文摘

这项工作的目的是展示cox - 2酶的作用在血管代谢综合征的实验模型。月男性WKY大鼠使用;他们分布在8个组(每个):控制(W);W + L: WKY大鼠接受20毫克/公斤的患者的食道内管理;月;月+ L:月+ 20毫克/公斤的患者的食道内管理;那些吃了果糖的老鼠(FFR): WKY大鼠接受10% (w / v)饮用水中果糖溶液在所有12周;FFR + L: FFR + 20毫克/公斤的患者的食道内管理;那些吃了果糖的高血压大鼠(FFHR):月收到10% (w / v)饮用水中果糖溶液在所有12周;和FFHR + L: FFHR + 20毫克/公斤的患者的食道内管理。代谢变量、血压、地貌形态示量变量和氧化应激变量进行评估;也MMP-2 MMP-9(胶原酶),VCAM-1, NF -κB Westernblot或金融机构进行评估。FFHR了代谢综合征的所有变量;也有增加氧化应激变量;血管重建左心室肥大和证明以及显著增加提到促炎性分子的表达,增加胶原酶的活性和表达。患者能够逆转血管重建和炎症改变,表明cox - 2在病理生理学的参与血管重建的实验模型。

1。介绍

动脉粥样硬化作为脂肪存储疾病的传统观点分解对大型和越来越多的证据表明,炎症疾病的各个阶段的中心,从最初的伤害,直到最后阶段的血栓性并发症妥协血液流动。血管炎症的理解的进步已经导致了一个激进的方式的改变血管疾病是接近的。与意识的积极作用,增强船舶及其与细胞因子和免疫细胞的复杂的相互作用,这一概念将障碍以前认为是不同的。了解动脉粥样硬化血管炎症疾病危险分层是一种新方法的基础和治疗(1]。

基质金属蛋白酶(MMPs)发挥重要作用在维持体内平衡的细胞外结构。基质金属蛋白酶是诱导细胞因子和信息和cell-matrix交互。的例子的存在增加基质金属蛋白酶在临床病理学SCA,特别脆弱地区的斑块(2]。接触氧化低密度脂蛋白(ox-LDL)或TNF -α诱发MT3-MMP的表达,MMP的表达的动脉粥样硬化斑块中巨噬细胞(3]。

c反应蛋白(CRP)提供了一个快速和戏剧性的炎症刺激反应。超灵敏的c反应蛋白(hsCRP)具有非常重要的作用在血管炎症的检测和心血管风险预测。有证据表明,c反应蛋白是参与动脉粥样硬化,特别是在它的开始。促炎细胞因子在刺激单核细胞和巨噬细胞的生产聚合酶链反应(4]。凸轮表达式是由c反应蛋白,允许增加白细胞粘附和迁移5- - - - - -7]。

自发性高血压大鼠(月)提供了一个模型,允许研究原发性高血压的遗传高血压。管理碳水化合物饮食的老鼠可以诱导胰岛素抵抗、高胰岛素血症、血脂异常和高血压。Fructose-Fed-Rats (FFR)提供了一个有用的实验模型的交互因素塑造研究代谢综合征。这个组合模型(FFHR)代表高血压个体现代西方饮食富含精制糖。一些作者假设这种双重模型最适合推断的结果对人类模型(8,9]。

这个实验模型研究已经证明了在以前的作品其效用的交互因素形成胰岛素抵抗综合征(10),包括内皮功能障碍、减少,心血管,活动的内皮同种型一氧化氮合成酶(以挪士),和增加血管平滑肌细胞的增殖(11),也提供了证据涉及RAS的病理生理学(12]。

这项工作的目的是证明血管炎症和氧化应激参与血管结构和功能变化的病理生理机制(重构)相关的代谢综合征患者通过政府的实验模型(L) cox - 2特定的抗炎。

2。方法

2.1。动物和实验设计

所有程序都执行根据动物实验机构的指导方针;协议提交和批准的机构委员会实验动物使用和护理(CICUAL)医学院UNCuyo。Thirty-day-old男性纯种京都WKY大鼠和月标准商业食物饮食随意,住在一个房间的条件下温度(20°C)和湿度控制,用12小时光/暗周期12周实验期间。患者(L)是管理各自的组织在过去的六个星期。学习小组是划分如下。(我)控制(W): WKY收到食物和饮用水(DW)随意;(2)月:收到食物和DW随意;(3)那些吃了果糖的老鼠(FFR): WKY收到10% (w / v)果糖(Parafarm,布宜诺斯艾利斯,阿根廷)解决方案在DW 12周;(iv)那些吃了果糖的高血压大鼠(FFHR):月收到10% (w / v)果糖溶液在DW 12周;(v)FFR + L: FFR收到20毫克/公斤L食道内管理;(vi)FFHR + L: FFHR收到20毫克/公斤L食道内管理。在实验周期结束时,老鼠与戊巴比妥钠麻醉(50毫克/公斤ip),血液采集标本,血管和器官无菌切除了测量。

