文摘

肥胖是慢性低度炎症相关,内脏脂肪。其他器官,特别是胃和小肠,也可能过度分泌的促炎的分子。我们检查在胃组织的基因表达模式的病态肥胖患者非酒精性脂肪肝病(NAFLD)和比较基因表达的变化在不同的组织形式的非酒精性脂肪肝。胃组织样本来自20个病态肥胖的非酒精性脂肪肝患者接受袖胃切除术是异形使用qPCR 84个基因编码炎性细胞因子,趋化因子,炎症级联的受体,和其他组件。白介素8 receptor-beta (IL8RB)在胃组织中基因超表达与肝脂肪变性,肝纤维化和非酒精性脂肪肝(NASH)的组织学诊断。表达水平的可溶性白介素1受体拮抗剂(IL1RN)与纳什的存在和肝纤维化。mRNA水平的白介素8 (IL8)、趋化因子(碳碳主题)配体4 (亚兰),趋化因子及其受体(碳碳主题)受体类型5 (CCR5)有显著提高晚期肝脏炎症,患者与肝脏炎症的严重程度相关。我们的研究结果表明,内炎性分子编码基因表达模式的改变可能导致胃组织与肥胖相关的非酒精性脂肪肝的发病机制。

1。背景

肥胖是一种多系统疾病,其特征是在脂肪组织过度增加。生化,肥胖可以被定义为一个失败的正常能量体内平衡机制需要平衡能量的摄入和支出(1,2]。脂肪储存的大小的调节是一个复杂的过程,涉及到中央和周边组织(1,3)和50多个分泌分子,如adipocytic荷尔蒙瘦素和脂联素(4,5),胃生长素(6,7),和肠道缩胆囊素(8]。许多这些分子也扮演了一定的角色在各种疾病与肥胖有关,特别是,非酒精性脂肪肝病(NAFLD) [7,9]。

非酒精性脂肪肝病(NAFLD)是一种光谱的疾病从相对良性的脂肪肝(简单的脂肪变性)非酒精性脂肪肝炎,或纳什,表现为炎症和肝细胞气球样变性,这可能发展为肝纤维化或肝硬化。非酒精性脂肪肝被认为是肝代谢综合症的表现影响成人和儿童(10,11),被认为达到普通人群的患病率高达30% (11- - - - - -13]。非酒精性脂肪肝和肥胖协会,尤其是内脏肥胖,长期以来被公认(12]。尽管许多途径,如增强氧化应激、细胞凋亡易感性增加,胰岛素抵抗的发病机制涉及非酒精性脂肪肝(11),对发展为纳什的触发器,最终肝纤维化和肝硬化。并不是所有的非酒精性脂肪肝患者发展为肝硬化。此外,并不是所有的肥胖病人发展纳什。一个原因这个微分进展也许nonadipose周组织的贡献与肥胖相关的非酒精性脂肪肝的发病机制。鉴于胃是消化道的中心器官传送下丘脑饱足信号(14,15),是一个关键角色的肽能源体内平衡(激素),参与肥胖相关的非酒精性脂肪肝的发展或进展似乎是有道理的。胃促生长素的发现及其在人体新陈代谢作用加剧了研究下丘脑控制的食欲和对肥胖16]。在2005年,它还发现ghrelin-encoding基因编码obestatin,,不像饥饿激素,是参与抑制食欲17]。除了胃促生长素和obestatin,胃是第二大来源,脂肪组织,后食欲抑制肽瘦素(18- - - - - -20.]。然而,研究胃组织的作用与肥胖相关的疾病,如非酒精性脂肪肝,是稀缺的。

在我们之前的研究中,我们表明,常见的胃激素改变的血清晚期患者非酒精性脂肪肝(7]。特别是,浓度des-acylghrelin NASH患者血清中增加两个相比BMI-matched控制通过简单的脂肪变性,而胃促生长素的浓度和obestatin增加在晚期肝纤维化患者7]。其他的研究表明,饥饿激素的水平与炎症有关,减少炎症的严重程度(21,22]。生产过剩的胃饥饿素在慢性肝病的晚期患者可能是一种补偿事件或局部炎症反应的反映现场的生产。

上述观察结果提示我们在肥胖受试者假设胃组织积极贡献的系统性炎症和发病机理的并发症之一肥胖、非酒精性脂肪肝。研究这个问题,我们进行比较分析84个基因编码表达炎性细胞因子,趋化因子及其受体和其他组件的炎症级联在套筒胃切除术切除胃组织的样本。

