文摘
胆脂瘤是一种良性的角质化和过度增殖颞骨的鳞状上皮病变。表皮生长因子(EGF)是其中最重要的细胞因子,在胆脂瘤中发挥重要作用。在这个调查中,我们研究了EGF对角质细胞的增殖的影响和EGF-mediated信号通路基本胆脂瘤的发病机制。我们检查了磷酸化EGF受体的表达(p-EGFR)磷酸化Akt (p-Akt) cyclinD1、增殖细胞核抗原(PCNA)在40正常外耳道胆脂瘤样本和20份样本(EAC)上皮细胞的免疫组织化学方法。此外,在体外研究进行调查EGF-induced下游信号通路在初级外耳道角化细胞(EACKs)。p-EGFR的表情,p-Akt、cyclinD1、和PCNA在胆脂瘤上皮细胞与对照组相比显著增加。我们还表明EGF导致表皮生长因子受体的激活/ PI3K / Akt / cyclinD1信号通路,起到了重要的作用,在EACKs EGF-induced细胞增殖和细胞周期的进展。表皮生长因子受体抑制剂AG1478和PI3K抑制剂渥曼青霉素抑制EGF-induced EGFR / PI3K / Akt / cyclinD1信号通路与抑制细胞增殖和细胞周期的进展EACKs。综上所述,我们的数据表明EGFR / PI3K / Akt信号通路是活跃在cyclinD1胆脂瘤,并可能在胆脂瘤上皮细胞过度增生中起到至关重要的作用。本研究将促进发展的潜在治疗靶点intratympanic药物治疗胆脂瘤。
1。介绍
胆脂瘤是一种良性的角质化和hyperproliferative鳞状上皮病变的颞骨逐渐扩大,导致严重的并发症,附近的骨结构的破坏。小骨的链的侵蚀和骨迷路可能导致听力损失,面瘫,迷宫一样的管状器官,和脑脓肿。一般来说,鳞状上皮细胞胆脂瘤的特点是不协调的增殖,迁移,侵略性和复发1- - - - - -4]。然而,洞察其具体潜在的细胞和分子机制仍然是不完整的。临床上,收购了胆脂瘤通常是慢性化脓性中耳炎症有关,而在胆脂瘤的发病机理中起着重要作用[5]。最近,许多作者表明,细胞因子和炎症介质释放反应的刺激可以促进胆脂瘤的形成和进展的角化细胞的迁移和增殖的鼓膜和深层的部分外耳道(EAC) (5- - - - - -10]。
表皮生长因子(EGF)是最重要的一个细胞因子已被证明能够发挥重要作用在胆脂瘤11,12]。增加EGF表达已经证明在胆脂瘤上皮13,14),和高EGF水平也被证明在胆脂瘤的碎片和牙龈组织(15]。然而,EGF的确切机制在胆脂瘤的发病机制尚不清楚。最近,一些下游EGF的目标已经确定,,其中磷脂酰肌醇3-kinase PI3K / Akt信号通路是一种最重要的激酶级联,介导多种细胞功能,比如生存、增殖、迁移和分化16]。表皮生长因子受体(EGFR)是170 kda的跨膜糖蛋白,由细胞内、细胞外和跨膜域(17]。表皮生长因子受体的胞质域绑定EGF促进表皮生长因子受体的激活通过自身磷酸化的胞内域,后来触发PI3K / Akt信号通路(18]。PI3K / Akt信号通路的激活可导致细胞增殖和生长通过调节cyclinD1表达式(19]。最近的研究表明,表皮生长因子受体免疫反应性显著增加在胆脂瘤上皮细胞与正常相比EAC上皮(20.- - - - - -23]。这些结果让我们假设EGF与表皮生长因子受体胆脂瘤的炎性微环境可能绑定并激活EGFR / PI3K / Akt / cyclinD1信号通路,而反过来,促进在胆脂瘤上皮角化细胞的异常增殖。
测试我们的假设,首先我们检查了磷酸化EGFR的表达(p-EGFR)磷酸化Akt (p-Akt) cyclinD1、增殖细胞核抗原(PCNA)在中耳胆脂瘤和正常EAC皮肤标本。其次,我们开发了一个人类外耳道角化细胞(EACKs)细胞培养模型和调查EGF-induced EACKs下游信号。
2。材料和方法
2.1。病人和标本
四十的样本获得胆脂瘤组织临床诊断和病理证实中耳手术后得到的耳鼻咽喉科、头颈外科,湘雅第二医院,中南大学,从2008年1月到2010年10月。有23个男性和17名女性平均年龄为38.5岁(范围14-56年)。二十正常EAC皮肤样品获得接受干穿孔鼓膜成形术和探索性鼓膜切开术的患者的诊断中耳疾病作为控制。hematoxylin-eosin标本(他)染色和免疫组织化学立即缓冲福尔马林固定在10%,嵌在石蜡中。所有由两名有经验的病理学家独立样本进行了分析。这项研究是中南大学的伦理委员会批准和知情同意是获得所有的病人。
2.2。免疫组织化学
