台。支持这个建议的最新报告表明激活SR-A SR-A之间的相互作用增强,窖蛋白,大穹窿蛋白质(MVP)位于木筏导致肿瘤坏死因子的增加α生产RAW264细胞(48]。

5。结论

我们的数据表明,CD14参与大量slp的绑定和内化,但这些事件只有在某种程度上所需信号导致TNF -α生产。肿瘤坏死因子-的一代α针对引起更少依赖CD14。除了CD14, SR参与大量slp的绑定和SR的参与调节sLPS-induced TNF -α生产。

利益冲突

汉娜Bjorkelund受雇于声誉卓著仪器AB。其他作者宣称他们没有利益冲突。

承认

这项工作是支持格兰特N N303 809040从美国国家科学中心,波兰。

引用

1. h·库马尔·t·卡瓦依,s .彰”识别病原体的先天免疫系统。”国际免疫学检查,30卷,不。1,16-34,2011页。视图:出版商的网站|谷歌学术搜索
2. a . Poltorak x,他即Smirnova et al .,”中有缺陷的LPS信号影响HeJ C57BL / 10 sccr小鼠:Tlr4基因的突变,”科学,卷282,不。5396年,第2088 - 2085页,1998年。视图:出版商的网站|谷歌学术搜索
3. h . Bjorkbacka k·a·菲茨杰拉德f·休伊特et al .,“巨噬细胞基因表达的诱导有限合伙人主要利用Myd88-independent信号级联,”生理基因组学,19卷,不。3、319 - 330年,2004页。视图:出版商的网站|谷歌学术搜索
4. s . m .蛋白石,p . j . Scannon J.-L。文森特et al .,“等离子体之间的关系水平的脂多糖(LPS)和LPS-binding蛋白质严重脓毒症和脓毒性休克患者,”《传染病杂志》上,卷180,不。5,1584 - 1589年,1999页。视图:出版商的网站|谷歌学术搜索
5. r . Salomao m . k . Brunialti m . m . Rapozo g . l . Baggio-Zappia c . Galanos和m .科德宝”细菌传感、细胞信号,调制的免疫反应在脓毒症,”冲击,38卷,不。3、227 - 242年,2012页。视图:出版商的网站|谷歌学术搜索
6. c . Erridge大肠Bennett-Guerrero, i r . Poxton“脂多糖的结构和功能。”微生物和感染,4卷,不。8,837 - 851年,2002页。视图:出版商的网站|谷歌学术搜索
7. c . r . Raetz和c·维特菲尔德”,引起内毒素脂多糖。”年度回顾生物化学卷,71年,第700 - 635页,2002年。视图:出版商的网站|谷歌学术搜索
8. m·g . Rittig a·考夫曼a知更鸟et al .,“光滑和粗糙的脂多糖表型布鲁氏菌诱导不同的细胞内贩卖人类单核细胞和细胞因子/趋化因子释放,”《白细胞生物学,卷74,不。6,1045 - 1055年,2003页。视图:出版商的网站|谷歌学术搜索
9. 江z, p . Georgel x Du et al .,“CD14 MyD88-independent有限合伙人所需信号,”自然免疫学》第六卷,没有。6,565 - 570年,2005页。视图:出版商的网站|谷歌学术搜索
10. m·胡贝尔c·卡利s凯克et al .,”r形式有限合伙人,主TLR4 / MD-2-positive细胞的激活的关键,”欧洲免疫学杂志,36卷,不。3、701 - 711年,2006页。视图:出版商的网站|谷歌学术搜索
11. p . s .托拜厄斯k . Soldau l·克莱恩et al .,“交联的脂多糖(LPS)对THP-1细胞CD14由LPS-binding蛋白质,”《免疫学,卷150,不。7,3011 - 3021年,1993页。视图:谷歌学术搜索
12. 我。金,j·l . Chang, s . j . Mi et al .,“CD14的晶体结构及其对脂多糖的影响信号”《生物化学》杂志上,卷280,不。12日,第11351 - 11347页,2005年。视图:出版商的网站|谷歌学术搜索
13. j .孟p . Parroche d·t·Golenbock和c·j·麦克奈特,“二硫化的微分影响债券和N-linked CD14的稳定性和功能糖基化,“《生物化学》杂志上,卷283,不。6,3376 - 3384年,2007页。视图:出版商的网站|谷歌学术搜索
14. t . Horng g·m·巴顿r . a . Flavell和r . Medzhitov”适配器分子TIRAP提供信号toll样受体的特异性,”自然,卷420,不。6913年,第333 - 329页,2002年。视图:出版商的网站|谷歌学术搜索
15. m .山本佐藤,h . Hemmi et al .,“电车是专门参与toll样受体4-mediated MyD88-independent信号通路,”自然免疫学,4卷,不。11日,第1150 - 1144页,2003年。视图:出版商的网站|谷歌学术搜索
