糖皮质激素受体在地塞米松诱导大鼠海马神经前体细胞凋亡中的作用

摘要

背景. 地塞米松（Dex）已用于减少辅助通气早产儿的炎症，并预防慢性肺部疾病。然而，Dex治疗会对大脑产生不良影响。由于海马含有高密度的糖皮质激素受体（GCR），我们假设Dex通过炎症介质影响海马的神经发生。方法．Albino Wistar大鼠幼犬首先在产后第1天（P1）上获得单剂量的DEX（0.5mg / kg），并在p2，p3，p5和p7上处死。将一组DEX处理的幼株（DEX处理的D1D2）含有米非司酮（RU486，GCR拮抗剂），并在P2上处死。分离出海马对蛋白质印迹分析，TUNEL，切割胱天蛋白酶3染色的细胞计数和形态学评估。对照幼崽接受了正常盐水（NS）。结果. Dex降低了体重的发育增益，但对大脑重量没有影响。在Dex处理的D1D2组中，根据TUNEL和切割的caspase 3染色，凋亡细胞数量增加。大多数凋亡细胞表达神经祖细胞标志物nestin。经RU486预处理后，Dex诱导的P1幼鼠细胞凋亡显著减少（60%），表明GCR的参与。结论．地塞米松的早期给药导致在海马神经祖细胞的细胞凋亡，这是通过GCRS介导的。

1.导言

皮质类固醇用于早产儿抑制炎症，促进拔管，和/或预防慢性肺病[1-3.］．然而，这种早期的地塞米松（DEX）治疗可以导致不良神经发育结果[4.那5.］．例如，地塞米松治疗降低脑灰质体积而不影响白质和基底神经节，这表明塞米松只影响某些细胞在脑中[6.-8.］．

在海马的齿状回（DG）的神经元继续术语后分，因此在出生后早期期间仍然容易受到类固醇的不利影响[9.-11.］．海马细胞具有高密度的糖皮质激素受体（GCR）[12.]建议他们可能会受到DEX的影响[8.-13.］．右美托咪定可以改变海马体的突触可塑性[14.］．因为老鼠和人类在不同的胚胎时间尺度上发育[15.[P1上的大鼠幼犬对应于妊娠的约22至24周的人胎儿。发展的等同物反映在脑体重，神经化学，脑电图和突触中反映[16.］．因此，大鼠幼鼠可作为接触药物的人类早产儿的动物模型[17.］．

在此，我们研究了单剂量Dex治疗的效果以及GCRs对海马发育的作用。

2。材料和方法

2．1.动物

该研究经成大的动物护理和使用委员会。Time-dated pregnant Albino Wistar rats (body weight 250–300 g) were used. Food and water were provided随意. 母鼠被允许在妊娠第21天自然分娩1.动物保存在通风房12/12温度下的摄氏度 h光/暗循环。出生日期指定为P0。

２.２.研究设计

在一项初步研究中，每只幼崽被分为两组：Dex组接受一定剂量的Dex磷酸盐（0.1、0.2或0.5） mg/kg，腹腔注射）（Oradexon，4 mg/mL，Organon，荷兰）和对照组接受等量的生理盐水（NS）。与对照组相比，仅用Dex 0.5观察细胞凋亡的变化 mg/kg，因此在随后的实验中使用该剂量。在第1天（P1），幼崽接受0.5%的单次剂量 毫克/千克地塞米松或纳秒。在P2、P3、P5和P7，将幼崽麻醉并用10%水合氯醛（W/V，300）安乐死 mg/kg，德国里德尔·德哈恩），然后经心注入NS。测量身体和离体大脑重量，精确至毫克。脑组织按照标准方案进行组织学处理，并在第5天连续切割 μM在冠状面。