2.2。血压测量

收缩压(SBP)是在有意识的监控间接预热稍微克制老鼠tail-cuff方法和记录在一个草模型7测谎仪(美国马草仪器有限公司、昆西)。老鼠训练的仪器测量前几次。

2.3。生化决定

2.3.1。HOMA指数和腹腔内葡萄糖耐量试验

空腹血浆胰岛素化验了ACS: 180 se自动化学发光系统(德国拜耳)。血浆葡萄糖水平化验使用商业比色法(维纳实验室。、阿根廷)。内稳态模型评估(HOMA)作为指标来衡量胰岛素抵抗的程度;这是使用以下公式计算:(胰岛素(μU /毫升)葡萄糖(更易/ L) / 22.5) [13]。

实验周期结束前三天,一个葡萄糖耐量试验(GTT)执行。大鼠禁食过夜略与戊巴比妥麻醉,和葡萄糖(2 g / Kg ip)管理。血液样本被尾出血0,30、60、90分钟后注入决定血浆葡萄糖浓度。曲线下的面积计算,更易与L / 90分钟。

血脂的评估。最后实验周期血样来自动物,在禁食12小时。血浆总胆固醇、脂蛋白胆固醇和甘油三酯评估使用photocolorimetric酶方法(阿根廷罗萨里奥,维纳实验室)。数据表达更易与L。

2.4。氧化应激决定

2.4.1。测量等离子体硫代巴比土Acid-Reactive物质(TBARS)

为了演示的效果增加氧化应激在血管层,血浆脂质过氧化作用是评估TBARS浓度。这种方法是基于血浆丙二醛之间的反应,脂质过氧化的产物,和硫代巴比土酸,之前已经介绍了13]。没有校正样品蛋白质含量是必要的,因为样品的性质(14]。

2.5。测量血管NAD (P) H-Oxidase活动

lucigenin-derived化学发光分析是用来确定NAD (P)在一段胸主动脉H-oxidase活动,如前所述[14]。评估NAD (P) H-oxidase活动,NADPH (500μmol / L)补充道,立即和化学发光测量液体闪烁计数器(LKB Wallac模型1219 Rack-Beta闪烁计数器,芬兰)设置在out-of-coincidence模式。Time-adjusted和normalized-to-tissue-weight闪烁计数器是用于计算。在没有重复进行了测量,存在diphenyleneiodnium (DPI) (10 - 6 mol / L),抑制flavin-containing酶,包括NAD (P) H氧化酶(15,16]。

2.6。以挪士活动在心脏和动脉组织匀浆

Ca的活动^{2 +}/ calmodulin-dependent内皮一氧化氮合酶(以挪士)测定肠系膜动脉匀浆和左心室心肌组织,通过转换的精氨酸为瓜氨酸。根据蛋白质含量值修正匀浆(布拉德福德方法)和培养时间和表达dpm /毫克蛋白/分钟。从每个独立处理动物获得的材料(17]。

2.7。相对心脏重量

为了评估心脏肥大,我们测量相对心脏重量(RHW)。短暂、心脏与大血管分离,掉进一个缓冲盐溶液(PBS),用卫生纸将弄脏血,重。总心脏重量修正根据心脏重量的比值(毫克)和100克的体重在杀人。

2.8。高灵敏度测量c反应蛋白(hs-CRP)浓度

等离子体hs-CRP浓度测定用比浊测定(1650年拜耳Advia AG勒沃库森)。数据表达mg / L。

2.9。组织保存

组织标本的组织病理学被处理之前已经报道过(15]。老鼠用于这些样本观察。麻醉动物灌注简要PBS (298 mOsmol /公斤H₂O, pH值7.40,4°C)来清除血液。肠系膜动脉灌注是体内相同的解决方案通过肠系膜动脉在5分钟。组织学研究动脉灌注也有4%多聚甲醛溶液10分钟由石蜡和固定。五μ米厚的组织切片是横向跨越肠系膜组织微观状态(Microm嗯,德国)和组织学研究处理。类似的程序申请心脏组织保护,通过主动脉逆行灌注。

