文摘

内皮功能障碍似乎一直在检测RA患者和逆转的控制炎症。低循环内皮祖细胞(epc)描述了在很多条件与心血管风险增加有关,包括类风湿性关节炎。本研究的目的是研究抑制肿瘤坏死因子的影响在RA患者内皮祖细胞。17 moderate-severe RA患者和12性别和年龄组进行评估。内皮生物标志物在基线和3个月后进行测试。从外周血单核细胞内皮祖细胞被确定通过cytofluorimetry使用anti-CD34 anti-vascular内皮生长因子受体2。不对称dimethylarginine (ADMA)由ELISA检测,通过超声血流介导扩张(FMD)。在RA患者循环内皮祖细胞明显低于控制()。3个月后内皮祖细胞显著增加(),而ADMA水平显著降低()。逆相关性平均增加内皮祖细胞数量和平均减少DAS28治疗后观察到的(,)。内皮祖细胞与ADMA负相关(,)。没有发现改善手足口病。短期治疗anti-TNF能够同时增加循环内皮祖细胞的比例减少疾病活动建议积极治疗干预旨在抑制炎症过程可能影响内皮功能。

1。介绍

类风湿性关节炎(RA),其他自身免疫系统疾病,是与心血管发病率和死亡率的增加有关1),主要是由于加速动脉粥样硬化过程(2]。文献中的数据表明RA炎症的本质有助于动脉粥样硬化中观察到这种疾病的过度3]。类风湿性关节骨液和动脉粥样硬化斑块共享一个共同的炎性细胞和分子环境激活内皮细胞表型特征,表达粘附分子,同样的模式的细胞因子,浸润白细胞(4]。

损伤的内皮功能代表最早和可逆阶段动脉粥样硬化斑块的形成,源自失去保护的抗氧化和抗炎系统(5]。血管内皮的完整性是至关重要的动脉壁函数和内稳态,及其功能障碍代表的关键事件,随后导致血管壁紊乱。不到20年前,Asahara和科尔首先确定循环中内皮祖细胞(epc)作为前体外周血、骨髓动员形式,能够区分原位内皮细胞;这些细胞导致受伤的内皮细胞的恢复,因此,限制了动脉粥样硬化斑块的形成(6- - - - - -8]。内皮祖细胞的动员和分化是由产生的一氧化氮(NO)的激活内皮没有合酶(以挪士)9]。

内皮祖细胞的数量和功能活动似乎影响心血管疾病的风险。逆相关性内皮祖细胞的数量和弗雷明汉风险因素得分已经证明(7),这些细胞的数量和功能缺陷被发现在不同的临床条件与心血管风险增加有关10]。

内皮功能障碍已被记录在长期(11)和早期RA患者(12,13)用多普勒超声评价肱动脉血流介导的扩张(FMD)或评估动脉壁刚度(14]。改善内皮功能治疗后几位作者所表明的那样15- - - - - -19]。RA患者也显示循环内皮祖细胞的数量,减少负相关疾病活动和似乎对糖皮质激素(20.]。此外,内生以挪士抑制剂之间的关联不对称二甲基精氨酸(ADMA)和循环内皮祖细胞的数量一直在RA患者中发现没有其他心血管危险因素(21]。

到目前为止,anti-TNF代理代表RA治疗的一个里程碑。由于明显的肿瘤坏死因子在动脉粥样硬化中的作用,有益的影响TNF抑制已经假定;然而,观察性研究和数据形式注册并不总是证明减少心血管事件(1]。长期的控制研究,直接评估的影响这类药物对动脉粥样硬化的发展过程,是必要的。

我们的研究的目的是调查的影响短期皮下anti-TNF药物管理局在活跃的RA患者内皮祖细胞数量。

2。材料和方法

2.1。病人和控制

连续受到RA患者根据1987标准(22),指定开始皮下anti-TNF药物,从“生物drugs-dedicated门诊诊所”招募Sapienza大学风湿病学单元的罗马。所有患者前瞻性followedup至少3个月。控制,12岁和sex-matched健康受试者进行了研究。所有患者进入研究前签署知情同意书。在招聘、人口和临床数据,并存病都被记录下来。病人和控制被排除在外的诊断心血管疾病,慢性肾功能衰竭、血脂异常和/或糖尿病。在开始anti-TNF之前,患者筛查潜在的结核病和肝炎病毒B和C。

