文摘
气道上皮细胞通过直接暴露在饮用酒精呼气volatized乙醇的支气管循环。酒精暴露会导致快速增加纤毛拍频(CBF)的支气管纤毛上皮细胞,后跟一个慢性脱敏的刺激反应。这一效应是由一氧化氮调控部分的环鸟苷和腺苷monophosphate-dependent蛋白激酶(包裹和PKA)并不是完全理解。不对称dimethylarginine (ADMA)、内源性一氧化氮合酶抑制剂,是涉及一些肺部疾病的发病机理。我们假设一氧化氮合酶的抑制ADMA块alcohol-stimulated CBF的增加。为了测试这个假说,纤毛主要牛支气管上皮细胞(BBEC)与ADMA preincubated (100µ米)和100毫米乙醇刺激。CBF测量和PKA化验。1小时,乙醇激活PKA,导致CBF升高。饮酒导致的PKA激活和CBF ADMA的存在是被抑制的。ADMA PKA活动或CBF本身没有影响。使用鼠标模型overexpressing ADMA-degrading酶,dimethylarginine dimethylaminohydrolase (DDAH),我们检查了PKA的鼠肺和CBF展示片。Alcohol-stimulated增加肺片PKA、CBF暂时增强DDAH的老鼠和老鼠的控制。
1。介绍
酒精使用障碍与增加肺部感染包括肺炎和支气管炎1]。虽然酒精是一个风险因素建立急性肺损伤导致脓毒症(2)、肺免疫抑制也是一个常见的反应重,持续饮酒(3]。慢性酒精暴露也会损害肺部先天宿主防御减感作用的有效的黏膜纤毛的清除(1),使纤毛对压力的反应迟钝。集体,这多方面的酒精对肺功能的病理生理学的影响被称为“酒精肺病”[4]。
酒精是一种小型、无电荷的分子很容易穿过细胞膜的脂质双分子层,容易进入肺部,多达15%的酒精摄入可以分泌挥发性的呼气酒精通过航空公司。与溶氧和二氧化碳,流量通过肺循环和肺泡空间,系统性动脉血液酒精直接尾气通过扩散到进行气管支气管循环(5]。此外,更高的局部浓度的乙醇可以找到航空公司的肺由于蒸汽凝结或呼出酒精的“雨”效应(1]。由于这些原因,肺部的气道纤毛上皮细胞衬直接暴露在人喝大量的酒精。
当气道纤毛上皮细胞暴露于病理生理的乙醇浓度长时间,改变发生在细胞的应对外界刺激的能力。具体来说,规范纤毛刺激响应吸入粒子增加的拍频变得麻木的持续接触酒精(1]。这个脱敏包括下游循环nucleotide-dependent的解偶联蛋白激酶纤毛axonemal行动目标(6]。相比之下,短暂的酒精暴露增加迅速,即使是暂时性的纤毛拍频(CBF)的支气管上皮细胞(7]。这对纤毛是受酒精影响的一氧化氮(NO)介导调节环腺monophosphate-dependent蛋白激酶(PKA) [1]。然而,最初的确切机制过渡饮酒导致的纤毛刺激反应朝着最终纤毛脱敏并不完全理解。
20年前第一次证明(8),显著ADMA水平发现肺(9)特别是支气管上皮细胞(10]。ADMA的失调的发病机制涉及一些肺部疾病如哮喘、纤维化,肺动脉高压,脓毒症11]。以前,我们已经表明,体内合成应用NOS抑制剂能够阻止alcohol-stimulated PKA激活,从而防止刺激CBF响应(1,12]。因此,我们假设的行动从内部产生一氧化氮合酶抑制剂,ADMA,街区alcohol-stimulated CBF的增加。ADMA号的行动可能因此代表了机械的通路alcohol-mediated过渡的纤毛从刺激到麻木的表型。
2。材料和方法
2.1。老鼠
野生型(WT) C57BL / 6和dimethylarginine dimethylaminohydrolase转基因(DDAH-I)小鼠C57BL / 6株,过表达DDAH最初从杰克逊实验室获得(巴尔港,我),随后在UNMC microisolator单位培育和维护特定的无菌动物设施。的转基因表达hDDAH观察主动脉,心脏和大脑。老鼠被允许食物和水随意在6 - 12周的年龄和使用实验。所有的动物被用于根据美国国立卫生研究院的指导方针和内布拉斯加州大学医学中心机构动物保健,和使用委员会批准了这项研究。