2。方法

2.1。样品

本研究通过Inova机构审查委员会(联邦保证FWA00000573)。知情同意后,20病态肥胖的非酒精性脂肪肝患者接受腹腔镜袖胃切除术是包括在内。对于每一个病人,大量的临床和实验室变量。其他慢性肝脏疾病被负面血清学排除乙肝和丙肝,没有毒素暴露史和慢性肝病的其他原因。过度饮酒(> 10克/天在女性和男性> 20克/天)也被排除在外。没有患者接受thiazolidinediones噻唑烷二酮类)或治疗胃炎,包括质子泵抑制剂。

从每个病人,被丢弃的胃组织中袖胃切除术获得与液氮快速冻结。组织学上为每个胃样品也是评估胃炎的存在。如上所述,样本flash在液态氮冷冻,放置在−80°C。基因表达分析实验使用的基底的样品执行剩余套管胃切除术标本。样本异形84个基因表达水平的编码炎性细胞因子,趋化因子,其受体,和其他组件的炎症级联使用RT²分析器PCR数组(美国试剂盒)(见补充表1在网上补充材料http://dx.doi.org/10.1155/2013/684237)。

对于每一个病人,肝活检进行hepatopathologist和阅读。组织病理学评价之前,每个formalin-fixed肝脏活检标本,切片,染色和hematoxylin-eosin马森的三色的。综述了幻灯片后预定的组织学分级系统;脂肪变性的程度分级,估计组织被脂肪空泡的百分比如下:0 =没有,%,2 = 6 - 33%,3 = 34 - 66%,%。其他组织学特性评价H & E部分包括门户炎症,lymphoplasmacytic小叶炎症,多形核的小叶炎症,枯氏细胞肥大、凋亡的身体,焦实质坏死,糖原核,肝细胞膨胀,Mallory-Denk尸体。患者肝脂肪变性(有或没有非特异性炎症)或纳什被认为非酒精性脂肪肝。纳什被定义为脂肪变性、小叶炎症和气球样变性有或没有Mallory-Denk身体,有或没有纤维化。肝脏炎症的定义根据免疫细胞浸润的程度(lymphoplasmacytic细胞、多形核细胞和枯氏细胞肥大)。对于每一个类别,分数分配是基于以下系统:0 =没有,1 =几,2 =温和,3 =很多。总肝脏炎症的严重程度确定基于个人得分之和与先进的肝脏炎症≥3和轻度/不肝脏炎症< 3。pericellular和门户纤维化的严重程度确定基于类似的评分系统如下:0 =没有,1 =轻微,2 =温和,3 =明显纤维化。总肝纤维化的严重程度确定基于个人成绩之和(pericellular和门户纤维化)≥3分被认为是先进的肝纤维化和< 3分被认为是温和的/不肝纤维化。

2.2。RNA提取和反转录

总RNA提取胃底胃癌组织样本(美国)使用RNeasy工具包(试剂盒)根据制造商的指示。确定的数量和纯度提取的RNA,吸光度测量在260 nm (A260)和280海里(A280) GeneQuant1300分光光度计(美国通用电气医疗集团)。RNA A260 / A280 1.8 - -2.1的比率被认为是高纯度的。证实了RNA完整性用1%琼脂糖凝胶电泳,溴化乙锭。RNA与夏普,清楚28日和18年代核糖体RNA (rRNA)乐队和28 s rRNA带的强度大约两倍强烈18 s rRNA乐队被用作参数评估总RNA的完整性。560 ng提取总RNA使用RT反向转录²第一缕工具包(美国试剂盒)。根据制造商的协议,总RNA治疗消除基因组DNA。六聚体随机和oligo-dT引物被用来'逆转录酶制造商建议的执行(美国试剂盒)。

2.3。实时定量PCR分析

96年定量实时PCR进行PCR格式使用Bio-Rad CFX96实时系统(BioRad实验室、美国)坡道1°C /秒的速度。炎性细胞因子和受体RT²分析器PCR数组(美国试剂盒)被用来同时检查84个基因的mRNA水平编码对炎性细胞因子,其受体和胞内炎症级联的组件以及五个看家基因后,制造商的协议。实时聚合酶链反应混合物由1μL cDNA和7.5μL RT PCR的主混合(美国试剂盒)在最后一卷25μl . rt - pcr过程的热剖面是重复50周期:(1)10分钟95°C;(2)10年代变性在95°C和15 s退火60°C(放大每个扩增步骤结束时收集的数据);(3)解离曲线组成的10年代孵化在95°C,在65°C 5 s孵化,增加到95°C (Bio-Rad CFX96实时系统,美国)。融化曲线是用于验证产品特异性。

