文摘
趋化因子CX3CL1是独一无二的,拥有的能力作为一个双重代理:化学引诱物和化合物的粘合剂。代理通过其唯一受体CX3CR1 CX3CL1参与许多过程在人类胎盘组织,包括炎症和血管生成。强烈调节缺氧和/或inflammation-induced炎性细胞因子分泌,本地CX3CL1可能作为重要的血管生成因子。糖尿病的临床观察和组织病理学研究胎盘已经证实缺氧和炎症反应的发生率增加与有缺陷的血管生成。在这项研究中,我们研究了相对(糖尿病C类复杂与正常怀孕)之间的相关性CX3CL1内容在胎盘组织,意味着CX3CR1表达式,和胎盘微血管密度的网络。夹心酶免疫分析法是申请CX3CL1测量在胎盘组织匀浆,而定量免疫组织化学技术被用于评估CX3CR1表达和微血管密度。显著差异已经观察到的所有分析参数之间的组织。CX3CL1在糖尿病的平均浓度增加,伴随着增强胎盘微脉管密度以及更高的CX3CR1表达式。总之,我们建议CX3CL1 / CX3CR1信号通路参与胎盘微脉管系统重构的pathomechanism糖尿病类C。
1。介绍
增强免疫耐受在怀孕期间防止出现炎症免疫反应,可能会造成胎儿拒绝1]。在人类胎盘细胞因子网络的特定角色包括本地调制的pro和抗炎因子之间的平衡2]。因此,加上怀孕特有的荷尔蒙,足够的胎盘细胞因子参与免疫控制是至关重要的正常胎儿的宫内生长(3]。因为许多炎症介质是血管生成,任何障碍与精确定量的转变促炎细胞因子之间的平衡及其抑制剂的发展可能会影响胎盘血管(4]。孕期糖尿病的Pathomechanisms包括氧气和代谢途径的改变,导致异常的胎盘绒毛生长和功能(5]。据报道,糖尿病患者胎盘组织内血管生成反应的失调可能严重影响胎儿健康的易感性增加缺氧和hypoxia-associated凋亡触发器(6]。
胎盘的临床观察和组织病理学的研究证实了炎性反应在糖尿病的发生率增加7,8]。妊娠期间糖尿病的C类(白色)是最后阶段没有公认的血管形态变化在光学显微镜(9)(表1)。我们之前显示密度的增加在C类人类糖尿病胎盘绒毛血管网络是与更高的组胺和血管内皮生长因子(VEGF)浓度和胎盘肥大细胞数量的增加10,11]。因为几个mastocyte-derived介质,包括组胺、血管生成和调节内皮细胞增殖和功能,肥大细胞脱粒可能增加局部血管生成(12]。一种解释为肥大细胞数量的增加是糖尿病患者胎盘组织中肥大细胞的迁移。考虑这个,趋化因子的作用cytokines-chemokines发病机理的diabetes-induced neovascularization-should被怀疑13]。
趋化因子形成细胞因子超家族,与主要的角色参与免疫反应的调制和白细胞迁移的指导朝向或远离趋化物质(化学引诱物或chemorepellent活动、职责)。14]。首先描述趋化因子CX3CL1(也称为fractalkine或neurotactin)于1997年被Bazan等人,锅等。15,16]。迄今为止,人类染色体编码16岁,拥有三个氨基酸残基之间的第一个分子中两个半胱氨酸残基,CX3CL1是唯一的成员CX3C亚科(δ)趋化因子(17]。不像其他的趋化因子,CX3CL1 nonhaemopoietic起源和以可溶形式存在趋药性的蛋白质和membrane-anchored形式主要是内皮细胞作为酶分子。可溶性CX3CL1域的主要角色包括趋化现象的活动自然杀伤(NK)细胞,T细胞,单核细胞,肥大细胞,但不是中性粒细胞,而membrane-anchored白细胞的趋化因子参与推广形式绑定和附着力。这种双重功能(化学引诱物和胶粘剂复合)使CX3CL1独特在已知的趋化因子亚科(18]。连同其他一些趋化因子(亚兰、CCL7 CCL14) CX3CL1参与植入的过程,滋养层入侵子宫螺旋动脉,胎盘血管生成,炎性反应和免疫因素在子宫胎盘单位,和引产术19- - - - - -21]。胎盘血管内皮细胞,血管平滑肌细胞,羊膜上皮细胞的主要来源是在人类胎盘CX3CL1包括膜(22- - - - - -24]。