2.10。定量Histomorphometry确定心脏肥大

Histomorphological分析进行切片(免费)外壁的心脏的左心室(LV)。心肌细胞面积的估计是由部分沾马森三色的解决方案。肌纤维横截面的区域被选中。纤维的轮廓是手工绘制。myocardiocyte总面积是表示为平方微米(μ米²)。

2.11。动脉结构

动脉壁结构的变化进行评估通过测量媒体层肠系膜动脉。解剖肠系膜血管床在10%甲醛固定,脱水,嵌入在石蜡,后来切片机。切片染色,检查之前已经描述(15]。Nontransverse脾动脉被排除在调查。媒体比(即腔。,internal diameter to medial thickness) (L/M) was then calculated. Fifty slices from each animal were processed and analyzed to obtain an average value for each rat. Average values were then used for final analysis.

2.12。sds - page及免疫印迹分析

肠系膜组织在PBS和蛋白质提取洗冷20毫米Tris-HCl, pH值7.4,150毫米生理盐水、10%甘油、1% Triton x - 100,蛋白酶抑制剂混合物(P2714σ)。声波降解法后15秒(3 * 10年代间隔)和提取30分钟在4°C,样品提取被离心澄清,享年14000岁g为20分钟,立即使用或储存在−20°C。蛋白质在10%聚丙烯酰胺凝胶平板上分离和转移到0.22μm硝化纤维素膜(通用电气公司,德国)。非特异性反应在室温下被孵化1 h在5%脱脂奶粉溶解在洗涤缓冲(PBS, pH值7.6,0.2%渐变20)。墨迹是孵化anti-p65和anti-VCAM-1抗体(0.2μg / mL在屏蔽解决方案)在室温下60分钟。辣根anti-rabbit-IgG peroxidase-conjugated山羊和猪anti-goat-IgG溶解在阻断缓冲区被用作二次抗体(0.25μ在室温下g / mL, 45分钟)。第一和第二抗体过剩被洗涤5 * 5分钟在堵塞的解决方案。检测是通过增强化学发光系统(ABC, Dako系统)和随后的接触柯达X-AR电影(柯达)30年代。

2.13。免疫组织化学和数字共焦显微镜(包含IHC)

2.13.1。转录因子的确定(WB)

兔子anti-rat NF -B p65亚基糖抗体,得到微孔International Inc .(阿姆斯特丹,荷兰)(AB1604b),和山羊anti-rat VCAM-1 (C-19)抗体是来自圣克鲁斯生物技术有限公司(圣克鲁斯、钙、美国)(sc - 1504)。组织部分被削减时3μ米厚度从石蜡包埋块。Deparaffinized部分被用来确定炎症反应。组织permeabilized 1% Triton x - 100年15分钟,冲洗和PBS和阻塞无菌过滤10%正常兔血清20分钟。所有抗体解microfuged使用前20分钟。抗体是1:1000稀释。初级孵化项目持续了1小时21°C,紧随其后的是广泛的PBS Triton x - 100,洗6次为5分钟。二次抗体,anti-rabbit免疫球蛋白TR和抗体免疫球蛋白FITC (Sigma-Aldrich),仅在PBS稀释按照制造商的指示。

图像采集与尼康EZ-C1 3.00软件尼康Diaphot TMD对荧光显微镜装备与氙灯和过滤轮子(萨特仪器,诺瓦托、钙、美国),荧光过滤器(美国VT浓度,伯瑞特波罗),冷却电荷耦合器件相机(美国纽约库克,Tonawanda),和步进电机(丹佛市智能成像的创新公司,美国)。deconvolved Multifluor图像合并,重整使用EZ-C1 3.00缩略图软件。

2.13.2。测定基质金属蛋白酶

Anti-MMP-2获得Chemicon International Inc . (MAB3308)和anti-MMP-9抗体来自Chemicon (MAB3309)。组织部分被削减时5μ米厚度从石蜡包埋块。Deparaffinized部分被用来确定炎症反应。组织permeabilized 1% Triton x - 100年15分钟,冲洗和PBS和阻塞无菌过滤10%正常兔血清20分钟。所有抗体解microfuged使用前20分钟。抗体稀释1:500。初级孵化项目做了1小时21°C,紧随其后的是广泛的PBS洗卫x - 100,一般6次为5分钟。二次抗体,Cy5和FITC免疫球蛋白(Sigma-Aldrich),仅在PBS稀释按照制造商的指示。