石蜡包埋组织切成4μ米厚的部分。二甲苯和水化的部分被deparaffinized一系列梯度乙醇(100%,95%,75%)在孵化前10分钟3%过氧化氢溶液。抗原检索进行10更易与柠檬酸/ L缓冲区(PH值6.0)在微波炉15分钟在100°C。部分洗在磷酸盐(PBS)和preincubated多发地山羊血清在室温下15分钟。然后用主要部分是孵化兔抗体p-EGFR(酪氨酸1173;1:100稀释;圣克鲁斯生物技术,美国),p-Akt (Ser 473;1:50稀释;细胞信号技术,美国),cyclinD1(1: 25稀释;细胞信号技术,美国),和PCNA(1: 100稀释; Bioworld Technology, USA) at 4°C overnight in a humidified chamber. After incubation, each section was washed with PBS and incubated with the secondary biotinylated goat-anti-rabbit antibody (Zhongshan Goldenbridge Biotechnology, Beijing, China) for 15 min at room temperature. After being washed in PBS, the sections were incubated with streptavidin conjugated with horse radish peroxidase (Zhongshan Goldenbridge Biotechnology, Beijing, China). Freshly prepared 3,3′-diaminobenzidine (DAB, Sigma) was used as a substrate for peroxidase. Finally, the sections were counterstained with hematoxylin, dehydrated, and mounted. For the negative controls, PBS was used to substitute primary antibody.
2.3。评价免疫染色
染色细胞的百分比和染色的强度被认为是(24]。阳性细胞的百分比是评分,得分为0负染色,1 < 10%,2 10% - -50%,3 > 50%的阳性细胞。染色强度评分,得分为0没有染色,染色1疲弱,2为温和的染色,3为强大的染色。每个标本获得的总分乘以分数和百分比染色强度得分。最后的结果记录为负(−)如果总分≤2和积极的(+)如果总分≥3。
2.4。的主要文化EACKs
EACKs得到从外耳道皮肤(eac)由施密特在探索性鼓膜切开术手术如前所述的样本et al。12)和Sanjuan et al。25]。简单、组织样本冲洗冷无菌PBS含100单位/毫升的青霉素和链霉素100 ug /毫升之前删除结缔组织。然后,样品被切成小块,孵化一夜之间在0.25%胰蛋白酶溶液在4°C。随后,上皮床单被切割和分离胰蛋白酶。与胰蛋白酶抑制剂分裂停止,细胞然后在1000转离心5分钟。离心后,细胞培养在定义keratinocyte-SFM(角化细胞的无血清培养基;表达载体,包含补充美国)(牛脑垂体提取物、人类表皮生长因子;英杰公司)在湿润有限公司2在37°C。所有实验利用subconfluent,低EACKs。这项研究是中南大学的伦理委员会批准和知情同意是获得所有的病人。
2.5。通过免疫荧光鉴定EACKs
细胞培养到盖玻片,然后用4%多聚甲醛溶液固定孵化以0.2%紧随其后Triton x - 100 10分钟允许透化作用。孵化后,细胞被洗了三次在PBS和孵化阻断缓冲区(3%牛血清白蛋白)。细胞培养的主要鼠抗体细胞角蛋白(1:150稀释;博士德,中国为90分钟)在37°C。孵化后,细胞被洗在PBS和孵化TRITC-labeled goat-anti-mouse二级抗体(1:50稀释;博士德,中国)在37°C 60分钟。盖玻片终于安装观察。PBS是用来替代的主要抗体(细胞角蛋白)是一种消极控制。
2.6。细胞治疗
EACKs从通道两个或三个被用于这项研究。与补充剂改为中没有定义keratinocyte-SFM 24 h与EGF治疗之前。总之,EACKs服用15 ng / mL的重组人表皮生长因子(美国σ)表示时间。抑制实验,EACKs培养在定义keratinocyte-SFM包含250海里的表皮生长因子受体抑制剂AG1478(细胞信号技术,美国)30分钟或200海里的PI3K抑制剂渥曼青霉素(美国σ)1 h与EGF治疗之前。