CX3CL1行为是由其唯一受体CX3CR1(以前称为V28), Gα我蛋白质seven-transmembrane受体(25]。CX3CR1证实在内皮细胞的表达,以及肥大细胞和其他细胞类型,包括单核细胞、NK细胞、t淋巴球的小胶质细胞、神经元和神经26]。受体CX3CR1刺激导致CX3CL1-dependent和integrin-dependent迁移细胞的激活和增强附着力的协同反应(27]。
强烈调节缺氧和/或inflammation-induced炎性细胞因子分泌,尤其是肿瘤坏死因子-α(TNFα)、γ干扰素(干扰素γ),interleukin-1β(il - 1β),本地CX3CL1可能作为一种重要的血管生成因子(28]。据报道,激活CX3CL1 / CX3CR1信号通路诱导血管生成通过两个连续的步骤:缺氧诱导因子1α(HIF-1的感应α)和血管内皮生长因子(VEGF)基因表达和随后的VEGF-A /血管内皮生长因子受体2型(VEGFR2或KDR)诱导血管生成(29日,30.]。
本研究的目的是检查相对(糖尿病类C-complicated与正常怀孕)之间的相关性CX3CL1内容在胎盘组织,意味着CX3CR1表达式,和胎盘微血管密度的网络。
2。材料和方法
这项研究是符合进行人体实验的国际和当地法律和当地伦理委员会正式批准,并从女性获得书面同意使用他们的胎盘。严格地说,这项工作依法进行了世界医学协会道德规范(赫尔辛基宣言)实验涉及人类和手稿提交给生物医学期刊的统一要求已经实现了。
2.1。胎盘组织集合
十一胎盘获得单后未产妇妊娠并发糖尿病类C(组我;平均胎龄11天),而胎盘从妊娠期匹配获得短期控件(组二世;天)。所有怀孕被剖腹产终止由于胎儿利益(我),包括臀先露(盆腔纵向胎儿的谎言)组II。在所有情况下的控制血糖是满意的;糖化血红蛋白的水平的分数在所有三学期制的糖尿病妊娠保持在正常范围内(5% - -7.5%)。怀孕的课程组II是正常的,除了近期启动的子宫收缩活动。更详细的临床特点的两个研究小组给出了表1。
五切除标本以标准化的方式从每个胎盘:从该地区连续三个产妇表面(第一个从中央部分,接下来的两个外围区域的胎盘母体表面)和两个标本的地区连续的胎面(首先从脐带插入的地方,然后从周边地区)(图1)。组织材料通过这个过程受到冻结在二氧化碳雪CX3CL1浓度测量或固定在石蜡和削减5μ米,之前与苏木精和伊红染色过程和免疫组织化学。
2.2。测量CX3CL1内容
CX3CL1估计集中冷冻胎盘表皮。在处理过程中,材料保存在冰。产生溶菌产物之前,组织最初切成大约1毫米3多维数据集用刀片在玻璃板在冰上。为了执行一个温和的细胞破坏,数据集被转移到一个手持波特均质器。液化组织放置在1.5毫升管和离心机在13000转3分钟在4°C。是得到上清液用于体外定量测定的CX3CL1胎盘组织匀浆夹心酶免疫分析法。趋化因子C-X3-C-Motif配体1 (CX3CL1)生物测定酶联免疫试剂盒(人类;猫。不。024096)是应用与探测距离0.156 -10 ng / mL和灵敏度0.053 ng / mL。每个检查胎盘的平均值计算,并表示在pg / g湿组织重量。
2.3。免疫组织化学的CX3CR1