2.2。疾病活动的评估

RA疾病活动在基线评估,anti-TNF治疗3个月后,由28-joint疾病活动得分(DAS28)。

2.3。血液样本

从每个病人血液样本收集基线和3个月后。肝素化瓶是用来测试内皮祖细胞在同一天的抽血。剩余的样本在3000×g离心10分钟在室温和血清收集并冻结在−80°C到分析。

至于对照组,健康受试者的血样收集当天的基线患者的访问。

2.4。循环内皮祖细胞的分析

外周血单核细胞(PBMCs)是通过密度梯度离心法(Lympholyte-H;Cedarlane实验室,霍恩比,安大略省,加拿大),正如前面所描述的执行和表型鉴定瓦萨号等。23]。总之,孵化后FcR-bloking试剂(Miltenyi研究,Bergisch-Gladbach,德国),细胞培养30分钟在冰藻红蛋白(PE)标记马伯anti-CD34 (BD Immunocytometry系统,圣何塞,CA)和allophycocyanin (APC)标记马伯R2抗VEGF、KDR(研发系统、明尼阿波利斯、MN)。适当的同形像控制。收购进行流式细胞仪石中剑(BD Immunocytometry系统)和包括每样100.000到400.000事件。数据分析使用CellQuest Pro软件(BD Immunocytometry系统)。内皮祖细胞被定义为CD34 / KDR double-positive细胞,和他们的数字是表示为一个百分比的细胞在淋巴细胞门(21,23]。代表dotplot如图1。

2.5。ADMA

ADMA血清水平检测到一个商业人类酶联免疫吸附测定(ELISA)工具包(芬奇物化学,佛罗伦萨,意大利),根据制造商的指示。三重血清进行了测试,结果表示为平均值±标准差。

2.6。评估流量介导的扩张

流量介导的反应性充血扩张以响应(内皮依赖的血管舒张)是评价肱动脉上采用高分辨率的b型多普勒(ATL 5000年人类发展指数7.4 MHz线性阵列传感器)和指导方针后发表国际肱动脉反应性工作组(24]。

所有受试者评估禁食8到11点之间,在一个安静稳定的温度环境。肱动脉的直接,nonbranching段5 - 15厘米以上肘前的窝被b型纵向扫描识别。容器直径是记录在一段和清晰的前部和后部内膜的内腔和血管壁之间的接口在休息和反应性充血。肱动脉直径测量离线自动边缘检测系统。当时血压袖带充气在前臂到supra-systolic压力(至少50毫米汞柱以上收缩压使闭塞动脉流入)的标准长度5分钟。测量最大直径的动脉被袖口释放后45到60秒。绝对的手足口病被表示为:(postdeflation diameter-resting直径);手足口病的相对价值也从基线直径变化百分比计算如下:100%×((postdeflation直径−休息直径)/休息直径)。

两个心脏病专家(FC和洛杉矶),蒙蔽了参与者的临床数据,使用离线方法解释超声结果。的内部,interobserver可变性手足口病被策划研究人口中计算病人的手足口病估计从每个测量估计两个独立的测量。估计的标准误差计算使用这个阴谋。内部和interobserver变化分别为4.2%和5.1%,分别。

为了评价读者的能力确定积极的结果,15冠状动脉疾病的高血压病患者也被评估。

2.7。统计分析

这项研究的目的是调查的影响短期皮下anti-TNF疗法在RA患者的循环EPC数量。意义的阈值设置为0.05。数据被表示为平均值±标准偏差。配对的数据进行了分析与Wilcoxon符号秩检验。相关性进行评估与斯皮尔曼等级相关测试。统计分析使用GraphPad棱镜版本6.0 (GraphPad软件有限公司拉霍亚,CA,美国)。

研究机构审查委员会批准的协议是亲自到翁贝托一世,Sapienza大学罗马。

3所示。结果

我们招募了17个RA患者(平均年龄14 f: 3 m范围26 - 68年)和长期疾病(疾病持续时间103±104,4个月,范围24 - 360)设计开始皮下anti-TNF药物。14用依那西普进行治疗50毫克/星期/皮下注射和3 adalimumab 40毫克/每隔一周/皮下注射。

招生的时候,所有患者服用糖皮质激素;没有一个病人在后续增加类固醇剂量。

临床特点的RA患者在基线和anti-TNF治疗3个月后被发表在表1。3个月后显著降低DAS28(与基线值)记录()。

3.1。循环内皮祖细胞

在基线,循环内皮祖细胞的百分比显著低于活跃RA患者比健康者(%与%,)。3个月的观察,内皮祖细胞的数量明显高于基底值(相比%,%,与基线;与健康受试者(图)2)。内皮祖细胞和DAS28值之间没有显著相关性检测();然而,逆相关性意味着增加内皮祖细胞数量和平均减少DAS28 anti-TNF治疗3个月后观察到的(,)(图3)。此外,内皮祖细胞数量与ADMA血清水平负相关(,)(图4)。没有其他内皮祖细胞和临床特征之间的相关性也发现口蹄疫值。

