文摘

的adipokine抵抗素是一种insulin-antagonizing因素也扮演监管角色在炎症、免疫、食物摄入量和性腺的功能和调节生长激素(GH)分泌鼠adenopituitary细胞与adipokine文化。尽管脂肪组织抵抗素的主要来源,它也表达了在其他组织,包括垂体。本研究的目的是调查的可能行动抵抗素对脂质代谢在脑下垂体在活的有机体内(老鼠在两个不同的营养状况,美联储和快速治疗抵抗素在急性和慢性的方式)在体外(adenopituitary细胞培养对待adipokine)。在这里,通过组合在活的有机体内和在体外实验模型,我们表明,中央管理急性和慢性抵抗素增强mRNA水平的脂质代谢酶参与脂类分解而且抑制mRNA水平的脂质代谢酶参与脂肪生成。综上所述,我们的研究结果首次表明抵抗素对脂质代谢有监管职责的脑下垂体的关系提供了新的见解的机制这个adipokine可以参与脂类代谢的综合控制。

1。介绍

抵抗素,也被称为炎症区中发现3 (FIZZ3)是一种adipocyte-derived激素促进胰岛素抵抗,影响脂肪细胞的分化,促进炎症(1- - - - - -5),最初认为老鼠是由脂肪细胞分泌的一种蛋白质的控制下不同体液信号和营养状况;营养和代谢调节这adipoine。抵抗素是在空腹的情况下减少6),而循环抵抗素在肥胖胰岛素抵抗增加啮齿动物(7)和人(8]。尽管脂肪组织更相关的蛋白质来源,最近报道,抵抗素还表示在下丘脑和脑垂体(8,9]。中央政府抵抗素对代谢体内平衡似乎有双重影响,首先强烈抑制喂养(10)和第二通过控制葡萄糖稳态和诱导肝胰岛素抵抗[8,11]。最近,它已经表明,中央抵抗素调节下丘脑和边缘脂质代谢在nutritional-dependent时尚甚至本条例对周边器官相比,中央效应(12]。作者表明抵抗素的厌食的效果与低水平的关联mRNA的表达orexigenic (agouti-related蛋白质和神经肽Y),使食欲减退的mRNA表达的增加(可卡因和amphetamine-regulated成绩单)神经肽在下丘脑弓状核。也表明抵抗素对营养状况相关的抑制性影响下丘脑脂肪酸代谢,增加的磷酸化水平的活化蛋白激酶及其下游目标acetyl-coenzyme羧化酶,与降低下丘脑脂肪酸合酶的表达。此外,它是证明慢性中央抵抗素注入导致减少体重和重大变化在外围的脂肪生成的酶的表达,在修复和nutrition-dependent方式(12]。

在先前的研究中,我们测试了抵抗素对GH释放的影响在体外。它已经证明了adipoine诱发GH剂量的方式释放adenopituitary细胞文化4 h的博览会。这种影响甚至更高的24小时抵抗素治疗(13]。这些结果表明抵抗素受体的存在垂体,受体尚未克隆。

本研究的目的是描述急性和慢性抵抗素的影响政府在脑垂体调节脂类代谢。除了因为这adipokine已报告参与炎症过程与肥胖有关,我们也研究了它对表达的影响大多数已知的促炎细胞因子,即tnf和il - 6 (14]。

我们研究了酶的表达;脂肪酸合成酶,FAS;丙二酰辅酶a脱羧酶(MCD);CPT-1 carnitina-palmitoil转移酶;脂蛋白脂肪酶(LPL);促炎细胞因子白介素6、il - 6;肿瘤坏死因子阿尔法,TNF -α。

2。材料和方法

2.1。试剂

胎牛血清(的边后卫)是获得科学Biobloce费舍尔。试剂盒试剂和MML-V逆转录酶(RT)从英杰公司购买(英国佩斯利)。杜尔贝科修改鹰的介质(DMEM),胶原酶从histolyticum梭状芽胞杆菌,deoxiribonuclease我原油冻干,透明质酸酶类型is牛测试,Dispase II(中性蛋白酶,二级)从罗氏诊断,SL。(西班牙巴塞罗那)。抵抗素是来自凤凰制药有限公司(德国卡尔斯鲁厄);10μg /鼠溶解在5μ生理盐水的L。