人类胎盘石蜡5μ米部分受到标准免疫组织化学程序导致CX3CR1可视化。兔多克隆抗体免疫球蛋白CX3CR1 (ab8020;Abcam Inc .)、美国;浓度的10μg / mL)作为主要和山羊anti-rabbit免疫球蛋白作为生物素化的二次抗体(ab64256;Abcam;0.5% v / v)。为了可视化主要anti-CX3CR1抗体,StreptABComplex /合二重唱(Dako Cytomation,斯特鲁普,丹麦),制造商推荐的协议后,与3、3′-diaminobenzidine作为发色体。各自负控制疣状被替换准备同时正常兔preimmune主要多克隆抗体的免疫球蛋白与磷酸盐缓冲盐水稀释,含有3%牛血清白蛋白在同一蛋白质浓度,用于主要的抗体。
2.4。意味着胎盘微血管密度
识别的脉管系统在胎盘部分元素进行使用内皮细胞标记,兔多克隆抗体anti-CD31(稀释1:50,ab28364;Abcam Inc .)、剑桥、马、美国)。该组织主要抗体孵育30分钟。接下来,一个生物素化的山羊anti-rabbit抗体作为二级(Abcam)。
使用光学显微镜和计算形态测量学定量分析(定量电视显微镜500 c +徕卡提供的图像分析工作站,英国),血管/没有血管的组织的指数(V / EVTI)估计在校准领域的胎盘部分。每个准备(石蜡切片)接受三个区域分析由两名有经验的重复,独立观察员。单一区域用图像分析仪测量达到721320μ米2和准备的总数55每组。图像分析过程包括在总血管面积的测量。因此,所有类型的总腔面积确定船舶在两组总结。最小化的目的破坏引起的技术错误,尤其是unaxial部分的容器,雪貂的直径是公认的最低价值单腔的直径。因此,V / EVTI代表的比率,它反映血管化和强度是最密切相关的平均密度微血管胎盘(31日]。
2.5。表达CX3CR1
疣状后,基于图像测量软件定量免疫组织化学(定量电视显微镜500 c +)申请CX3CR1受体识别石蜡5μ米的光学显微镜下胎盘标本。所有的形态学过程由两个独立的研究人员进行了两次,结果的平均值上传记录选项卡。免疫染色强度评估使用的意思是颜色饱和度参数,在灰度级直方图阈值。因此,CX3CR1的表达与应用校准总面积的检查部分,在色彩饱和度由segmentation-separation标准对象。单一的分析图像面积达138692μ米2(放大×200)。总共有165视觉领域分析了视觉领域/胎盘(15)在每一个研究小组。达到最大精度测量,控制或监控以下因素:平均的图像摄取,色调,照明,亮度,电源,照明面积的百分比的量化关系积极染色结构,阴影校正和热身。这些地貌形态示量程序的更详细的描述了以前在其他地方(31日,32]。假设CX3CR1表达式的精度测量可能会影响当地的胎盘微血管密度的差异,在两组中,我们研究了相对血管density-matched样本差异的容忍范围±5%33]。的形态学结果由90%置信区间被报告为±SEM意味着百分比值。
2.6。统计分析
使用Statistica 8.0统计分析软件(Stat-Soft、波兰)。Mann-Whitney的测试应用。结果表示为±SEM意味着±SEM或平均百分比值。差异二组(糖尿病类C)和组(正常怀孕)被认为具有统计学意义。
3所示。结果
结果与CX3CL1内容在胎盘组织中,微血管的平均密度,和CX3CR1表达数据进行了总结2(一个),2 (b),2 (c),分别。显著差异已经观察到的所有分析参数之间的组织。
(一)
(b)
(c)
削减的平均浓度CX3CL1胎盘从糖尿病组(I)组相比,增加控制(第二组)和达pg / g的湿重±SEM和(图2(一个))。CX3CL1水平没有明显差异之间的标本收集的孕产妇和胎儿胎盘表面。