图像采集与尼康EZ-C1 3.00软件尼康Diaphot TMD对荧光显微镜装备与氙灯和过滤轮子(萨特仪器,诺瓦托、钙、美国),荧光过滤器(美国VT浓度,伯瑞特波罗),冷却电荷耦合器件相机(美国纽约库克,Tonawanda)和步进电机(丹佛市智能成像的创新公司,美国)。deconvolved Multi-fluor图像合并,重整使用EZ-C1 3.00缩略图软件。

的活性基质金属蛋白酶9和2(胶原酶)。肠系膜组织匀浆样品获得使用50 ug的总蛋白;随后与明胶使用聚丙烯酰胺凝胶co-polymerized。组成如下:2880 uL再蒸馏的水(BD milliQ), 800 uL明胶10毫克/毫升(σ,USP,等等)明胶(浓缩的结束:1毫克/毫升的凝胶),2160 uL丙烯酰胺/ bis 30%, 2160 uL Tris-Cl 1.5米pH值8.8,80 uL SDS 10%(σ),80 uL的过硫酸铵10%,6 uL tem。三分之一的样品缓冲使用基于样本总量与蛋白质。运行时停止了酚红达到凝胶的下缘,开始溢出。然后,洗去SDS凝胶。凝胶洗在30 - 50毫升的Triton x - 100 2.5%和连续搅拌20 - 30分钟。孵化在50毫升(每凝胶)的解决方案在37°C之后大约12 h凝胶是沾Coomassie蓝色的r - 250 12 h。对比使用浓度高的0.5% (w / v)而不是0.1%。凝胶是decolorated解决甲醇,醋酸和水。 Metalloprotease activity was evaluated based on mean optical density of light bands on a dark blue background.

2.14。试剂

这种药物的患者在纯态是由诺华提供巴塞尔。

除非另外注明,试剂从西格玛化工有限公司购买,密苏里州,美国。

2.15。统计和数据分析

数据表示为±SEM。数据的统计学意义比较所有组是由单向方差分析评估Bonferroni期末测验。一个双边值小于0.05被认为是显著的。

3所示。结果

收缩压水平逐渐增加在整个实验周期在动物组织FFR的萎缩,FFHR,达到显著差异相对于对照组(表的最后协议1)。慢性治疗L显著减少TA值组FFR FFHR,月而不是对照组(表的值1)。

此外,笔和FFHR组织特征作为代谢综合症的模型根据HOMA指数的增加,空腹血糖、甘油三酯脂蛋白胆固醇下降,动脉高血压。动物实验团体FFR和FFHR获得L没有大幅修改的空腹血糖值,甘油三酯脂蛋白胆固醇(表1)。

氧化应激变量进行评估的四个实验模型。NADPH氧化酶活性显著增加在所有实验模型但FFHR模型中也成倍增长。另一方面以挪士活动显著降低与果糖喂养实验模型(表中1)。脂质过氧化作用从TBARS评估显示,显著的三个实验模型,FFHR模型受到影响最大。与L慢性治疗后,主动脉NAD (P) H氧化酶活动显著减少组FFR萎缩,FFHR。内皮以挪士活动规范化实验模型FFHR和L FFR治疗后,这些结果具有统计学意义。

此外,心脏重塑评估是基于相对心脏重量(RHW)(表1)。实验模型FFR、萎缩和FFHR显示心脏重构,降低,与L慢性治疗后,在实验组研究但只有FFHR组显示统计学意义。

血管重建,正如前面所讨论的,是评估基于M / L比值。在实验模型FFR和FFHR显著减少媒体/流明比观察,证明存在的富营养的肠系膜动脉的重建研究。慢性治疗L之后,我们证明这个变量的增加三个实验模型,导致重构减少。应该注意的是,这个重构指数增加,虽然显著,没有达到正常的价值观,这是一个重要的事实在分析cox - 2在诸多病理生理学机制的参与。

后证明心血管重构的存在在这些实验模型,我们研究了炎症标记物的存在。

在系统层面,c反应蛋白(hsCRP)评估;它显示FFR和FFHR模型之间的显著差异,表明炎症在这些组织的存在。与cox - 2特定拮抗剂治疗后,这些变量显著下降的三个实验模型,达到正常的价值观和展示这一病理生理途径参与系统性炎症过程。