2.2。体外小鼠气管环模型
老鼠牺牲,气管和肺被移除。每个气管切除和维护在无菌无血清M199含有青霉素和链霉素(100台/ 100毫克每毫升)(Gibco)和二性霉素b (2μg / mL)在室温下(Gibco)。气管环切(宽度≈0.5 - 1毫米)从气管的远端近端第一个气管分叉成左右主流支气管。五环在无血清培养M199 (Gibco)测量CBF决定前30分钟。CBF测量基线后,气管环被孵化与实验治疗6小时37°C和5%有限公司2然后在25°C被允许平衡前10分钟CBF读数记录。此外,治疗后的气管上皮细胞从剩下的提取与无菌细胞升降机(费舍尔,斯普林菲尔德,NJ)细胞溶菌作用缓冲(如前所述13]。上皮细胞溶解产物然后立刻瞬间冷冻在液氮PKA活性测定。
2.3。体外小鼠肺片模型
展示肺(PCL)片是如前所述14]。短暂、C57BL / 6或DDAH-I老鼠牺牲和肺膨胀与低熔点琼脂糖(表达载体,卡尔斯巴德,CA)。冷冻的肺被切到150年μ4500展示片(OTS组织切片机,电子显微镜,哈特菲尔德,PA)其次是孵化在37°C将琼脂糖。片(3 - 5)被放置在12-well组织文化板块。经过5天的孵化与每日变化的媒体,片受到长达1小时和100毫米乙醇,CBF测量。肺片在液氮snap-frozen PKA活性测定。数据规范化PCL蛋白的总金额包含在每一个。
2.4。纤毛细胞培养
纤毛小鼠气管上皮细胞(MTEC)使用一个气液界面培养系统(如前所述)(15]。主牛支气管上皮细胞(BBEC)得到刚从牛肺(康尼格拉公司,奥马哈,NE)和汇合的单层膜在培养如前所述[16]。
2.5。细胞生存能力分析
一个整除(50μL) BBEC层的上层的媒体,气管环,MTEC,或与ADMA PCL片治疗,乙醇,细胞生存能力或媒体就化验使用TOX-7工具包(σ)测定乳酸脱氢酶(LDH)释放,根据制造商的指示。作为一个积极的控制,汇合的60毫米菜肴BBEC细胞细胞溶解和LDH测量。
2.6。免疫组织化学ADMA和DDAH
小鼠肺inflation-fixed formaldehyde-PBS通过气管与10%,处理,石蜡包埋,切片(5μ米)。安装幻灯片都是彩色ADMA或DDAH的表情。免疫组织化学检测的自由和蛋白结合的ADMA执行使用一只兔子anti-ADMA抗体(1:1000;EMD微孔、Billerica MA)或兔子anti-DDAH-I和DDAH-II抗体(1:400;圣克鲁斯生物技术、达拉斯、TX)。部分deparaffinized,补充水分,用PBS。染色之前,内源性过氧化物酶活性抑制使用Peroxo-Block(酶实验室、南圣弗朗西斯科、CA)。幻灯片是孵化与初级抗体和30分钟使用一个immunoperoxidase开发工具包(向量实验室,伯林盖姆,CA)。控制部分正常孵化与特异性的兔免疫球蛋白(σ)二级抗体紧随其后。所有的部分都与苏木精复染色(费舍尔科学)。所有幻灯片都被扫描组织科学设施内布拉斯加州大学医学中心在40 x Ventana Coreo每像素分辨率为0.2325微米(Ventana,图森,亚利桑那州)。
2.7。纤毛拍频分析
CBF从粘附细胞记录,气管环,展示肺片media-submerged文化。跳动的频率纤毛和运动型的总数在给定领域的观点确定使用Sisson-Ammons视频分析系统(萨瓦河)[17]。
2.8。PKA活性测定
主要MTEC隔绝气管直接或在气液界面培养以及PCL切片化验的PKA活性。实验处理条件后,文化上层清液被移除,250μL细胞裂解缓冲了,瞬间冷冻细胞或组织。菜被解冻,刮到离心管和保存在冰。包含细胞的上清液用,细胞被离心机在4°C 10000×g 30分钟。PKA活性测定可溶性部分从提取的细胞或组织样品(如前所述)(13]。数据标准化的总量细胞蛋白质化验和表达为pmol放射性标记的磷酸转移到一个标准的heptapeptide衬底(Leu-Arg-Arg-Ala-Ser-Leu-Gly;σ)每分钟的反应时间。每一个独特的条件至少测量3个独立的实验。
2.9。统计分析
