文摘

在哮喘,先天免疫的重要作用越来越被认可。关键的先天免疫细胞在肺巨噬细胞。根据他们收到的信号,巨噬细胞至少可以有M1, M2,或者M2-like表型。这些巨噬细胞表型的行为不知道关于()的严重哮喘。我们有量化的表型在三个模型屋尘螨(HDM)诱导哮喘(14、21和24天)。M1、M2和M2-like表型被确定干扰素调节因子5 (IRF5) YM1,分别和il - 10。我们发现高嗜酸性粒细胞的百分比HDM-exposed老鼠相比,控制但没有HDM模型之间的差异。HDM曝光后T细胞数量高,最高的24-day HDM协议。HDM后M2巨噬细胞的数量与高嗜酸性粒细胞数。在老鼠那么严重哮喘、M1与M2巨噬细胞人数越来越负相关巨噬细胞数。 Lower numbers of M2-like macrophages were found after HDM exposure and these correlated negatively with M2 macrophages. The balance between macrophage phenotypes changes as the severity of allergic airway inflammation increases. Influencing this imbalanced relationship could be a novel approach to treat asthma.

1。介绍

哮喘的特征是不可逆转的阻塞和慢性气道炎症,和传统上被认为是辅助T 2 (Th2)电池驱动的炎症性疾病(1]。然而,先天免疫系统的一个重要的角色除了适应性免疫系统越来越被认可在哮喘(2]。

巨噬细胞的先天免疫反应的关键细胞肺:他们是最丰富的细胞和第一个遇到过敏原和其他威胁体内平衡。他们也有可塑性快速处理那些没有危及正常的气体交换。根据接收到的信号,巨噬细胞可以赞成或抗炎、免疫原性和耐受性,破坏或修复组织。每个特征可能属于不同的巨噬细胞表型与不同的功能(3,4]。

肿瘤坏死因子α(肿瘤坏死因子α)和干扰素γ(干扰素γ)诱导的影响下转录因子interferon-regulatory因子5 (IRF5) M1与杀菌剂的增加巨噬细胞的表型和/或破坏瘤的活动(4,5]。il - 4或IL-13导致人口的M2巨噬细胞参与细菌感染和组织修复反应(6,7]。在小鼠,这些细胞被高生产几丁质酶和chitinase-like分子如YM1 [7,8]。的一个近亲M2巨噬细胞是M2-like巨噬细胞表型。这些巨噬细胞可以诱导多种刺激包括接触TLR-ligand存在il - 10或更多的化合物。略有不同的主要特征M2-like人口il - 10的生产。由于il - 10是一种强力抗炎细胞因子,这些M2-like巨噬细胞炎症的有效抑制剂(4]。

尽管广泛的巨噬细胞激活的光谱,巨噬细胞在哮喘中的作用几乎没有研究[9]。从已知,所有三个巨噬细胞表型与哮喘小鼠和人类的发展10- - - - - -12]。在老鼠身上,这取决于使用的协议、哮喘表型可以大大不同13,14]。我们旨在调查三大巨噬细胞表型的分布在三个不同的模型HDM-induced哮喘和哮喘发展还包括性的影响。首先,我们展示了普遍差异在三个HDM模型气道炎症和接下来我们研究巨噬细胞表型的分布对过敏性气道炎症的严重程度。

2。材料和方法

2.1。动物

雄性和雌性BALB / c小鼠(年龄在6 - 8周)从哈伦(霍斯特,荷兰)。老鼠被喂食随意与标准的食物和水和在特定的无菌条件下举行组4每笼老鼠。动物程序、制度动物保健和使用委员会批准的格罗宁根大学的(申请号5318),进行严格遵照政府和国际准则。

2.2。全身的屋尘螨(HDM)气道炎症模型

男(每个模型)和雌性老鼠(每个模型)和异氟烷麻醉暴露鼻内全身HDM提取(Dermatophagoides pteronyssinus爱、格里尔实验室、美国)在40μL磷酸盐(PBS)根据三种不同的协议。控制动物()被暴露于40μL PBS根据21天的协议描述。

老鼠的第一个模型()收到了100μg HDM提取经0天,随后被暴露在10μg HDM 7 - 11天的协议Hammad等人,牺牲了14天(缩写为14天HDM) [15]。在第二个模型中,根据格里高利et al。16),老鼠()暴露在25μg HDM提取三周期间每周3次,牺牲在21天(缩写为21天的HDM)。最后一个模型(由于疾病,女性被排除在研究),小鼠鼻内暴露于100年μg HDM天0、7、14和21的协议Arora等人,牺牲在24天(缩写为24-day HDM) [17]。