2.7。MTT试验
细胞增殖的能力被MTT试验评估。简单地说,细胞被播种到96 -孔板和湿润的孵化有限公司2在37°C。24 h后,细胞与EGF刺激(15 ng / mL)存在与否的表皮生长因子受体抑制剂(AG1478 250 nmol / L)和PI3K抑制剂(渥曼青霉素,200 nmol / L)表示时间。细胞培养了20μL (MTT解决方案4 h 37°C。在150年切除培养基μL(二甲亚砜(DMSO)添加到溶解晶体。细胞生长曲线是根据490 nm波长光吸收值(OD490年)。细胞存活率。
2.8。细胞周期分析
EACKs在6-well组织培养板培养融合和增长到70%到80%。按预定时间点治疗后,EACKs收获和固定与冰冷的乙醇(70%)。固定后,细胞离心,用冰冷的PBS洗。然后,这些细胞被孵化与PBS含碘化propidium(π,50μg / mL;美国σ),核糖核酸酶(100μg / mL;Beyotime,中国),和0.1% Triton x - 100 (Beyotime,中国)和在黑暗中保持在4°C 30分钟。流式细胞仪DNA含量是决定。
2.9。免疫印迹分析
治疗后,细胞溶解产物被sds - page凝胶制备和分离,转移到聚乙二烯二氟化物膜。膜被封锁与Tris-buffered盐水(TBS, PH值7.4),含5%脱脂奶粉,然后孵化主要抗体在一夜之间在4°C。在TBS洗了三次后,膜与辣根孵化peroxidase-conjugated goat-anti-rabbit二级抗体(1:1000;圣克鲁斯生物技术、美国)在室温下1 h。蛋白质是由增强化学发光检测(ECL)方法(热、美国)。主要抗体的详细信息如下:p-EGFR(酪氨酸1173;1:500稀释;圣克鲁斯生物技术,美国),p-Akt (Ser 473;1:2000稀释;细胞信号技术,美国),cyclinD1(1: 500稀释; Bioworld Technology, USA), EGFR (1 : 500 dilution; Bioworld Technology, USA), and Akt (1 : 500 dilution; Bioworld Technology, USA).
2.10。统计分析
胆脂瘤上皮细胞和正常EAC上皮之间的蛋白质表达模式分析与卡方检验(测试)。斯皮尔曼等级相关的测试是用来计算相关性。我们也分析了细胞治疗组之间的差异和控制使用学生的细胞组织以及。统计分析是由SPSS 16.0统计程序(美国SPSS Inc .,芝加哥,IL)。的值被认为是具有统计学意义。
3所示。结果
3.1。组织病理学研究
他染色表明,胆脂瘤标本包括三个部分:矩阵,perimatrix,角蛋白碎片(图1(一))。在胆脂瘤标本、炎性细胞和新成立的血管总是perimatrix。没有炎症的迹象出现在正常EAC皮肤部分(图1 (b))。
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3.2。免疫组织化学检测p-EGFR、p-Akt cyclinD1在胆脂瘤上皮细胞和正常EAC皮肤上皮细胞
如图2、积极p-EGFR疣主要是观察胆脂瘤上皮细胞细胞质膜的基底和suprabasal层(图2(一个));p-Akt阳性反应主要是细胞质中的局部上皮的基底和suprabasal层(图2 (c));cyclinD1表达主要是观察到细胞核,局部上皮的基底层(图2 (e));PCNA阳性反应主要是在细胞核和本地化的基底和suprabasal层(图2 (g))。积极p-EGFR, p-Akt、cyclinD1、和PCNA表达显著增加在胆脂瘤上皮(65.0%、72.5%、62.5%和80.0%,分别地)与正常相比EAC上皮(20.0%、35.0%、10.0%和45.0%,分别地。)(表1;)。在胆脂瘤上皮细胞,观察显著正相关p-EGFR和PCNA表达与之间p-Akt和PCNA的表达,cyclinD1、分别和PCNA ()。
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3.3。建立和识别EACKs的主要文化
5 - 7天的文化之后,我们观察到细胞殖民地由几个细胞组成,细胞逐渐向外增长的殖民地。经过20天的文化,培养细胞长成单层和多边形出现“cobblestone-like”外观(图3(一个))。这些细胞被孵化anti-cytokeratins抗体和显示阳性反应细胞角蛋白(图3 (b))。没有检测到信号的负控制。的形态学和生物学特性的主要文化EACKs在当下研究类似于典型的角化细胞。