16. b . s .公园,d·h·歌,s h . m . Kim。崔h·李,J.-O。李,“TLR4-MD-2脂多糖的结构基础识别的复杂,“自然,卷458,不。7242年,第1195 - 1191页,2009年。视图:出版商的网站|谷歌学术搜索
17. g .裤子和r . Jerala toll样受体4防止本构的ectodomain受体激活,“《生物化学》杂志上,卷286,不。26日,第23344 - 23334页,2011年。视图:出版商的网站|谷歌学术搜索
18. Zanoni, r . Ostuni l . r . Marek et al .,“CD14控制LPS-induced toll样受体的内吞作用4”细胞,卷147,不。4、868 - 880年,2011页。视图:出版商的网站|谷歌学术搜索
19. r . y .汉普顿·d·t·Golenbock m .笔者m . Krieger和c r . Raetz”识别和血浆内毒素的清除清道夫受体,”自然,卷352,不。6333年,第344 - 342页,1991年。视图:出版商的网站|谷歌学术搜索
20. r·霍沃思n .普拉特Keshav s . et al .,“巨噬细胞清道夫受体A型表达通过激活巨噬细胞和保护宿主免受致命的内毒素休克,”《实验医学杂志》上,卷186,不。9日,第1439 - 1431页,1997年。视图:出版商的网站|谷歌学术搜索
21. s . Dunzendorfer R.-K。李、k . Soldau和p . s .托拜厄斯“TLR4信号但不吸脂多糖受体,”《免疫学,卷173,不。2、1166 - 1170年,2004页。视图:谷歌学术搜索
22. m . Czerkies k . Borzęcka Zdioruk, A . Płociennikowska A . Sobota和k . Kwiatkowska“清道夫受体之间的相互作用和CD14在J774激活细胞,高浓度的有限合伙人,”免疫生物学,卷218,不。10日,1217 - 1226年,2013页。视图:出版商的网站|谷歌学术搜索
23. a·菲佛a . Bottcher大肠Orso et al .,“脂多糖和神经酰胺对接在筏、CD14受体引起ligand-specific集群”欧洲免疫学杂志没有,卷。31日。11日,第3164 - 3153页,2001年。视图:出版商的网站|谷歌学术搜索
24. m . Triantafilou k .勃兰登堡s Kusumoto et al .,”组合聚类后的受体刺激由产品决定了细菌脂多糖反应,”生物化学杂志,卷381,不。2、527 - 536年,2004页。视图:出版商的网站|谷歌学术搜索
25. k . Triantafilou m . Triantafilou, r . l . Dedrick CD14-independent LPS受体集群中,“自然免疫学,卷2,不。4、338 - 345年,2001页。视图:出版商的网站|谷歌学术搜索
26. m . Triantafilou p . m .莱佩尔·c·d·Briault et al .,“趋化因子受体4 (CXCR4)是脂多糖的一部分“传感装置”,“欧洲免疫学杂志,38卷,不。1,第203 - 192页,2008。视图:出版商的网站|谷歌学术搜索
27. k . Triantafilou m . Triantafilou n·费尔南德斯,“脂多糖(LPS)贴上Alexa 488酰肼作为有限合伙人的小说探针结合研究,“血细胞计数第41卷。。4、316 - 320年,2000页。视图:出版商的网站|谷歌学术搜索
28. h . Bjorke k·安德森,“自动化,高分辨率细胞保留和吸收体外研究,“应用辐射和同位素,卷64,不。8,901 - 905年,2006页。视图:出版商的网站|谷歌学术搜索
29. y足立,c . Satokawa m .火箭et al .,“抑制脂多糖结合CD14单克隆抗体的小鼠巨噬细胞,”内毒素研究期刊》的研究,5卷,不。3、139 - 146年,1999页。视图:出版商的网站|谷歌学术搜索
30. n w·施罗德h·海涅c·亚历山大et al .,“脂多糖结合蛋白结合triacylated和diacylated lipopeptides介导先天免疫反应,”免疫学杂志,卷173,不。4、2683 - 2691年,2004页。视图:谷歌学术搜索
31. n . j .流行病学局,美国Deininger美国Nonstad et al .,“细胞贩运lipoteichoic酸和toll样受体2在信号;CD14和CD36的角色。”《白细胞生物学,卷84,不。1,第291 - 280页,2008。视图:出版商的网站|谷歌学术搜索
32. d . r . Ranoa s l·凯利,r .攻,“人类lipopolysaccharide-binding蛋白质(LBP)和CD14独立交付triacylated脂蛋白toll样受体1 (TLR1)和TLR2和提高三元复杂信号的形成,“《生物化学》杂志上,卷288,不。14日,第9741 - 9729页,2013年。视图:出版商的网站|谷歌学术搜索