2.2。动物

男性的雄性sd大鼠中(300 - 350 g)被安置在一个温控房间,12 h灯,12 h黑暗周期(从0800 - 2000 h灯)。执行的实验在动物实验与国际法律协议,和实验协议经伦理委员会批准圣地亚哥德孔波斯特拉大学的。Intracerebroventricular (ICV)插管慢性ICV插管植入在氯胺酮和甲苯噻嗪麻醉如前所述[11,15,16]。

套管的正确的位置在侧脑室经亚甲蓝染色。动物被单独关在笼子里,允许恢复1周之前的实验。在术后恢复期,老鼠经常nonstressful条件下处理。

2.3。急性抵抗素治疗

一群老鼠是美联储随意,另一组是剥夺食物12 h(夜间禁食)。老鼠然后收到单个ICV注射抵抗素(凤凰制药有限公司,卡尔斯鲁厄,德国;10μg /鼠溶解在5μL(生理盐水)或车辆。老鼠被杀1.5 h后注入。治疗开始在0800 h、进行阶段。

2.4。慢性抵抗素治疗

大脑注入套管stereotaxically放置入侧脑室如上所述。从大脑灌注导管管连接套管的渗透微型泵流主持人(模型;中打开2001 d或2名为ml2帕洛阿尔托Alza Corp .)、钙、美国)。动物的sc口袋背表面使用钝性剥离,成立和渗透插入微型泵。关闭切口缝合,老鼠保暖,直到完全恢复。然后老鼠充满车辆或抵抗素(10μ克/天)6 d。4天,一群老鼠是美联储随意,另一组是剥夺了最后两天的食物。

2.5。垂体细胞分散和文化

分离大鼠垂体前叶细胞获得使用酶分散协议。简单地说,对于每一个实验,三到四个前脑垂体后汇集,剁碎,孵化和保持酶的分离的DMEM补充胶原酶0.4%,0.01%脱氧核糖核酸酶、透明质酸酶0.1%,dispase二世在37°C 0.2% 5%的股份有限公司₂气氛,组织机械每10分钟,直到均匀分散细胞悬浮。细胞生存能力,台盼蓝测试,估计一直在90%以上。

分散镀垂体前叶细胞密度的300000个细胞到24-well文化板块1毫升DMEM antibiotic-antimycotic补充10%的边后卫和0.1%的解决方案。

在37°C细胞孵化有限公司5%₂大气,介质被新的取代DMEM-FBS后48 h的文化。后三维文化时期,中被删除,和细胞preincubated 1毫升血清DMEM的2 h稳定基底激素分泌。中被替换为新的DMEM包含增加抵抗素的剂量或相应的控制车辆和孵化4 h 37°C。

介质样品收集在实验结束时,储存在-20°C到激素决定的RIA。

细胞培养板加工的RNA提取如下表示。

2.6。测量RIA的生长激素

GH水平文化媒体以25 - 50的体积μL使用双抗体法和放射免疫检定法包请由美国国立卫生研究院(a . f . Parlow博士趋势,国家激素和肽项目;托兰斯、钙、美国)。老鼠GH-I-7贴上^125年我使用chloramine-T方法和Iodo-Gen预涂碘化管(美国皮尔斯,罗克福德,IL),分别。激素浓度使用参考准备GH-RP-2表示为标准。内部,interassay变异系数对GH分别低于6%和9%。的敏感性测定GH 5 pg /管。证实了激素决定的准确性评估大鼠血清样本已知的激素浓度作为外部控制。

2.7。实时定量PCR酶参与脂类代谢

的mRNA水平acetyl-coenzyme羧化酶(ACC)α、il - 6、TNFα,脂蛋白脂肪酶(LPL)研究了使用实时PCR (TaqMan;美国应用生物系统公司,培育城市,CA)通过使用特定的引物和探针作为补充数据发布在内分泌学会期刊的在线网站http://endo.endojournals.org/)如前所述17,18]。所有反应进行了使用以下循环参数:50°C 2分钟,95°C 10分钟紧随其后40周期为15秒95°C,和60°C 1分钟(17,18]。

分析的数据,输入值的基因感兴趣的是18岁的标准化值样本组,并表示与平均值相比vehicle-treated组。我们用六到八大鼠每组。

2.8。统计分析

数据表示为均值±vehicle-treated老鼠SEM(%)的关系。统计学意义是由——学生的测试,两组进行比较或通过方差分析和因果双尾Bonferroni测试时两组比较多。被认为是显著的。这个程序用于分析GraphPad棱镜。