(一)
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3.4。抑制EGFR / PI3K / Akt通路会使EGF-Induced EACKs扩散
图中所示4(一)EGF (15 ng / mL)治疗显著增加EACKs扩散在所有时间点(表2;)。我们假设EGFR / PI3K / Akt生存信号通路可能参与EGF-induced EACKs扩散。在这里,我们研究这个问题的预处理EACKs与表皮生长因子受体抑制剂(AG1478 250 nmol / L)和PI3K抑制剂(渥曼青霉素,200 nmol / L)表示时间。根据MTT试验的结果,我们观察到的预处理EACKs AG1478或渥曼青霉素显著抑制细胞增殖的EACKs EGF刺激引起的(图4 (b)和表2;)。我们的研究表明EGF可能诱发的细胞增殖EACKs通过EGFR / PI3K / Akt信号通路。
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3.5。抑制EGFR / PI3K / Akt通路会使EGF-Induced细胞周期进程的EACKs G0 / G1期S期
为了进一步探索EACKs EGF-induced细胞增殖的机制,流式细胞仪是用于监测细胞周期的变化。如图4 (c)EGF治疗明显增加的百分比EACKs S + G2 / M期细胞与对照组相比(与)()。然而,细胞的预处理AG1478显著降低的百分比在S + G2 / M期细胞EGF治疗组(相比与)(),细胞的预处理与渥曼青霉素的比例显著降低S + G2 / M期细胞EGF治疗组(相比与)()。这些结果表明EGF可能诱导细胞周期的进展EACKs通过EGFR / PI3K / Akt信号通路。
3.6。EGF促进表皮生长因子受体磷酸化和Akt在不影响EACKs EGFR和Akt的总水平
为了研究信号通路在EACKs EGF-induced细胞周期进展,我们确定激活/表皮生长因子受体磷酸化和Akt蛋白免疫印迹分析。如图5,EGF诱导快速EGFR磷酸化和Akt在60分钟,高峰磷酸化的表皮生长因子受体和Akt在30分钟和20分钟(数字5(一个)和5 (b)),分别。然而,EGFR的总水平和Akt保持不变。探讨表皮生长因子受体激活是否EGF-induced必不可少的一种蛋白激酶磷酸化,细胞使用AG1478 30分钟,然后暴露于EGF。在这里,我们使用的PI3K渥曼青霉素抑制剂作为一种蛋白激酶磷酸化的积极控制抑制。结果表明,AG1478强有力地阻止EGF-induced EGFR磷酸化和Akt(数字5 (c)和5 (d))。这些发现表明,表皮生长因子受体激活是必不可少的PI3K / Akt信号通路的激活EGF-stimulated EACKs。
(一)
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3.7。EGF诱导cyclinD1 Upregulation通过表皮生长因子受体和细胞周期进展/ PI3K / Akt通路
cyclinD1是一种细胞周期调控蛋白,在细胞增殖和细胞周期中扮演着关键角色从G1年代过渡阶段(26]。确定的角色中cyclinD1 EGF-induced细胞周期进展,EACKs孵化了EGF和cyclinD1蛋白检测在不同时间点通过免疫印迹分析。如图5 (e)在24 h, EGF诱导cyclinD1 upregulation。调查的潜在贡献EGFR / PI3K / Akt通路cyclinD1老年病细胞使用AG1478 30分钟或渥曼青霉素1 h,然后暴露于EGF。结果表明,AG1478和渥曼青霉素显著抑制EGF-induced cyclinD1上调(图5 (f))。这些发现表明EGFR / PI3K / Akt途径需要cyclinD1老年病的EGF-stimulated EACKs。
4所示。讨论
在目前的研究中,我们分析了表皮生长因子受体的蛋白表达的三个关键组件/ PI3K / Akt / cyclinD1通路和证明p-EGFR蛋白表达,和p-Akt cyclinD1胆脂瘤上皮细胞与正常EAC上皮相比显著增加。此外,我们比较胆脂瘤上皮细胞的增殖能力与正常EAC上皮,使用PCNA增殖标记。我们发现,胆脂瘤上皮细胞比正常的EAC上皮增殖能力更大。符合我们的观察,先前的研究使用ki - 67增殖标记也显示出明显高于胆脂瘤上皮增殖指数与正常相比EAC上皮(1,27- - - - - -29日]。此外,在胆脂瘤上皮细胞,观察表明,显著正相关p-EGFR和PCNA表达与之间p-Akt和PCNA的表达水平,分别cyclinD1和PCNA。这些观察表明EGFR / PI3K / Akt cyclinD1通路是活跃在胆脂瘤,可能参与收购胆脂瘤上皮细胞增生的机制。