复制数据从至少3单独的实验提出了均值的平均值±标准误差(SEM)。单向方差分析(方差分析)与图基multicomparison期末测验是用来比较3或更多组之间的反应。组接受差异显著使用95%置信区间()。在所有分析,GraphPad棱镜(圣地亚哥,CA;5.01版)软件是用来确定统计学意义。
3所示。结果
3.1。ADMA和DDAH位于气道上皮的纤毛细胞
而肺已被证明具有较高的表达DDAH-I [18]和DDAH-II [10),具体ADMA的气道上皮细胞表达并没有被证实。我们假设ADMA和DDAH优先表达气道纤毛细胞。为了验证这个假设,从小鼠肺组织免疫组化进行部分确定存在和细胞ADMA和DDAH的位置。部分是沾染了初级抗体ADMA DDAH-I或DDAH-II和检测使用一个次要immunoperoxidase-conjugated抗体检测反应。随时可见棕色染色观察肺部分对应ADMA, DDAH-I, DDAH-II在野生型小鼠(图1)。3蛋白质染色明显在肺泡实质但尤为突出在气道上皮细胞衬在近端和远端地区的肺。同样,ADMA、DDAH-I DDAH-II都检测到肺的转基因小鼠DDAH-I表达虽然ADMA水平似乎有所减少,但仍然存在。肺部分都与苏木精染色显示可见的紫色染色复染色没有任何积极的棕色染色由于主要抗体本地化。控制,肺组织切片是孵化与非特异性免疫球蛋白其次是相同的二次抗体上面使用。这些结果表明,气道纤毛上皮细胞含有大量的ADMA, DDAH-I, DDAH-II。
3.2。单独增加ADMA水平没有基线影响纤毛
因为ADMA和DDAH明显本地化的气道纤毛上皮如果状态,如果我们假设基线CBF不是一氧化氮这不会影响通过改变ADMA水平。为了验证这个假设,我们测量如果CBF接触后补充ADMA。小鼠气管纤毛环打不受外源治疗10μ打光最后一毫米ADMA在6小时内(图进行测试2)。一个小,但无关紧要,CBF减少人力资源的条件下观察治疗6点nonphysiologic ADMA浓度(10毫米)。同样,如果基线CBF的气管环DDAH转基因老鼠并不不同于野生型小鼠,而β受体激动剂(procaterol;10 nM)显著刺激CBF野生型和DDAH老鼠(数据未显示)。这些数据表明,增加ADMA水平生理相关不改变纤毛跳动在缺乏其他纤毛调制器。
3.3。ADMA块Alcohol-Stimulated CBF和PKA活动增加牛支气管上皮细胞
以前,我们已经表明,短期酒精快速治疗支气管上皮细胞纤毛和暂时性的刺激增加纤毛击败oxide-dependent氮的方式(1]。虽然增加ADMA本身对CBF没有影响(如图2),我们假设高架ADMA将阻止酒精/ NO-induced CBF的刺激。纤毛打进牛支气管上皮细胞纤毛的主要文化(BBEC)大大刺激了1小时酒精(100毫米;图3(一个))。预处理的BBEC 100μM ADMA 30分钟前饮酒导致的增加CBF酒精刺激完全阻塞。这种抑制alcohol-stimulated CBF相当的NOS抑制剂,NG-Monomethyl-L-arginine (L-NMMA)。因为alcohol-stimulated不需要生产alcohol-stimulated PKA激活和随后的CBF的增加(1),我们假设ADMA通过酒精块PKA激活。为了验证这个假设,我们测量PKA活动alcohol-exposed BBEC ADMA的存在与否。而1小时酒精(100毫米)治疗显著升高BBEC PKA,与100年预处理μM ADMA或10μM L-NMMA前30分钟酒精刺激了ethanol-stimulated PKA的增加(图3 (b))。这些数据表明,ADMA阻止alcohol-stimulated NO-mediated增加PKA-stimulated CBF。
(一)
(b)
3.4。酒精的刺激气管上皮CBF增强小鼠表达一个ADMA-Degrading酶