3.2。ADMA血清水平

在基线,意味着ADMA水平μmol / L。anti-TNF 3个月后,ADMA血清水平显著低于治疗前检测到的值,减少(与μmol / L,)。

3.3。多普勒超声评估流量介导的扩张

意思是手足口病在基线%在RA患者中,和在积极的控制(%)。3个月的观察,观察手足口病的不显著增加RA患者(%,与基线)。然而,即使anti-TNF政府意味着口蹄疫低于正常价值的10%。

4所示。讨论

我们的研究结果表明,短期治疗RA与TNF抑制剂同时增加循环内皮祖细胞相关疾病活动的比例减少;这些发现表明,治疗干预旨在抑制炎症过程可能也积极影响内皮屏障的“健康”。

在RA患者中,传统的风险因素,遗传素质,现在公认的炎症机制协同作用在确定亚临床动脉粥样硬化和随之心血管事件的风险增加(25,26]。系统性炎症负责proatherogenic概要文件以氧化应激、血脂异常、胰岛素抵抗、hypercoagulable状态和upregulation proatherogenic炎症白细胞(25每个导致内皮损伤)。健康的内皮血管张力的主要监管机构代表,炎症和重塑;因此,丧失其功能启动动脉粥样硬化过程最终导致斑块的发展。不同的心血管风险因素作用于内皮细胞诱导衰老和细胞凋亡,因此,确定内皮功能障碍(27]。越来越多的证据表明,内皮祖细胞在外周血循环内皮修复中发挥着至关重要的作用。在RA患者中,缺乏循环内皮祖细胞数量和功能已经证明(20.,21,28,29日]。一个在体外研究表明,内皮祖细胞来自RA患者表现出迁移反应受损的血管内皮生长因子(VEGF)和胶粘剂性能成熟内皮细胞与肿瘤坏死因子刺激后,培养细胞相比,从健康受试者29日]。其他在体外数据表明tnf负面影响增殖、迁移和人类内皮祖细胞的粘附能力30.]。TNF-inhibitor政府后,显著增加内皮祖细胞的粘附性能检测(28]。

关于循环内皮祖细胞的数量,减少外周血内皮祖细胞在RA描述。在他们的论文中,旨在评估Herbrig等人,体外和在体外,13个患者内皮祖细胞数量和功能的内皮功能受损;所有患者接受甲氨蝶呤和6的13也服用anti-TNF药物(29日]。作者提出两个假设解释了内皮祖细胞数量和功能的变化:炎性疾病本身和甲氨蝶呤政府的影响29日]。当比较患者循环内皮祖细胞的频率高或低的疾病活动,Grisar et al。31日)观察对象之间的显著差异与活动性疾病和疾病活动较低或缓解那些表现出内皮祖细胞水平与健康受试者。不同于人口研究Herbrig et al。29日),我们招收长期RA患者调高疾病活动(DAS28≥3.2) nonresponders标准疾病风湿性关节炎药物(DMARDs)和资格anti-TNF治疗;在这个人口我们发现健康受试者相比减少了循环内皮祖细胞的数量与疾病活动不相关。我们人口的同质性不允许任何分层基于疾病活动状态。在另一个人口适度活跃的RA患者中,没有发现循环内皮祖细胞与疾病活动之间的相关性(20.]。

相反大多数发表的数据在RA内皮前体细胞,一些研究表明更高的或类似的RA患者循环内皮祖细胞数量相对于其他系统性自身免疫性疾病患者或健康受试者32- - - - - -34]。然而,不同的表面标记和技术被用来描述内皮前体细胞。内皮前体细胞代表一个极其罕见的人口在外周血单核细胞中,这种稀缺性导致了细胞分离困难和定义(35,36]。额外定义内皮祖细胞的方法是量化的能力激增,集落形成单位(CFU)测定。通过这种方法,外围内皮祖细胞的损耗确认(20.,31日,34]。

有趣的是,除了减少循环数、类风湿性关节骨液似乎富含epc暗示这些前体在局部血管生成的作用[37]。迁移从外周血内皮前体细胞的招募整合素/血管细胞粘附分子1 (VCAM) [38可能解释妥协的损耗在外周血内皮更新,因此,动脉粥样硬化进程的开始。