3所示。结果

3.1。中央管理急性抵抗素不调节垂体脂肪酸代谢

中央急性抵抗素政府诱导FAS的mRNA表达的变化,价格上调,CPT-1, LPL和促炎细胞因子il - 6和TNF -α表明垂体脂肪酸代谢不受中央急性抵抗素治疗(图1)。

3.2。中央管理慢性抵抗素调节垂体脂肪酸代谢

中央长期政府抵抗素的表达水平显著降低FAS和LPL表明抵抗素不参与脂质合成。我们还观察到CPT-1和MCD mRNA水平高于在禁食条件下和抵抗素的存在。对促炎细胞因子,抵抗素减少mRNA水平的il - 6和TNF -α在禁食大鼠(图2)。

3.3。抵抗素对大鼠垂体细胞培养的影响

对垂体知道抵抗素直接参与脂质代谢,我们有检查的效果增加剂量的抵抗素(10⁻¹⁴-10年⁻⁶米)在mRNA水平大鼠垂体前叶细胞培养暴露在adipokine 4 h。如图3抵抗素是管理4 h,显著降低了FAS显示低水平的信使rna与10⁻⁸米和10⁻⁶抵抗素浓度。LPL显示减少酶的表达水平最高的抵抗素剂量使用。关于CPT-1酶,抵抗素诱发一个增强转移酶酶表达在10⁻⁸和10⁻⁶M adipokine的剂量。两种促炎细胞因子,研究显示低水平的mRNA在10⁻⁶m . tnf甚至呈现低水平在其他抵抗素浓度(10⁻¹⁰米到10⁻⁶米)。

4所示。讨论

虽然抵抗素最初建议促进胰岛素抵抗和脂肪细胞的分化,最近的数据表明,这种激素在啮齿动物也是一个多效性的作用,免疫力,食物摄入量,性腺功能,下丘脑和外围脂质代谢调控19]。最近的一项研究我们的抵抗素组增加了一个新的角色,调节垂体somatotrope细胞的功能。抵抗素提高GH释放通过多个信号通路的激活13]。

具体来说,抵抗素增强GH释放随意喂养大鼠抵抗素在急性时(1.5小时)或慢性(6 d)的方式增加垂体转录因子Pit-1的记录数据。重要的是要确认是否resistin-induced Pit-1 mRNA表达的变化与激素蛋白质含量,因为它最近报道,POMC基因表达改变并不总是与特定的变化α-MSH下丘脑蛋白质含量(20.]。进一步的工作,使用不同的实验技术作为高效液相色谱结合RIA或蛋白质组学分析,将有助于澄清这些问题21]。

之前的工作在我们的小组报告说,4 h抵抗素管理分散的大鼠垂体前叶细胞增加GH释放(13]。因此,我们的研究结果证实的监管作用抵抗素与老鼠GH分泌美联储随意。人们普遍认为的规定从垂体前叶GH腺的分泌是互惠的控制下的两个下丘脑激素,刺激GHRH发现弓状核和抑制激素,生长激素抑制素(研),合成在室旁核(22]。我们的研究结果表明,抵抗素可能调节GHRH或研获得GH分泌释放,或据报道之前,抵抗素可以直接通过somatotropes调节GH释放(13]。

抵抗素调节脂质代谢集中和报道了在外围Kjems和同事12]。这里,我们已经扩大了研究脑下垂体,学习如果腺中抵抗素调节脂肪酸代谢在活的有机体内和adenopituitary细胞文化在体外。

我们证明慢性中央政府抵抗素在6 d,但并不会对政府在90分钟,修改的mRNA水平脑下垂体的脂肪酸代谢酶。此外,抵抗素降低il - 6和TNF -αmRNA水平对大鼠慢性治疗和抵抗素在大鼠暴露在adipokine adenopituitary文化。详细,抵抗素mRNA水平下降的FAS脑垂体和增强的mRNA水平CPT-1 MCD抵抗素在6 d大鼠管理的时候,但是没有效果adipokine时管理急性(90分钟)。我们的数据表明,中央长期抵抗素治疗导致减少的数量记录腺,adipokine fat-promoting酶的促进β氧化nutrition-independent时尚。这种效应在脑下垂体的生理意义是有趣的。我们证实,脂肪酸代谢酶调控腺是相反的,被其他作者在其他外围组织描述为白色脂肪组织和肝脏(12]。抵抗素的原因增加CPT-1 MCD垂体和减少FAS表达不清楚;然而,它表明垂体脂肪酸代谢酶表达可能是由机制不同于那些在脂肪细胞和肝细胞。瘦素等其它酶也有不同的角色取决于他们的行为在中央或外围水平(23]。另一方面,我们的结果是相似的部分结果Kjems和同事发表在中央的下丘脑抵抗素减少FAS mRNA水平(12]。