2.3。免疫组化和免疫荧光染色

脑切片匹配到E22冠板12到产前大鼠脑发育图谱1518.］．切片通过免疫组织化学（IHC）和/或免疫荧光（IF），TUNEL和染色双IF方法，使用由制造商推荐的方案或先前所描述的[19.］．使用以下TUNEL检测试剂盒和一抗原发性抗体：TDT-FROMEL DNA碎片检测试剂盒，Appoptag Red原位凋亡检测试剂盒(Calbiochem, San Diego, CA)，抗脑源性神经营养因子(稀释1:20 00)，兔抗糖皮质激素(稀释1:50)(Santa Cruz Biotechnology, Santa Cruz, CA)，小鼠抗肠杆菌素(稀释1:20 00;Santa Cruz Biotechnology)， anti-OX-6(稀释1:50;AbD Serotec，牛津，英国)和anti-NeuN(稀释1:200;Chemi-Con, Temecula, CA)，小鼠抗肌动蛋白和抗pcna(分别稀释1:10 000和1:10 00;Millipore, Billerica, MA)和cleaved caspase 3(稀释1:10 0;Cell Signaling, Boston, MA)。所有的切片都被匹配到相同的解剖位置，以比较dex处理组和对照组的细胞计数。IF染色，生物素化抗兔和抗小鼠IgG (1: 400;(Victor, Burlingame, CA)作为二抗;免疫组化染色山羊抗兔IgG、H&L Chain特异性德克萨斯红结合物和大鼠抗小鼠IgG H&L Chain特异性荧光素结合物(稀释1:400; Calbiochem, San Diego, CA) were used as secondary antibodies. Sections were also double stained using the above primary antibodies and dilutions.

2.4。TUNEL ASSAY.

将这些部分进行TUNEL（癌基因研究，剑桥，MA），如果染色。通过链霉素蛋白 - 辣根过氧化物酶缀合物和二氨基苯并反应检测该信号。

2．5．TUNEL、Cleaved-Caspase 3和NeuN染色细胞计数

切片用光学显微镜检查，图像由一台连接台式电脑的摄像机拍摄(Eclipse 80i，尼康，日本)。在400倍放大倍数下鉴定并计数tunel阳性细胞。计数海马DG、角氨1 (CA1)、CA2和CA3中tunel阳性细胞的数量。为了与对照进行比较，我们分析了同一水平的截面。每只小狗的四个部分被计算，结果被取平均值。在400倍放大下计数Cleaved-caspase 3-和neun阳性细胞²DG的区域。数据通过tissuegnotics FACS-like组织细胞计数软件(奥地利维也纳)验证。该方法在后续实验中也应用于免疫组化、IF和双染色细胞。

2.6。组织解剖和Western印迹分析

在右美托咪定或NS治疗(D1D2)后1天，P2组小鼠海马解剖。如前所述，对海马匀浆的胞质和核部分进行Western blot [19.］．简单地说,20μg蛋白匀浆经Bradford蛋白测定(Bio-Rad, Hercules, CA)， SDS-PAGE分离，在硝基纤维素(Hy-Bond, Amersham, Arlington Heights, IL)上印迹，用脱脂奶粉阻断。印迹与特异性一抗孵育，然后与辣根过氧化物酶结合的二抗(Abcam, Cambridge, UK)孵育，并通过增强化学发光(Bio-Rad)检测。标本被归一化成肌动蛋白和增殖细胞核抗原(pCNA)）蛋白（密理博）。每个实验至少重复三次。

2.7. 米非司酮（RU486）治疗

GCR拮抗剂Ru486（Tocris Bioscience，Ellisville，Mo）溶解在100mM DMSO中。在Dex注射之前30分钟，P1幼崽腹膜内接受25mg / kg ru486或载体[20.]. 经RU486-和DMSO处理的幼崽（D1D2）经Dex处理或未经Dex处理后，在P2上实施安乐死，并如上所述进行形态学和生化分析。

2.8。统计分析

定量结果表示为平均标准错误（SE）。使用一种或双向ANOVA进行统计分析，其具有多重比较或威尔科逊症符号测试的多种比较。价值观0.05被认为是统计学意义。通过混合模型Anova分析身体和脑重量，随着受试者内部因子和DEX作为受试者因子。