血清促炎细胞因子的水平,如白细胞介素6、显示负相关与RA患者循环内皮祖细胞的数量(29日]。最近,在其他条件特点是内皮损伤,甚至肿瘤坏死因子表现出负相关与循环内皮祖细胞的数量(39]。鉴于肿瘤坏死因子的关键作用在RA和动脉粥样硬化的发病机制40),我们旨在调查标记的肿瘤坏死因子抑制血管内皮功能的影响。第一次观察TNF影响内皮前体细胞在RA患者来自于一个在体外细胞因子的研究被证明损害CFU形成内皮祖细胞的活性,同时添加TNF-inhibitor英夫利昔单抗培养细胞逆转这种效应(20.]。此外,其他在体外数据显示,肿瘤坏死因子能刺激fractalkine EPC表面上的表达,这决定了祖细胞杀死,自然杀伤细胞(41]。的进一步证据TNF-mediated影响循环内皮祖细胞的数量是由Ablin et al。28人证明体外英夫利昔单抗的积极影响管理;作者调查的影响的单剂量anti-TNF药物14 RA患者已经接受英夫利昔单抗和甲氨蝶呤和观察到显著增加的EPC号码和粘附功能输注后14天。改善内皮前体细胞治疗后统计相关,即使不是临床,显著降低(DAS28分数来)[28]。drug-mediated影响内皮祖细胞数量或间接影响,通过减少疾病活动可以假设;然而,它应该考虑患者评估研究中仍然适度活跃后一个注入英夫利昔单抗(28]。一周中间剂量的糖皮质激素治疗也显著降低TNF水平,增加相关的EPC号码(20.]。

我们所知,目前的研究是第一个专门研究短期反复皮下TNF-inhibitor管理局对内皮祖细胞的影响。不同于先前的研究调查肿瘤坏死因子抑制作用的潜在影响,在工作中我们只招收RA患者天真的任何生物药物。我们决定选择病人的第一道菜anti-TNF药物以减少循环药物的潜在混杂效应。正如预期的那样,在我们的RA患者,3个月用TNF阻滞剂治疗明显降低疾病活动。之前报道的人(28平行),显著减少DAS28分数患者有显著提高循环内皮祖细胞的百分比与疾病活动的降低程度负相关。anti-TNF对内皮祖细胞的影响是否增加相关药物本身而不是减少间接介导的疾病活动可以有争议。正常的祖细胞数量之前检测到低疾病患者活动(31日)符合的迹象减少甲氨蝶呤(RA患者有效治疗患心血管疾病的风险42]。然而,甲氨蝶呤表明proapoptotic影响培养内皮前体细胞可以至少在一定程度上有助于减少循环内皮祖细胞在RA患者无论疾病活动状态(29日]。Ablin等人的研究相反的时候第一次评估,我们所有的患者anti-TNF天真;然而,类似于之前的研究,(%)已经用MTX治疗所以我们不能完全排除这种药物的贡献减少基线内皮祖细胞。

2007年逆相关性内皮祖细胞和血清ADMA已经证明21]。ADMA的内源性抑制剂没有合酶(43)进入聚光灯下的生物标志物内皮功能。ADMA血清水平升高被描述在许多条件相关的心血管疾病的风险增加,包括长期的和早期RA (21,44,45]。此外,有效的RA治疗后与标准DAMRDs和生物药物,减少ADMA血清水平观察(44,45]。在目前的研究中,我们证实了显著减少ADMA水平与TNF-inhibitors治疗3个月后。这是透露,按照以前的观测anti-TNF封锁导致减少内皮细胞激活患者体内的生物标记物的水平anti-TNF -对传统药物难治的治疗因严重疾病(46]。这个结果,连同的证据增加内皮祖细胞,进一步表明anti-TNF扭转的能力的影响慢性低度炎症在RA患者内皮生物标志物。手足口病被认为是作为一种非侵入性、标准化方法研究内皮功能。然而,这种超声技术受到运营商的依赖,并执行相关的环境条件(27]。这也许可以解释无意义的改善手足口病的原因记录在我们的病人即使我们观察到一个明显改善内皮功能的生物标志物。即使我们发现口蹄疫略有增加,相对小的队列大小可能部分占不达到统计上显著的价值。

这个小前瞻性研究旨在评估anti-TNF治疗RA患者的内皮祖细胞的影响。这个试点研究的主要缺点是体积小的群体评估和相对较短的跟踪。进一步评估内皮生物标志物在更广泛的人口和异构RA和更长时间的跟踪将确认的结果,我们的研究,让患者心血管风险。

总之,我们的结果提高当前的知识在RA内皮损伤的生物标志物,为评估内皮祖细胞和ADMA。与anti-TNF代理的有效的治疗方法,旨在减少疾病活动,似乎有助于改善内皮屏障功能。这些观察表明这些药物在降低动脉粥样硬化损伤的可能角色通过控制炎症。