在牺牲肺灌洗3次1毫升冷PBS决定的嗜酸性粒细胞数量和YM1水平。然后,左肺叶收集从消化肺隔离肺细胞流式细胞术和肺膨胀0.5毫升50% Tissue-Tek O.C.T.化合物(樱花,Finetek欧洲帐面价值、Zoeterwoude、荷兰)PBS和快速冷冻/ formalin-fixed组织学分析。血清收集分析HDM-specific IgE水平。图1显示了实验设计的概述。

2.3。HDM-Specific IgE

血清HDM-specific IgE水平是衡量ELISA如前所述[18]。任意ELISA单位HDM-specific IgE滴度计算是相对的光密度值集中从HDM-exposed小鼠血清。

2.4。支气管肺泡灌洗液(BALF)

BALF细胞收集和总数量的测定使用卡西细胞计数器(罗氏Innovatis AG, Reutlingen,德国)。离心后300×gfor 10分钟,BALF上层清液被储存在−80°C进行进一步分析(YM1 ELISA)和细胞resuspended RPMI中(Verviers BioWhittaker欧洲,比利时)cytospots的准备。大约50000个细胞被发现到幻灯片使用cytospin 3(美国热Shandon沃尔瑟姆,MA)在450 rpm 5分钟。确定cytospots嗜酸性粒细胞的百分比,一个染色染色(Sigma-Aldrich Zwijndrecht,荷兰)和嗜酸性粒细胞的数量进行统计在300细胞。

mECF-L水平(YM1) BALF上层清液是由一个酶联免疫试剂盒根据制造商的指示(英国研发系统、奥克)。

2.5。肺消化

支气管肺泡灌洗后,左肺剁碎,孵化RPMI中补充10%胎牛血清(Lonza, Verviers、比利时),10μg / mL DNAse我(II级从牛胰腺,罗氏应用科学,Almere,荷兰),和0.7毫克/毫升胶原酶(Sigma-Aldrich) 45分钟37°C水浴颤抖。消化的肺组织于70年通过μ米尼龙过滤器(BD生物科学,布雷达,荷兰)来获取单个细胞悬浊液。孵化与稀释10倍Pharmlyse (BD生物科学,布雷达、荷兰)执行lyze污染红细胞。细胞离心到70年μm过滤器帽和用卡西细胞计数器计数(罗氏Innovatis AG)。细胞随后被用于流式细胞术。

2.6。流仪结果

单个肺细胞悬浊液为t细胞染色使用抗体流式细胞术子集。频率效应T细胞(CD3 + CD4 + CD25 + Foxp3−)和调节性T细胞(CD3 + CD4 + CD25 + Foxp3 +)进行使用αCD3-APC / Cy7 (Biolegend,下跌,德国)αCD4-PE / Cy7 (Biolegend),αCD25-PE (Biolegend)αFoxp3-APC (eBioscience,维也纳,奥地利)。一个适当的同形像控制用于Foxp3染色(鼠IgG2ak-APC, eBioscience)。

大约10⁶细胞孵化与相应的抗体组合包括1%正常小鼠血清30分钟在冰上,免受光。洗后的细胞与PBS补充2% FCS EDTA和5毫米,这些细胞被固定和permeabilized 30分钟使用固定和透化作用缓冲(eBioscience)。然后细胞被洗透化作用缓冲和孵化anti-Foxp3包括1%正常小鼠血清30分钟。随后,这些细胞被洗透化作用缓冲,resuspended在流式细胞仪赖氨酸溶液(BD生物科学)和在冰上蒙在鼓里,直到流仪分析。细胞的荧光染色法测定在LSR-II流式细胞分析仪(BD生物科学)和数据分析使用FlowJo软件(美国亚什兰树明星)。

2.7。组织学

部分4μ米被削减从冻结的部分右肺癌和彩色巨噬细胞(老鼠αCD68 Serotec,英国牛津大学)。M2巨噬细胞的数量被确定在冰冻切片染色的YM1(山羊α-mECF-L、研发系统,奥克,英国)使用标准的免疫组织化学过程。CD68和YM1可视化3-amino-9-ethylcarbazole (AEC,西格玛奥德里奇,Zwijndrecht,荷兰)。

formalin-fixed对肺的一部分是嵌入在paraffinthen部分3μ米被削减。识别M1巨噬细胞在组织部分,一夜之间抗原检索是由孵化Tris-HCL缓冲pH值9.0在80°C,然后部分IRF5染色(兔子α-IRF5 ProteinTech欧洲、英国曼彻斯特)使用标准的免疫组织化学过程。确定细胞il - 10的数量生产,抗原检索是由沸腾的部分在柠檬酸缓冲液pH值6.0 10分钟。的部分使用1%牛血清白蛋白(西格玛奥德里奇)和5%的奶粉在PBS 30分钟和孵化的兔子α-IL-10一夜之间(Hycult生物技术,Uden、荷兰)。IRF5和il - 10都可视化ImmPACT束射功率管套件(美国向量,伯林盖姆,CA)。