我们建议,在下丘脑,垂体ACC mRNA水平低可能是一个补偿性的生理机制,防止有害的高水平的malonyl-CoA产生后的腺FAS抑制(24]。CPT-1和背景下,我们的研究结果表明,在resistin-treated CPT-1 mRNA水平加强联储老鼠在同一时间框架,表明malonyl-CoA水平改变,由于ACC MCD激活和失活,也许来源于ACC mRNA水平低和高MCD mRNA水平。

最近的数据指出,中央抵抗素诱发肝胰岛素抵抗增加促炎细胞因子的表达,如il - 6和TNFα通过一位身份不明的机制,由自主神经系统(8,11]。这些促炎adipocytokines变化可能是由于,在某种程度上,脂肪酸和甘油三酯在肝脏的过度积累和抵抗素(集中处理后25- - - - - -27]。因此,没有增加的脂肪沉积由于偏向β氧化可能至少在一定程度上解释了低mRNA水平的il - 6和TNF -α集中在腺抵抗素治疗后,直接在adenopituitary细胞文化。进一步的调查是必要的澄清这个问题。

最后,我们调查了对垂体细胞抵抗素对脂质代谢的影响文化,我们发现了相同的结果体内,抵抗素mRNA水平下降的酶参与调节甘油三酸酯吸收和脂质代谢,如LPL、ACC, FAS, SCD-1,和关键转录因子调节脂质代谢,如SREBP-1c和增强CPT-1记录数字,MCD抵抗素在管理期间4 h adenopituitary细胞文化。我们发现抵抗素10重大活动⁻¹²抵抗素10⁻¹⁰米,这是循环抵抗素在大鼠的浓度范围内28]。值得注意,抵抗素的影响并不遵循典型的剂量反应模式在受体基因表达,观察已经报道了这个和其他信号分子(29日- - - - - -32]。尽管目前尚不清楚的原因,可以提出几个可能性。可能,这取决于其浓度,抵抗素可能诱导不同结构构象的受体(s)和/或抵抗素受体的选择性相互作用(s)与其他受体(即。,homo -或heterodimerization),进而可能修改抵抗素活动作为其他受体据报道发生在响应相应的配体(33]。总之,未知是否抵抗素的影响是由一个或多个受体,因为没有被确认。如果有一个以上的抵抗素的受体,它可能是可能的,他们可能有不同的亲和力为抵抗素与不同的生物效应,可以解释观察到的非典型的剂量反应曲线。然而,直到更多的数据,这些解释目前投机。抵抗素可以诱导β氧化对促进脂肪存储。其他肽激素或GHRH GH促分泌素对脂质代谢在脑垂体中类似的行为(我们实验室的初步数据)。此外,抵抗素降低il - 6和TNF -αmRNA水平在老鼠暴露在adipokine adenopituitary文化发生的在活的有机体内实验。这些结果表明抵抗素促进β氧化在脑下垂体,减少促炎细胞因子的水平,adipokine这行动直接在垂体前叶细胞,表明脑下垂体就有可能成为复星的投资目标控制的疾病引起的胰岛素抵抗。

总之我们表明政府抵抗素的老鼠在活的有机体内adenopituitary细胞培养在体外唤起对垂体重要影响。

抵抗素长期输液的中央政府增加酶mRNA水平涉及脂质β氧化活性和抑制mRNA表达水平的脂质合成的酶在活的有机体内和体外。

慢性adipokine管理降低il - 6和TNF -α记录数据在活的有机体内和主要文化实验。

在一起,这些结果提供的证据表明,垂体是抵抗素的直接和间接目标行动的脂质代谢调控腺本身。它是可行的,垂体adipokine表达式作为外围代谢信号之间的联系。垂体控制脂肪储存和代谢能提供另一个重要的一步解开之间的交互中心,外围,和adipocytokines,这将提高我们对代谢综合征和肥胖的理解。

确认

莎拉博雷利博士后项目;BFU 2011和cib肥胖症患者y Nutricion(皇家研究院祝您健康卡洛斯Tercero (ISCIII) Ministerio de Ciencia e Innovacion)。Juan de la Cierva程序(Ministerio de Educacion y Ciencia)。