RT²分析器PCR的结果数组被独立qPCR实验进一步证实了。显著改变的基因表达水平,引物设计利用从NCBI Primer3 ([23(补充表2)。使用热剖面进行了验证了40周期:(1)10分钟95°C;(2)10年代变性在95°C和15 s退火60°C(放大每个扩增步骤结束时收集的数据);(3)解离曲线组成的10年代孵化在95°C,在65°C 5 s孵化,增加到95°C (Bio-Rad CFX96实时系统,美国)。实时聚合酶链反应混合物由1μL cDNA、5μL (SsoFast EvaGreen Supermix(美国Bio-Rad),和250 nM最终引物浓度(美国英杰公司)在最后一卷10μl

2.4。基因表达谱分析

基因表达数据提出了相对基因表达数据24]。值阈值的收集周期(),每个基因,只有值小于40岁被认为是进行进一步分析。正常化每个目标基因进行了相对于五个看家基因(24,25)根据制造商的指示(美国试剂盒)。的平均水平值五个看家基因()在同一阵列(B2M、HPRT1 RPL13A GAPD,和ACTB)计算。规范化Δ日志转换;合成值用于计算每个目标基因的褶皱变化在不同的人群。为每个目标基因,褶皱的变化被用来比较基因表达水平在两个不同的组内组(a组和B组)。在这项研究中,a组可能是患病的状态和B组nondiseased状态;A组可能是先进的病变和B组轻度/ nondiseased状态。

值控制井(基因组DNA控制、逆转录酶控制和积极的PCR控制)进行单独评估每次运行的质量和插入的变化。验证的PCR结果数组,我们进行了归一化过程使用之前验证看家基因(26]。相对基因表达值计算如上所述。

2.5。统计分析

目的本研究发现基因表达变化的更高级形式的非酒精性脂肪肝患者的胃比这些更少的高级形式。比较以下配对组进行:(1)轻微或没有肝脏炎症和先进的肝脏炎症;(2)轻度脂肪变性和高级脂肪变性;(3)组织学与非酒精性脂肪肝没有组织学纳什;(4)肝纤维化和非酒精性脂肪肝没有肝纤维化。

评估的意义之间的基因表达差异组相比,使用非参数Mann-Whitney测试单变量分析。确定两个变量共变,衡量任何关系的强度,斯皮尔曼相关系数的使用。的独立效应显著的变量先进的炎症,纳什,脂肪变性是评估使用多个逐步回归分析与向后和向前逐步选择程序。多个测试修正进行了使用Benjamini-Hochberg-Yekutieli过程控制下的错误发现率正依赖假设反映了已知的现象cocorrelation基因的表达水平在同一细胞或有机体的过程。正相关的假设会不正确,assumption-free Benjamini-Hochberg过程也被应用。两个程序都使用Bioconductor执行。把我们寻找到的角度来看,两个Benjamini-Hochberg-Yekutieli批准价值观和Benjamini-Hochberg测试的结果报告。

3所示。结果

临床和人口数据总结表1。所有患者病理组织切片证实肥胖与非酒精性脂肪肝。

3.1。轻度患者基因表达差异和先进的肝脏炎症

当军团有轻微(得分< 3)和先进的肝脏炎症()进行了比较,对趋化因子表达水平(碳碳主题)配体4 (亚兰),趋化因子受体5(碳碳主题)(CCR5)、趋化因子(C-X-C主题)配体2 (CXCL2)、趋化因子(C-X-C主题)配体6 (CXCL6)、干扰素α2 (IFNA2)、白介素19日(IL19),interleukin-1家庭成员8 (IL1F8)和白介素8 (IL8),显著增加()(表2)。在这些细胞因子中,亚兰、CCR5 IFNA2 IL1F8,和IL8也独立和与肝脏炎症得分显著相关()(表3)。趋化因子(碳碳主题)配体21 (CCL21和趋化因子(碳碳主题)配体3CCL3),另一方面,被发现显著相关(与肝脏炎症的分数),但没有显示显著差异表达group-wise比较(表3)。

3.2。基因表达差异的晚期肝脂肪变性和轻度患者或无肝脂肪变性

晚期患者的肝脂肪变性(分数≥3),趋化因子(C-X-C主题)配体14 (CXCL1410),interleukin-1家庭成员(IL1F10)和白介素8受体β(IL8RB)有一个重要的微分表达式相比那些轻度脂肪变性()(表2)。此外,IL8RB和IL1F10水平与脂肪变性程度呈正相关(表3)。