阳性细胞被手动计数量化实质肺组织(因此不包括大型航空、船舶和浸润,放大200 - 400 x)和总组织区域被使用透视仪的形态学分析量化分析软件(Aperio, Vista、钙、美国)。细胞的数量每毫米表示²的组织。

2.8。统计分析

确定数据是正态分布Kolmogorov-Smirnov测试使用。如果数据不是正态分布,进行适当的转换。模型之间的差异进行了测试使用单向方差分析(方差分析)与图基的事后多重比较和试验与学生的性别差异进行了测试t测试。皮尔森相关系数计算分析炎症参数之间的相关性和巨噬细胞的表型,在巨噬细胞表型和相关性(美国GraphPad软件,拉霍亚,CA)。差异被认为是重要的时候,被认为是一个统计趋势。

3所示。结果

3.1。HDM暴露诱发过敏性气道炎症

测试是否接触HDM,根据三个不同的协议,诱发过敏性气道炎症不同,我们研究的一般炎症参数。

更高比例的嗜酸性粒细胞BALF中被发现在所有三个HDM-exposed组相比控制老鼠(图2(一个))。没有观察到BALF中嗜酸性粒细胞的百分比的差异之间的三个HDM协议。HDM-specific IgE水平血清没有受到不同的HDM曝光,只有一种趋势的高水平组中被发现,暴露在21天的HDM协议。在所有协议的HDM曝光,HDM-specific IgE水平非常低的测量校准曲线的检测极限上方(图2 (b))。

较高的三个HDM-exposed组气道炎症是伴随着更高比例的效应T细胞在肺组织相比对照组(图3(一个))。24-day协议显示更高比例的效应T细胞在肺部比14 - 21天的协议。HDM暴露后的调节性T细胞的比例也高在所有三个协议相比控制老鼠(图3 (b))。24-day HDM协议相比,肺诱导调节性T细胞的比例更高,14日协议。效应T细胞的比例前来参加调节性T细胞是在连续24天的HDM协议相比对照组和另外两个HDM协议(图3 (c))。

在女性,HDM暴露诱导更多的嗜酸性粒细胞()、效应T细胞(),调节性T细胞()和更高的HDM-specific IgE水平(比男性)。

3.2。HDM暴露诱发M1和M2巨噬细胞,但抑制M2-Like巨噬细胞

研究巨噬细胞的表型HDM曝光后根据三种不同的协议,我们一共彩色标记的肺组织巨噬细胞(CD68) M1巨噬细胞(IRF5), M2巨噬细胞(YM1)和M2-like巨噬细胞(il - 10)和计算阳性细胞在实质组织中。

HDM-exposed老鼠有更多CD68-positive肺组织细胞相比控制老鼠(图4(一))。没有观察到CD68-positive数字的差异之间的HDM协议。控制老鼠相比,IRF5-positive细胞人数在14 - 21天的协议,但不是在小鼠暴露前来参加HDM根据连续24天的协议(图4 (b))。HDM模型,降低IRF5-positive数字之间被发现在老鼠肺部暴露前来参加HDM根据连续24天的协议相比,14天的老鼠HDM协议。

YM1,所有HDM协议诱导更多的YM1-positive细胞相比控制(图4 (c))。然而,老鼠暴露YM1-positive 24-day HDM协议数量较多的细胞比14天的小鼠肺组织HDM协议。BALF YM1水平升高在所有HDM模型与控制,但没有模型(图之间的差异被发现5)。有趣的是,HDM暴露导致显著降低IL-10-positive细胞的数量在所有三个协议相比control-treated组(图4 (d))。没有观察IL-10-positive细胞数量差异三个HDM协议。

HDM-exposed女性有更多CD68-positive细胞(),YM1-positive细胞(),更高水平的BALF YM1 ()比男性,而没有发现差异IRF5——IL-10-positve两性之间的细胞数量。