结果

3.1。身体和脑重量

Pups that had received Dex (0.5 mg/kg) showed reduced body weights. In contrast, no difference in the developmental growth of brain weight was found between the Dex and control groups (Table1)．

3.2. 凋亡细胞死亡

在P1 D1D2 dex处理组的DG中发现了更多的tunel阳性和cleaved-caspase - 3阳性细胞(图)1（b）和1（e）)，增加至2.7至3倍（图1（c）和1（f））关于对照（图1（a）和1（d）)．

3.3。细胞计数和细胞凋亡和神经元成熟标记的共表达

Tunel，Nestin和Neun染色的代表结果如图所示2．我们发现，在dex处理的D1D2组中，tunel阳性细胞的数量约为前者的两倍()，而对照组为21.81.2;） （数字3（a）)．的地塞米松治疗组具有TUNEL阳性细胞的更大比例（)与对照组相比，共表达nestin（0.61）0.01）（图3（b）)．dex处理组中tunel阳性细胞共表达NeuN的比例也更高(）而不是控制（0.640.01;） （数字3（c）)．

3.4。糖皮质激素受体(GCRs)和米非司酮(RU486)在dex诱导凋亡中的作用

Western印迹分析表明，在海马GCRS的细胞核部分的地塞米松治疗组D1D2中被上调（图4.)．在体重的DEX-延迟发育增益被阻断而RU486既不塞米松也不RU486影响该组中的脑重量（表2). 此外，预先给药RU486可减少P1 D1D2组中Dex诱导的细胞凋亡（图5.)．单独的DEX治疗增加了凋亡细胞计数（)与对照组(）;）;DMSO处理幼犬的凋亡细胞数量(）或DMSO PLUS DEX（41.90.56）与单独用NS或DEX处理的幼崽相似（)．与NS或DMSO组相比，RU486处理对细胞凋亡没有额外的影响。RU486预处理后Dex降低凋亡细胞数量(）（） （数字5.)．

3.5. 炎症细胞的鉴定

eosin /苏木精或IHC染色未揭示NS和DEX处理的D1D2中的任何炎症细胞。植入大鼠脑肿瘤细胞后的阳性对照揭示了OX-6阳性细胞（染色棕色），这有助于鉴定脑中的小胶质细胞（图6.)．

4.讨论

服药长期以来已经用于早产儿的呼吸系统问题[21.］．不良神经效应的并发症（例如脑瘫和神经发育障碍的风险增加[4.那22.那23.]在产后实践中要求重新评估基于类固醇的治疗策略[23.-26.］．Dex的安全时机和剂量仍未确定预先用于早产患者[4.］．我们的P1大鼠幼犬的结果，相当于24周的早产儿，表明DEX延迟了体重的发育增益，与前面的报告一致[27.-29.］．此外，新生儿接触右美托定会导致神经发育和生理成熟延迟，这表明右美托定永久性地改变了这一时期的神经元功能，特别是与下丘脑-垂体-肾上腺轴相关的功能[27.-29.]. 其他研究表明，新生儿接触Dex可降低大脑重量[10.那28.-32］．相反，我们的数据并没有显示出这种变化。我们将这种差异归因于Dex在时间、剂量和/或制备上的差异[28.那31那32］．在临床医生中，一般共识是较低剂量的DEX（0.1-0.2mg / kg /天）促进气管拔管并降低慢性肺病的风险。本研究表明，单次低剂量（0.1-0.2mg / kg）没有对大脑的有害影响（0.1-0.2mg / kg），尽管它变得有害以更高的剂量（0.5mg / kg）。DG的亚体区含有神经眼压祖细胞的储备[33］．细胞凋亡在神经元发育过程中至关重要，通过消除多余的细胞和确保适当的突触连接[34那35］．已知GCRS参与Dex诱导的细胞凋亡[36]在海马中存在高水平，其中祖细胞能够分开DG。我们的结果表明，在整个DG中表明凋亡增加，表明海马的围产期发育甚至在临界时间给出时甚至在单剂量的DEX中。这种效果如何与GCR密度，受体类型相关，并且祖细胞的增殖仍有待研究。