3.3。基因表达没有纳什纳什和患者之间的差异

患者组织学纳什的存在比那些非酒精性脂肪肝患者没有纳什表现出显著差异表达的趋化因子受体(碳碳主题)3 (CCR3),趋化因子受体(碳碳主题)9 (CCR9)、白介素1受体拮抗剂(IL1RN)、白介素8受体α(IL8RA),和白介素9 (IL9)(表2)。斯皮尔曼相关系数的分析显示一些差异表达的基因,也就是说,CCR3、CCR9 IL1RN IL8RA,和IL9与纳什也呈正相关(表3)。此外,IL8RB趋化因子配体(C-X-C主题)14 (CXCL12),和趋化因子(C-X-C主题)配体1 (CCL1)也积极与纳什显著相关(表3)。

3.4。基因表达差异,没有肝纤维化患者

在肝纤维化患者,只有趋化因子(C-X-C主题)配体17 (CCL17)是显著的调节(表2)。一组不同的基因,诱导细胞因子小亚E成员1 (SCYE1),IL1RN,和补充组件5 (C5),然而,与纤维化的严重程度呈正相关(表3)。

3.5。先进的独立预测指标炎症、纳什和纤维化

预测先进肝脏炎症,生成单一的多元回归方程模型。在这个模型中,只有四个变量-CCL21, CCR5、ALT和年龄作为预测指标先进的炎症CCL21(),CCR5(最强的预测(表4)。这四个因素解释方差的66%炎症表型()。

理解独立变量的影响在组织学NASH的发病机理生成的多元回归统计上显著的模型与CXCL12 CCR3, IL1RN、IL8RA IL8RB,和白介素5 (IL5)。该模型解释了纳什表型方差的75% ()。

先进的肝纤维化模型只包括IL1RN 作为唯一的组件解释方差的34%纤维化()。有趣的是,没有一个显示微分调节的基因或与脂肪变性程度显著相关能够贡献明显脂肪变性的模型;因此,任何模型都源自这些分析。

4所示。讨论

肝脏是一个重要的器官参与脂类代谢。然而,其存储能力有限的脂质(27]。因此,过多的脂质积聚会导致非酒精性脂肪肝的发展。关键目标之一的研究的进展NALFD一直寻找的因素可能会影响脂肪变性纳什和肝硬化的进展。根据多个非酒精性脂肪肝模型,很多并联或串联作用的冲击可能导致发病。其中,gut-derived脂肪tissue-derived因素可能导致炎症条件起着重要的作用,包括非酒精性脂肪肝。炎症,NASH的发病机制中扮演着关键的角色,可以提高肝纤维化进展的概率NASH-related肝硬化(28]。

在过去的十年里,白色脂肪组织被认为是一个主要来源为炎性细胞因子和趋化因子在肥胖病人29日- - - - - -31日]。除了脂肪组织,建议其他组织,特别是胃和肠道组织过度生产各种可溶性分子,可能导致整体炎症背景影响遥远的器官(31日]。

我们的研究首次表明,信使rna编码为各种可溶性分子过度繁殖病态肥胖患者胃组织的高级形式的非酒精性脂肪肝。值得注意的是,有一个实质性的重叠基因重要的微分表达式和基因显著相关相同的非酒精性脂肪肝(补充图1)的组织学特征。此外,独特的、值得注意的是,不重叠的集可溶性分子的编码基因改变他们的表达以及各种非酒精性脂肪肝(图的组织学特征1)。重要的是,一个集重叠基因显著相关与一个特定的非酒精性脂肪肝的组织学特征是最小的(图1)。IL8RB / CXCR2是一个明显的排斥与超表达关联与脂肪变性和纳什以及纤维化的诊断。