3.3。M2巨噬细胞积极与气道炎症的参数

评估气道炎症的严重程度是如何反映在三个主要的存在巨噬细胞表型,我们过敏性气道炎症的相关参数与不同的巨噬细胞表型HDM-exposed老鼠(表1)。

数量的CD68-positive细胞相关积极与BALF中嗜酸性粒细胞的百分比()、效应T细胞(趋势,)和调节性T细胞()在肺HDM-exposed老鼠,这表明严重疾病伴随着更多的巨噬细胞。大多数这些巨噬细胞似乎YM1-positive只有YM1-positive细胞数量与BALF中嗜酸性粒细胞的百分比显著相关(,图6)和调节性T细胞的比例()在肺部组织。没有发现男性和女性之间的差异。

3.4。M2巨噬细胞与IRF5-Positive IL-10-Positive细胞负相关

研究不同的巨噬细胞表型之间的关系在过敏性气道炎症,YM1-postive之间的相关性是,IRF5-positive IL-10-positive, CD68-positive细胞在肺组织的HDM-exposed老鼠(表2)。

数量的IRF5-positive细胞与细胞CD68阳性负相关(趋势,在肺组织)和YM1 (,图7(一))。YM1-positive IL-10-positve细胞的细胞与负相关号码(,图7 (b)),并积极与CD68-positive肺组织细胞的数量()。没有发现男性和女性之间的差异。

4所示。讨论

我们的研究表明巨噬细胞表型之间的平衡变化过敏炎症的严重程度增加。更高的M2 HDM-exposed小鼠巨噬细胞的数量与BALF中嗜酸性粒细胞的百分比更高。同时降低M1巨噬细胞的数量和M2-like巨噬细胞在老鼠被发现有严重的炎症,因此这些与M2巨噬细胞相关的负面。此外,我们已经再次证实,女性更明显较高的气道炎症的M2巨噬细胞数量比男性(19]。

我们的模型用于研究短期接触HDM和他们给我们的信息分布不同的巨噬细胞在诱导哮喘表型。在这些模型中,我们发现,长时间的曝光HDM没有引发更严重的嗜酸性粒细胞的炎症反应,但也导致更高的M2巨噬细胞的数量和更高比例的效应和调节性T细胞在肺的老鼠。我们没有发现嗜酸性粒细胞的模型之间的差异可能是由于组织内的大变化。然而,当分析所有HDM-exposed老鼠分别与总巨噬细胞和嗜酸性粒细胞相关积极M2巨噬细胞,证实了我们之前的发现在人类M2巨噬细胞与增加哮喘严重程度增加20.]。过敏性气道炎症的另一个重要参数,血清HDM-specific IgE,几乎不能被探测到可能是因为模型的持续时间太短。需要3周左右天真的B细胞成熟浆细胞和从IgM生产IgE后第一次接触抗原(21]。模型最多持续了24天前我们因此牺牲动物的IgE响应可以开发。也从其他组织使用这些模型的研究并没有显示HDM-specific IgE血清中(15- - - - - -17]。调查中巨噬细胞表型是如何分布,为更多的慢性疾病,不再需要使用HDM-exposure模型。

我们试图表型不同的巨噬细胞在肺组织中使用标记可以区分每个子集表现型。我们确定了使用表达YM1 M2巨噬细胞,这是独特的表型在肺。先前的研究发现,只有巨噬细胞表达YM1和其他细胞染色阳性的染色并不复杂(22- - - - - -24]。一个独特的标志识别M1肺组织中巨噬细胞,然而,更难找到。为组织知识选择性表面标记不可用,因此il - 12和氧自由基的生产已被用于一些老鼠研究[25,26]。在哮喘、氧自由基不能用于对M1巨噬细胞染色,因为这些也是丰富的嗜酸性粒细胞产生的大量存在于(27]。最近,IRF5被发现转录因子控制M1分化。M1巨噬细胞中高度表达,它抑制了M2表型(5]。我们的研究是第一个使用IRF5作为M1标记在肺组织,它是一个相当选择性标记。支气管上皮细胞和传入的白细胞浸润也IRF5染色呈阳性,但是这些可以排除在基于定位的实质组织的量化。双重染色和CD68确保仅包括巨噬细胞在量化不幸的是目前不可能由于技术不兼容问题。在以前的研究中,M2-like巨噬细胞通常不是区别M2巨噬细胞,因为他们有许多标记,包括甘露糖受体。免疫抑制细胞因子il - 10的生产是最重要的和可靠的特点M2-like巨噬细胞,这些细胞可以用来识别(4]。类似于IRF5、支气管上皮细胞和一些细胞浸润也表达il - 10但这些可以很容易地排除在实质组织的量化。排除其他IL-10-producing细胞从分析双染色CD68是必要的,但目前也不可能的。这些限制在染色IRF5和il - 10可能也解释了为什么YM1的总数,IRF5——IL-10-positive细胞高于CD68-positive细胞的数量。