意味着V / EVTI值(绝对值±SEM)糖尿病类C-complicated怀孕后胎盘组织中得到提高(),总计与在正常控制(图2 (b))。这些平均值的V / EVTI评价完全为每个组,用获得的部分数据收集胎盘样品。然而,我们观察到两组,从母体获得样品表面微血管的平均密度表示为V / EVTI明显高于()相比,意味着V / EVTI计算从胎儿获得胎盘组织标本的表面(数据没有显示在图表)。
评价之间的关系意味着CX3CR1表达式和平均V / EVTI显示强阳性组(图之间的相关性和显著差异3)。CX3CR1在糖尿病的高表达与胎盘血管化的增加,由V / EVTI评估。
免疫组织化学技术用于识别CX3CR1透露,这种受体主要位于胎盘内皮细胞(图4)。CX3CR1表达的平均百分比值估计血管density-matched样本非常高()在糖尿病和达成(%,±SEM)在第二组中(图建立的参考价值2 (c))。
(一)
(b)
4所示。讨论
增长、维护和微血管功能的胎盘可能会影响到大多数病变在母体/胎儿血流动力学和血液成分的改变或内容34]。不同作者独立工作报道,诱导的炎性环境本质上是参与糖尿病的病理生理学,包括糖尿病患者胎盘(7,35]。在这种环境下,频繁的地方缺氧和瞬态高血糖(甚至在控制情况下)是观察和与氧自由基水平升高有关,晚期糖化终端产品(年龄),和一些促炎细胞因子,特别是那些与血管生成属性(6,35]。然而,它也被报道,胎盘表达炎性细胞因子在氧化应激反应显著降低妊娠期糖尿病(36]。本研究不涉及女性糖尿病患者C类,和CX3CL1浓度没有检查。
二次缺氧,提高当地的TNF水平α,干扰素γ,il - 1β加强CX3CL1的血管生成作用,只是与这趋化因子的浓度增加28,29日,37]。CX3CL1刺激体外和体内血管生成在剂量和时间的方式和作用于内皮细胞比著名的血管生成因子VEGF(更强烈29日]。据报道,CX3CL1(100海里)诱导内皮细胞形成毛细管至少在合成矩阵相同的效率血管生成介质bFGF (60 nM)和VEGF(100海里)38]。基于可用的数据到目前为止,没有明确的立场上VEGF及其受体的角色VEGFR-2 CX3CL1-mediated血管生成(KDR / Flt-1)。一些作者报道,由血管内皮细胞激活CX3CL1 / CX3CR1通过VEGF-A / KDR诱导血管生成。增加VEGF生产可以通过途径包括低氧诱导因子- 1α(HIF-1α)和p42/44增殖作用(MAP)激酶(29日]。糖尿病胎盘在我们之前的研究,我们发现高VEGF表达水平与微血管密度增加呈正相关(11]。然而,另一项研究的结果表明,CX3CL1表达式及其血管生成的机制不同于VEGF的影响。强烈而缺氧诱导VEGF表达,缺血环境实际上抑制CX3CL1的表达。这一发现可能表明缺氧促进VEGF-mediated血管生成,而炎症涉及CX3CL1-related新血管的形成39]。考虑到这一点,我们的发现非常相关,而不是机械的。结果提供任何正式的证据因果CX3CL1 / CX3CR1系统参与改变胎盘血管,特别是因为我们之前报道的胎盘VEGF表达的变化(11]。
CX3CL1调节血管生成的分子机制的研究在人类脐静脉内皮细胞(HUVEC)表明,CX3CL1没有增加VEGF mRNA的水平。这些结果表明,CX3CL1可能作为直接血管生成调制器在没有诱导的内皮细胞VEGF表达。很可能的血管生成活动CX3CL1和VEGF是相互独立的但是利用Raf1 MEK / ERK激酶级联,P13 K / Akt /以挪士血管生成信号通路的激活介质一样普遍。换句话说,它提出了最近CX3CL1,通过CX3CR1代理直接在血管生成,可能激活两个前面提到的不同的信号通路(40]。