IL8RB / CXCR2的IL8趋化因子受体发挥着重要的作用在肝脏炎症,再生和修复32,33),以及在其他炎症性疾病(中性粒细胞聚集31日,34]。增加胃的表达水平IL8RB基因表明,病态肥胖患者NASH-associated炎症,IL8激活并不局限于肝巨噬细胞像以前被证明32),而是一个系统级的功能。似是而非,IL8RB现在居民胃细胞巨噬细胞和中性粒细胞激活中性粒细胞在本地IL8绑定。反过来,激活中性粒细胞可能然后释放额外的趋化因子和/或可能通过门脉循环进入肝脏,影响非酒精性脂肪肝(图的进展2)。这个前提还支持我们观察到的表达IL8基因编码的配体IL8RB积极与先进的肝脏炎症(表3)。循环IL8水平增加氧化应激和报道,反过来,刺激水平的进一步提高氧化剂压力介质由当地招聘的炎症细胞(35)(图2)。随着不断扩大的肥胖者的脂肪组织释放增加IL8水平(9,30.),它可能会触发增加胃IL8RB IL8及其受体的表达。此外,研究表明,游离脂肪酸(FFA),在肥胖个体中也增加了,影响表达IL8各周组织(36,37]。因此,成对增加IL8水平及其受体的胃组织中发现肥胖可能激活当地以及循环,从而促进对非酒精性脂肪肝的炎症和影响发展的恶性循环。

抗炎受体的表达水平IL1RN,拮抗剂IL1A和IL1B呈正相关,与纳什的存在和纤维化(表3)。回归模型预测的纤维化的表达IL1RN信使rna是唯一重要的组件,解释方差的34%纤维化。此外,IL1RN信使rna表达显著促进了回归模型预测纳什(表4)。这些观察结果一致与协会最近的一份报告中血清IL1Ra水平和肝脏IL1RN表达与纳什(38]。IL1Ra表达和分泌的免疫细胞如单核细胞、巨噬细胞和中性粒细胞以及上皮细胞和肝细胞(39]。其表达受促炎细胞因子,IL1RN被认为是一种急性期蛋白质(40)水平升高在许多炎症条件(41]。我们假设增加循环和/或当地的促炎细胞因子的水平上调胃IL1RN表达式直接或通过激活白细胞(图2)。一旦调节,IL1Ra可能刺激自己的胃表达式由一个正反馈循环(图2)。这种机制支持研究表明肥胖患者循环IL1RN升高(40和非酒精性脂肪肝38,42]。

许多基因差异表达胃组织的高级形式的非酒精性脂肪肝患者趋化因子进行编码之前显示为重要的球员在各种炎症条件。例如,两者的表达水平亚兰趋化因子及其受体CCR5编码基因显示显著upregulation先进肝脏炎症(表2)和一个与肝脏炎症的严重程度正相关(表3)。在多元回归模型中,CCR5mRNA水平也是一个最靠谱的肝脏炎症的严重程度(表4)。亚兰吸引自然杀伤细胞、单核细胞和其他免疫细胞(1]。表达的增加亚兰和CCR5基因在胃癌组织可以归因于当地免疫细胞激活响应上游等监管机构IL1F8(图2)。在目前的研究中,IL1F8基因也是调节胃组织的晚期肝癌患者炎症(表2和5)。CCR5牵连纳什(43和肝纤维化44]。这两个条件几乎只促炎的环境中发展。亚兰的角色/ CCR5在非酒精性脂肪肝的发病机制仍有待草拟了,这些集体的发现使它的一个有吸引力的目标进一步调查。

复杂的相互作用的细胞因子,趋化因子及其受体中强调这项研究表明肥胖相关NAFLD的胃组织是不可或缺的球员。似乎在肥胖,增加脂肪组织炎症反应与类似的增加组织内的炎症参与饱腹感的反应。激活免疫细胞嵌入在胃组织可能会招募更多的免疫细胞或被释放在流通,因此放大炎症反应,促进发展和进展的非酒精性脂肪肝(图2)。增加胃的内分泌功能的识别及其贡献能量稳态提示我们假设其炎性改变配置文件可能会影响内分泌。反过来,这可能会引发一连串的代谢功能障碍并在非酒精性脂肪肝(图2)。还有待确定,如果炎症分子的复杂的相互作用在胃组织是上游或下游的炎症信号的错综复杂的网络,这是NAFLD的标志。显然,胃在代谢功能障碍中扮演一定的角色;其潜在的促炎属性不应该被忽视的研究条件与代谢综合征相关,包括非酒精性脂肪肝。

5。结论

在这项研究中,我们将演示基因表达模式的改变对细胞因子和趋化因子的编码基因与肥胖和胃组织中个人不同程度的肝脏炎症和不同形式的非酒精性脂肪肝。溶性炎性分子产生的胃似乎导致与肥胖相关的非酒精性脂肪肝。尽管这些信号事件之间的因果关系还有待确定,我们建议胃的底部是不可或缺的球员在相关的信号环境与肥胖相关的非酒精性脂肪肝。

确认

本研究进行转译研究研究所的乔治梅森大学之间的合作和Inova医院。作者要感谢他们的团队的宝贵的帮助和援助。

补充材料