因为ADMA退化的行动dimethylaminohydrolase L-citrulline (DDAH),我们假设超表达CBF的DDAH提高酒精的刺激。为了验证这个假设,我们决定DDAH水平升高的影响alcohol-stimulated任何行动关于PKA激活和CBF从小鼠气管纤毛上皮戒指来自转基因老鼠overexpressing DDAH-I, ADMA-degrading酶。与野生型小鼠相比,酒精更迅速刺激气管纤毛的CBF DDAH overexpressing老鼠。Alcohol-stimulated CBF DDAH老鼠在15 35分钟相比,在野生型小鼠(图40 - 50分钟4)。此外,增强CBF的峰值大小DDAH老鼠在30分钟的峰值大小显著增加野生型小鼠在1小时(数据没有显示)。这些结果表明,高水平的DDAH提高alcohol-stimulated纤毛响应通过促进潜在号激活对酒精的反应。
3.5。Alcohol-Stimulated增加肺片气道CBF和PKA增强DDAH老鼠
以前,我们报道一个展示肺片模型测量CBF变化(15]。类似于气管环CBF、酒精迅速(1小时)刺激增加小鼠肺片气道CBF(图5)。我们假设肺片由DDAH overexpressing小鼠会增强CBF和PKA对酒精的反应。事实上,CBF从DDAH overexpressing老鼠不仅响应100毫米酒精刺激增加脑血管流量,但也演示了一个重要的(CBF)增加响应与野生型肺片治疗酒精。与气管环,最大CBF的时候在DDAH肺片增强小鼠与野生型小鼠相比(30分钟和1小时)。类似于孤立BBEC,肺片PKA显著(与100毫米)增加了1小时治疗酒精在野生型小鼠(图6)。在肺片DDAH老鼠,PKA激活的时间显著增强相比alcohol-stimulated野生型肺片在15 - 30分钟。直到1小时,alcohol-stimulated PKA活性在野生型小鼠成为相当于DDAH的老鼠。这些数据表明,气道epithelial-localized DDAH函数能增强NO-mediated纤毛刺激反应(PKA活动增加和CBF)保存结构的肺片以及个人支气管上皮细胞。总的来说,这些数据表明,ADMA调节CBF的作用与DDAH的作用影响过渡酒精对纤毛的影响从最初的CBF刺激对最终解偶联NO-mediated纤毛刺激观察慢性酒精脱敏黏膜纤毛的清除。
4所示。讨论
我们的研究结果表明,ADMA,内源性抑制剂不,肺中高度表达,特别是局部气道纤毛上皮。预处理ADMA块alcohol-stimulated PKA活性的增加和纤毛跳动在体外暴露牛细胞培养。老鼠过多表达DDAH的内源性酶降解ADMA,展示一个增强的PKA CBF反应在他们的气管环纤毛上皮急性酒精治疗。同样,老鼠过多表达DDAH演示一个增强的PKA CBF反应在他们的肺片治疗急性酒精。这些数据表明,ADMA的内生监管机构行动没有针对酒精暴露的航空公司。ADMA可能代表一个潜在的途径alcohol-elevated没有水平降低,PKA活性降低,刺激纤毛打回到基线水平。
酒独特的要求都没有(7和环核苷酸海拔13为了刺激CBF(图)7)。一个alcohol-sensitive可溶性腺苷酸环化酶(12)和guanylyl环化酶都与纤毛该公司(称为什么19]。没有生成(1和激活的包裹1),酒精不能激活PKA,必要激酶ethanol-stimulated CBF的增加(6]。最近,这是表明,短暂的酒精治疗导致热休克蛋白90(一半)磷酸化和绑定以挪士顶端区域的气道纤毛上皮细胞(20.]。这个绑定和陪护人员的一半寿命的函数可以在纤毛细胞激活以挪士。ADMA的行动可能会作为一个“开关”以挪士激活,从而导致最终回到基线CBF的水平观察酒精治疗后不久。事实上,证据,ADMA能够挡住一半(21]。ADMA的负调节NO-activated CBF支持外生ADMA的抑制作用alcohol-stimulated CBF和增强alcohol-stimulated CBF ADMA的抑制剂,DDAH。ADMA和DDAH高度气道上皮细胞中表达。