33. g . v . Limmon m . Arredouani k·l·麦肯r·a·c·小l . Kobzik和f·艾曼尼“清道夫受体甲级为双链RNA是一种新型的细胞表面受体,”美国实验生物学学会联合会杂志,22卷,不。1,第167 - 159页,2008。视图:出版商的网站|谷歌学术搜索
34. l·佩西和s·戈登,“清道夫受体表达的巨噬细胞的功能及其在炎症的规定,“微生物和感染,3卷,不。2、149 - 159年,2001页。视图:出版商的网站|谷歌学术搜索
35. W.-J。林和观测。叶,”含义的toll样受体和肿瘤坏死因子α信号在脓毒性休克。”冲击,24卷,不。3、206 - 209年,2005页。视图:出版商的网站|谷歌学术搜索
36. D.-E。张c·j·海瑟林顿·d·a·冈萨雷斯,小时。陈,d . g . Tenen”调节单核细胞的分化过程中CD14表达的诱导与1α,25-dihydroxyvitamin D3。”免疫学杂志,卷153,不。7,3276 - 3285年,1994页。视图:谷歌学术搜索
37. t . l . Gioannini Teghanemt, d, e·n·李维斯和j·p·维斯,“单体的内毒素:TLR4-dependent细胞激活蛋白复合物是必不可少的,”内毒素研究期刊》的研究,11卷,不。2、117 - 123年,2005页。视图:出版商的网站|谷歌学术搜索
38. g . a .指控a . Teghanemt t . l . Gioannini内毒素和j·p·维斯。·白蛋白复合物转移内毒素单体TLR4 MD-2导致激活,“先天免疫,18卷,不。3、478 - 491年,2012页。视图:出版商的网站|谷歌学术搜索
39. 即Zanoni c . Bodio a Broggi et al .,”异同光滑和粗糙的先天免疫反应引起的有限合伙人,”免疫学的信,卷142,不。1 - 2,41-47,2012页。视图:出版商的网站|谷歌学术搜索
40. e . Pupo b·林德纳h·布雷德,完好无损,a, b . Schromm粗糙,smooth-form脂多糖大肠杆菌由制备凝胶电泳展览微分生物活动在人类巨噬细胞,”2月日报,卷280,不。4、1095 - 1111年,2013页。视图:出版商的网站|谷歌学术搜索
41. m·穆勒b·林德纳s Kusumoto k . Fukase a . b . Schromm和Seydel,“总量是内毒素的生物活性单位”,《生物化学》杂志上,卷279,不。25日,第26313 - 26307页,2004年。视图:出版商的网站|谷歌学术搜索
42. 渡边,y Kumazawa, j .井上“脂质体脂多糖发起TRIF CD14相关信号通路无关,”《公共科学图书馆•综合》,8卷,不。第三条ID e60078, 2013。视图:出版商的网站|谷歌学术搜索
43. 普桑,m . Foti J.-L。Carpentier,和j·普金,“CD14-dependent内毒素通过macropinocytic内化途径。”《生物化学》杂志上,卷273,不。32岁,20285 - 20291年,1998页。视图:出版商的网站|谷歌学术搜索
44. 陈s Mukhopadhyay,瓦兰,y, b . Liu k . Tryggvason和s·戈登,“SR-A / MARCO-mediated配体传递增强细胞内TLR和NLR功能,但是从细胞表面配体清除限制TLR4应对病原体,”血,卷117,不。4、1319 - 1328年,2011页。视图:出版商的网站|谷歌学术搜索
45. t·h . Yu哈,我刘et al .,“清道夫受体(SR-A)需要LPS-induced TLR4介导NF -κB激活巨噬细胞,”Biochimica和Biophysica学报,卷1823,不。7,1192 - 1198年,2012页。视图:出版商的网站|谷歌学术搜索
46. m . Triantafilou k .宅一生d·t·Golenbock和k . Triantafilou”的先天免疫识别介质的细菌集中在脂质筏和促进lipopolysaccharide-induced细胞激活,“《细胞科学,卷115,不。12日,第2611 - 2603页,2002年。视图:谷歌学术搜索
47. t . Kiyanagi k Iwabuchi k岛田et al .,”参与高microdomains类人类巨噬细胞清道夫受体介导的反应,”动脉粥样硬化,卷215,不。1、60 - 69、2011页。视图:出版商的网站|谷歌学术搜索
48. r . j . Ben y Zhang周et al .,“主要拱顶蛋白质调节类清道夫受体介导肿瘤坏死因子-α在巨噬细胞合成和细胞凋亡《生物化学》杂志上,卷288,不。27日,20076 - 20084年,2013页。视图:出版商的网站|谷歌学术搜索

版权

版权©2013 Kinga Borzęcka等。这是一个开放的分布式下文章知识共享归属许可,它允许无限制的使用、分配和复制在任何媒介,提供最初的工作是正确引用。