EGFR / PI3K / Akt通路目前公认为最重要的一个通路在调节细胞生存和增殖19,30.]。EGF是其中一个最重要的表皮生长因子受体家族的配体。表皮生长因子存在于细胞外环境时,它可以绑定到表皮生长因子受体的细胞外的领域,通过自身磷酸化激活表皮生长因子受体的表皮生长因子受体的胞内域。一旦激活,表皮生长因子受体PI3K激活的结果,一个细胞内信号传感器酶,可使磷酸化磷脂酰肌醇4,5-biphosphate (PIP2) 3′肌醇环的位置,并将其转换为磷脂酰肌醇3、4,5-triphosphate (PIP3)。作为第二信使,PIP3新兵Akt的细胞膜Akt在位置完全被磷酸化激活Ser473 [31日]。激活后,Akt把细胞质和细胞核使磷酸化底物。例如,Akt已经被证明可以促进细胞增殖和生存信号通过upregulation cyclinD1 [32]。
探讨EGF作为诱导物的监管机制的激活下游EGFR / PI3K / Akt / cyclinD1通路在体外,我们与EGF刺激EACKs和测试是否EGF诱导的细胞增殖EACKs通过EGFR / PI3K / Akt / cyclinD1信号通路。我们的在体外数据表明,与EGF刺激EACKs导致表皮生长因子受体的激活/ PI3K / Akt信号通路,它发挥了重要作用在EGF-induced细胞增殖和细胞周期进展通过cyclinD1的老年病。然而,表皮生长因子受体抑制剂AG1478和PI3K抑制剂渥曼青霉素显著抑制EGF-induced cyclinD1 EACKs老年病。随后,细胞增殖和细胞周期的进展EACKs也被封锁。这些结果表明,表皮生长因子在炎症微环境可以使磷酸化和激活EACKs EGFR。一旦激活,表皮生长因子受体的激活导致下游PI3K / Akt信号通路,随后引起细胞增殖和细胞周期的进展EACKs通过cyclinD1的老年病。我们的观察是一致的欧阳等人的报告中cyclinD1的数据提供了直接的供应目标PI3K / Akt信号通路(33]。在这项研究中,我们发现EGF对信号通路的影响介质是早期;然而,对扩散的影响被认为后36 h - 72 h。正如我们所知,许多激酶磷酸化事件暴露在刺激后发生的很快。在我们的调查中,EGFR和随后的PI3K / Akt激活已被描述为早期的关键事件。然而,细胞有丝分裂增殖需要蛋白质合成等功能视为后最终事件。
EGFR / PI3K / Akt信号通路与各种增生性病变包括良性和恶性增生性疾病。先前的研究显示,不致命的剂量的紫外线能促进人类HaCat角质细胞增殖通过表皮生长因子受体的激活/ PI3K / Akt cyclinD1通路(19]。最近,据报道,disintegrin和metalloprotease 17 (ADAM17)可能诱发前列腺癌的细胞增殖通过EGFR / PI3K / Akt途径激活(34]。我们的研究结果是一致的与这些发现和第一次证明,EGFR / PI3K / Akt信号通路是活跃在cyclinD1胆脂瘤上皮和EACKs参与EGF-induced细胞增殖。因此,抑制EGFR / PI3K / Akt cyclinD1信号通路与小分子抑制剂(19,35](如单克隆抗体、小分子酪氨酸激酶抑制剂,和小干扰RNA)可能被用作承诺目标intratympanic非手术病人的药物治疗或辅助治疗预防复发的手术后胆脂瘤。在未来的研究中,我们将开发中耳胆脂瘤的动物模型中潜在的表皮生长因子受体抑制剂/ PI3K / Akt cyclinD1研究信号通路可能会变得更容易。
5。结论
总之,我们的研究表明,EGFR / PI3K / Akt信号通路是活跃在cyclinD1胆脂瘤,并可能在胆脂瘤上皮增生中起到至关重要的作用。的在体外研究表明,EGFR / PI3K / Akt途径可能参与EGF-induced细胞增殖的EACKs通过upregulation cyclinD1。这项研究可能有助于理解胆脂瘤的发病机制的分子机制和识别潜在的治疗靶点intratympanic药物治疗胆脂瘤。
利益冲突
作者宣称没有利益冲突。
承认
这项研究是由湖南省研究生创新基金会,中国(CX2010B055)。