建立了肺作为ADMA的主要来源(9],DDAH2已经在老鼠的支气管上皮细胞(本地化10,18]。精氨酸甲基化催化细胞蛋白的蛋白质精氨酸甲基转移酶(PRMT)。的表达PRMT亚型主要在肺已经证明局部支气管和肺泡上皮细胞(22]。有人提议ADMA-metabolizing酶之间的一种微妙的平衡扰动在支气管上皮急性呼吸道损伤,可能导致增加nitrosative压力的形式ADMA-induced过氧亚硝基生产(10]。ADMA水平已报告降低了等离子体的酒精使用障碍的人在最近的一篇论文香等。23]。然而,在许多疾病与酗酒有关(如肝炎和肝硬化),血浆ADMA水平被证明是高在酗酒24,25]。因此,没有明确的共识后系统性ADMA水平慢性饮酒。没有特定的肺组织的测量ADMA在人类饮酒后报告。急性酒精消费导致肺肺部没有升高。酒精研究没有报道人类肺,但慢性酒精喂养导致没有回应在啮齿动物的解偶联ADMA水平升高,并刺激没有水平下降(26,27]。
本身,ADMA已被证明没有效果在大鼠气管上皮纤毛跳动在浓度为1毫米(28]。Superphysiologic浓度(10毫米)导致小,无意义的CBF减少。此外,ADMA本身没有改变引发,咆哮,或者从BEAS-2B肿瘤坏死因子释放。我们研究的影响ADMA在小鼠气管上皮外植体环协议与加拉等人我们进一步观察到小在CBF减少10毫米ADMA剂量(28]。这些发现支持这一概念,ADMA并不影响纤毛bioreactivity没有号调制通过另一个代理如酒精。虽然nebivolol-induced退化ADMA水平通过DDAH-2表达式的海拔已经被报道在内皮细胞(29日),我们发现nebivolol不会影响基线CBF、也不提高纤毛响应对酒精(数据没有显示)。这可能是由于不同细胞类型的表达在应对nebivolol DDAH-2转基因老鼠overexpressing DDAH明显提高CBF的酒精刺激。
ADMA已经与肺部疾病的发病机理。高架ADMA加剧气道炎症(18和肺功能修改30.在小鼠模型。肺ADMA高架在过敏性哮喘小鼠模型,和正常小鼠吸入外源性管理ADMA导致醋甲胆碱挑战气道高反应,表明增加ADMA在哮喘31日]。ADMA水平呼出的气息凝结的哮喘儿童相比明显高于健康对照组不管哮喘儿童吸入类固醇治疗(32]。交替,血浆ADMA水平被发现显著降低过敏儿童轻度哮喘病人与健康受试者(33]。他汀类药物可能功能调节哮喘肺损伤通过ADMA的调制。使用一个肺泡上皮细胞模型中,ADMA和诱导一氧化氮合酶是减少了辛伐他汀,但以挪士增加(34]。增加后肺损伤的严重程度P。绿脓杆菌脓毒症与高架ADMA浓度(35]。受损的黏膜纤毛的清除由于ADMA升高可能是一个额外的机制导致急性肺损伤的严重程度P。绿脓杆菌脓毒症。
虽然升高ADMA似乎并不损害或缓慢的CBF根据我们的数据,ADMA可能函数缓慢纤毛在音乐会纤毛毒素以相反的方式如何DDAH增强CBF只有号激活剂的条件下如酒精。例如,吴et al。36)表明,ADMA增加蛋白激酶C (PKC),而DDAH减少PKC表达对缺血/再灌注损伤的影响在肺部没有水平。最近,我们已经确定,纤毛放缓积极规范通过PKCε回应许多已知的代理有纤毛减速效果(15]。也许,在高架ADMA的存在,一个增强的纤毛减缓反应会产生损伤条件下的PKC epsilon-activating纤毛毒素。因此,适当的先天防御吸入病原体的增强可能会专注于治疗药剂,ADMA减少或增加DDAH的气道上皮细胞。
确认
作者要感谢丽莎女士Chudomelka专家编辑援助。我们要感谢组织科学设施内布拉斯加州大学医学中心的组织学,免疫组织化学,成像和分析支持。这种材料是工作的结果支持资源和设施的使用在弗吉尼亚州Nebraska-Western爱荷华州的卫生保健系统,奥马哈市NE(退伍军人事务部(VA I01BX000728) t·a·怀亚特)。支持的研究是由美国国家酒精滥用与酒精中毒研究所(NIAAA R01AA017993 t·a·怀亚特和R01AA008769 j . h . Sisson)和国家心肺和血液研究所(NHLBI R00HL088550 s·m·威尔斯)。这项工作也支持部分由中央国家农业安全与健康中心(CS-CASH;NIOSH 1 u54oh010162-01)。