特征的所有步骤的复杂过程的新血管形成增强CX3CL1治疗后,包括内皮细胞增殖、迁移和管状结构形成(30.,41]。
CX3CR1表达式的显著upregulation记录在糖尿病内皮细胞也应考虑,特别是因为CX3CL1之间的自身调节的机制的存在和CX3CR142]。一种自动调整CX3CR1和CX3CL1之间通过自分泌环(CX3CR1 / CX3CL1轴)提出了由独立作者对许多细胞类型,包括内皮细胞(43- - - - - -45]。然而,到目前为止,没有令人信服的科学证据表明,相同的人类内皮细胞有能力生产CX3CL1同时表达CX3CR1。然而,由于CX3CL1 CX3CR1是唯一已知的受体,可能CX3CL1-induced内皮细胞迁移和毛细管的形成是通过CX3CL1及其之间的相互作用介导内皮受体CX3CR1以自分泌的方式(38]。
值得注意的是,CX3CR1信号记录在图4和被认为是内皮细胞也可能来自周。double-staining技术或高分辨率,在将来的研究中应该实现大功率成像来阐明这个问题。
过度的CX3CL1和其他炎症介质可能增强血管生成在胎盘单位负责。根据其他研究的结果,CX3CL1函数的监管可能会保持蛋白质和基因表达水平。增加表达基质金属蛋白酶(MMPs)和disintegrin金属蛋白酶()亚当斯,包括ADAM17 / TACE或sheddases在糖尿病患者胎盘已报告(46,47]。这些增长可能导致增加的浓度的可溶性形式CX3CL1,来源于其膜形式。
相比之下,糖尿病的促炎的背景,包括增加胎盘的TNF水平α,干扰素γ,il - 1β基因表达,促进增强CX3CL1 [48]。
还需要进一步的研究来确定哪些CX3CL1监管机制主要见于糖尿病类C。
糖尿病并发症的经典例子与有缺陷的血管生成增加由CX3CL1炎症背景是增生性视网膜病变(38,49]。
在本研究和先前的报道,我们提供的证据改变糖尿病患者胎盘血管化。目前调查的结果强烈支持的假设CX3CL1-related通路参与胎盘血管生成的pathomechanism糖尿病。增加V / EVTI值是符合我们之前的方法评估胎盘类C在糖尿病微血管的密度对组胺浓度和肥大细胞数量(10,11]。
趋化性分析进行体外由其他研究人员已经证明,增加CX3CL1水平启动和增加特定CX3CR1-positive神经的炎症细胞的迁移50]。例如,我们以前观察到的肥大细胞数量的增加糖尿病患者胎盘和异质性的变化,即转变的定量tryptase-positive和类胰蛋白酶/ chymase-positive细胞[之间的平衡51]。这种转变可能会影响糖尿病的胎盘细胞因子网络资料,其中可能包括当地CX3CL1浓度的增加。考虑CX3CL1的双重角色,影响胎盘血管生成机制和相关的直接行动CX3CL1 CX3CL1化学引诱物的特性应该被考虑。有趣的是,尽管人类肥大细胞CX3CR1的明显表达式,CX3CL1并不直接产生肥大细胞脱颗粒(52]。因此,CX3CL1不应简单地与肥大细胞介导血管生成(12]。
应该明确表示,改变不一定是由于血管生成和血管模式可能是血管重建的一种形式,而不是公开的毛细管增长。这种现象说明了更大,而不是更多船只描绘在图4。算法用于列举血管变化不允许微血管的捕捉53]。
总之,很可能增加糖尿病班上CX3CL1浓度C,连同upregulation的具体的和唯一的受体,CX3CR1,参与pathomechanism胎盘微脉管系统的重构。还需要进一步的研究来阐明理由anti-CX3CL1或anti-CX3CR1疗法在糖尿病怀孕。
利益冲突
作者报告没有利益冲突或与此相关的研究发现在本文中指定。