高数量的M2 HDM-exposed小鼠肺巨噬细胞中发现,这与先前的研究[19,20.,28]。有趣的是,M2巨噬细胞的数量和水平的YM1 BALF相关与BALF中嗜酸性粒细胞。YM1也被称为嗜酸性粒细胞趋化因子(ECF-L) [29日),但建议YM1只有弱嗜酸性粒细胞趋化现象的属性(24,30.]。YM1仍然是争论的趋化现象的力量和我们的研究结果和他人的建议否则[23,31日]。M2巨噬细胞的数量也与调节性T细胞表现出正相关。在一个有趣的研究Tiemessen et al .,调节性T细胞促进M2巨噬细胞的感应到帮助试图保持组织内稳态,防止过多的组织损伤的炎症反应32]。我们的数据可以解释沿着这些思路与传入的调节性T细胞诱导M2巨噬细胞为了限制HDM引起的炎症和组织损伤。M2巨噬细胞将炎症和有益的结果,而不是导致过敏性气道炎症,这仍是一个争论(19,33,34]。

哮喘是由Th2-driven炎症,但证据表明,M1巨噬细胞也存在于这种疾病。在两个有趣的研究中,干扰素γ刺激巨噬细胞被证明预防过敏性气道炎症的发生(35,36]。我们的研究结果具有较高的M1巨噬细胞数量较短的协议和不太严重的疾病表明这些巨噬细胞诱导作为counterregulatory机制抑制炎症。然而,高数量的M1巨噬细胞在哮喘也被严重的哮喘和标记所示M1巨噬细胞与哮喘严重程度,表明M1巨噬细胞发挥作用在严重哮喘(37- - - - - -39]。这似乎不是我们的结果是这样,因为我们发现高数量的M1巨噬细胞在过敏性气道炎症的发病效应T细胞的数量较低时,和更低的M1巨噬细胞数量24-day HDM协议当效应T细胞数量更高。M1巨噬细胞似乎有益的作用,防止过敏敏化,但在他们发展已经建立疾病严重的表型。类似的双重角色已经报道了M1在过敏性气道炎症细胞因子il - 12 (40]。因为我们的HDM模型短期和关注疾病的发作,我们没有信息在建立M1巨噬细胞的存在,更严重的疾病。

自从M2-like巨噬细胞有抗炎作用,我们感兴趣的存在这巨噬细胞表型HDM-induced哮喘。其他人已经报道,间质巨噬细胞是IL-10-producing与这些巨噬细胞致敏小鼠的巨噬细胞和治疗预防过敏性气道炎症的发展(41]。我们的观察低数量的M2-like巨噬细胞在哮喘控制符合这些和以前相比发现在人类哮喘患者(42,43]。有趣的是,结果表明,在严重的哮喘病患者il - 10生产更低到中度哮喘患者相比,治疗糖皮质激素诱发巨噬细胞il - 10生产的(43,44]。这表明特定刺激的巨噬细胞极化M2-like巨噬细胞产生il - 10可能减少哮喘的症状。

女性比男性遭受更严重的哮喘,这一现象被发现在哮喘小鼠模型(45,46]。性激素的作用已经被提出过,但底层机制是未知的(47]。按照之前的发现,我们表明,HDM-exposed雌性小鼠更明显比雄性小鼠气道炎症。在巨噬细胞表型,我们只发现了一个区别在M2巨噬细胞。因为我们和其他人发现M2巨噬细胞和哮喘严重程度之间的相关性,这可能表明,这种表型可能发挥作用在雌性(增加气道炎症19]。

5。结论

综上所述,我们的数据表明,在过敏性气道炎症的发展M1和M2巨噬细胞诱导或招募,而M2-like巨噬细胞是阻止朝着或抑制。随着HDM-induced炎症的发展,M1巨噬细胞减少赞成M2巨噬细胞可能调节性T细胞的影响下,试图限制炎症。他们的工作可能会受到这一事实IL-10-producing M2-like巨噬细胞不发展HDM-induced炎症,炎症可以进步。影响这种不平衡关系由巨噬细胞靶向治疗可能是一种新颖的治疗哮喘的方法。

利益冲突

作者没有利益冲突披露。

承认

这项工作是支持的从荷兰3.2.10.056哮喘基金会的资助(BNM)。