在血管层,这些蛋白质的表达进行免疫印迹,如图1。在实验模型FFR FFHR,月这些标记物的表达增加。与L慢性治疗后,NF -的易位B细胞核和细胞膜VCAM-1的表达水平都降低了在实验模型FFR和FFHR(图1)。

上述标记的表达通过金融机构进行了研究;他们暴露于血管壁激光colocalization显微镜。实验模型研究显示不同的表达模式的NF -B和VCAM-1。这个结果是由我们实验室之前报道(18]。模型FFHR NF -的一个重要表现B在整个血管壁内膜、媒体、和动脉外膜以及内皮VCAM-1的表达,而在其它模型只有在内皮标记都是礼物。治疗显著降低这些标记物的表达,证明了世行,尽管在动脉外膜炎症水平更高的FFHR模型(图1。)

我们也分析了血管重建的两个标记,MMP-2 MMP-9。表达式被zymography分析使用白平衡和活动。在模型FFR和月活动和适度这些基质金属蛋白酶的表达增加,而FFHR模型提出了两种胶原酶(图的最大活动和表达2)。慢性治疗L显著降低活动和基质金属蛋白酶的表达,虽然FFHR模型中的这种减少的值没有达到对照组和保存主要外膜的水平。图2显示了一个代表形象的凝胶和统计分析。图3代表显微照片的显示表达式,如果这些抗体,目的是获得血管水平这个表达式的位置。MMP-2 MMP-9和观察到的主要动脉外膜层。

这一发现提供了进一步的证据的重要性这个血管层存在于血管重建的代谢综合征。

4所示。结论

本研究最重要的发现是演示,ciclioxigenasa-2参与心血管重构与代谢综合征和慢性治疗后综合症的逆转与特定的拮抗剂,患者(L)。

我们证明慢性治疗L没有修改模型的代谢与代谢综合征相关变量FFHR和笔。这部分修改了氧化应激变量但减少总脂质过氧化TBARS的经验显示,减少血管损伤和可能减少诸如NF - redox-sensitive基因的表达B,炎症的重要启动程序。

治疗后血管和心脏重构显示显著差异与L,主要在FFHR模型。这也是体现在微观的肠系膜动脉显示减少炎症和细胞外基质金属蛋白酶的表达下降。

动脉粥样硬化的起始过程有关,据作者,与内皮功能障碍的存在(如演示了在这个模型)和局部炎症在第一阶段,激活巨噬细胞后,合成il - 6与肝细胞和提升者释放急性期反应物,如c反应蛋白。NF -B是一个redox-sensitive转录因子启动的伟大力量和永存的炎症反应;最重要的转录产品在血管级别VCAM-1,标记的炎症和内皮功能障碍的几个作者。这两个分子数量的增加在整个血管壁内膜层中的FFHR模型中,只有在FFR和萎缩模型,就好像他们是WKY大鼠和FFHR的中间产品。表观遗传学也许可以解释微分表达式在这个模型中,果糖是一个隐藏的基因在月脱甲基的高潮,在血管层,显示一个完全血管肿胀。慢性治疗L改变炎症分子的表达模型,得到果糖,虽然在微观水平上仍有残留在动脉外膜炎症。

血管的重构可以证明胶原酶,执行工作“软化”矩阵,存在在增加数量19]。虽然他们并不意味着增加改造的存在,它应该证明他们的活动也增加了,这就是为什么zymography使用。MMP-2和MMP-9增加模型的研究。慢性治疗L修改的表达式和活动MMP-2 MMP-9,增加在微观水平媒体/流明比,从而改善血管微环境。

其他作者也表明cox - 2参与血管病理生理学;Dinarello等人表明cox - 2的有害的行动也被描述在高血压病人和代表一个机制cox - 2可能促进动脉粥样硬化;也代表了一个著名的差别他们发现血管cox - 2对这些机制他汀类药物可能减弱normocholesterolemic高血压患者动脉粥样硬化的发展过程(20.]。

最后结论,环氧酶积极参与炎症过程和改造的船只,作为一个重要的因素,在未来将允许我们使用这些结果药物改善这些对手,这样他们可以用于临床实践作为治疗靶点或佐剂在更完整的药物疗法现在使用单克隆抗体的方式(21]。

确认

作者宣称没有利益冲突,谢谢。诺华制药实验室(巴塞尔)提供研究药物和苏珊娜冈萨雷斯和玛丽亚克里斯蒂娜•喇嘛技术和专业支持。