有报道称，3.0 mg/kg Dex给P7小鼠可增加小脑祖细胞凋亡，减少小脑神经元数量[37那38］．可以将Dex治疗和神经祖细胞脆弱性与糖皮质激素的剂量和脆性的剂量和定时相结合在一起确定对新生儿脑发育的影响。

暴露于地塞米松在新生儿期导致标记的细胞凋亡在DG [表达巢蛋白的细胞中39］．Dex诱导的海马细胞凋亡的重要性和受影响的细胞类型仍然未知。我们的Dex治疗幼仔中的双染色结果表明，将TUNEL和Nestin的细胞比较较高，表明DEX诱导的细胞凋亡会影响神经舒育细胞。该结果与先前的报告一致，即在新生儿期间，神经舒膏细胞对DEX敏感[39那40］．由于TUNEL和NeuN共表达细胞与TUNEL阳性细胞的比例也增加，Dex治疗也可能导致成熟神经元凋亡，并与海马发育过程中细胞增殖的短暂和急性减缓有关[41那42］．这些神经元是来自增殖的前体细胞，还是代表DG中现有的成熟神经元，尚待确定。

MIFEPRISTOTE（或RU-486）是一种合成类固醇，具有抗原敏酮和抗气敏性质。在最近的一项研究中，米非司酮是唯一发现在大鼠前皮层中增加矿物质激素受体（MCR）和GCR结合的GCR拮抗剂[43］．米非司酮对皮质类固醇受体表达的影响可以解释据报道诱导的神经认知改善[43那44］．RU486对Dex对胸腺细胞组成和成熟没有影响[45］．MCR介导对糖皮质激素，而不是GCR的反应在类固醇响应性听力障碍中是重要的[46］．在出生后的第一周，海马体的GCR活动水平很高[40］．糖皮质激素的抗炎作用需要GCR的存在[47］．有趣的是，这些研究和我们自己的研究结果(RU486使右美托嗪诱导的细胞凋亡减少60%)是一致的，表明受体类型和右美托嗪治疗的时间决定了糖皮质激素对海马的影响。用伊红/苏木精或免疫组化染色检查幼犬脑组织，发现NS和dex处理的D1D2组没有炎症细胞。这些结果表明，虽然GCRs可能是dex诱导的神经祖细胞死亡的关键因素，但炎症细胞不是。

总之，脑发育是一种动态过程，其中对临界时期发生对内源性（和外源）类固醇的生长刺激，分化和细胞应对。物种差异为该过程增加了进一步的复杂性。这些物种特定的发展计划允许设计动物模型，以研究药物治疗在早产婴儿的影响，如本研究。在这里，我们已经证明了定时是在海马中确定DEX诱导的细胞凋亡的主要因素，脆弱的细胞是神经元前体，并且该方法部分受到GCR的调节。我们还提供了细胞学证据表明单剂量DEX的给药可能导致大脑中的有害影响。

的缩写列表

敏捷:	地塞米松
GCR：	糖皮质激素受体
DG：	牙齿回归
CA:	Cornu氨氨.
ru486：	米非司酮
BDNF：	脑衍生的神经营养因子
NS:	生理盐水
P1 / P0:	第1天/天0初生的幼仔
D1D2：	幼仔在第1天接受地塞米松注射液，牺牲第2天
IHC：	免疫组织化学
如果:	免疫荧光
TUNEL:	末端脱氧核苷酸转移酶dUTP刻痕末端标记。

致谢

The authors thank Dr. K. S. Hsu for help with experimental design, Ms. Pei-Yu Lee for assistance in image acquisition and analysis using FACS-like Tissue Cytometry at the Center of Clinical Medicine, NCKU Hospital and support from an NCKU Academic Summit Program, Individual Research Project/Integrated Research Project (D100-35001), and the National Science Council (NSC-92-2314-B-006-073).

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