文摘
低温治疗后保护神经元损伤中枢神经系统(CNS)。通常小胶质细胞表达的toll样受体)扮演重要角色在无菌中枢神经系统损伤的发病机制。阐明可能在低温治疗的神经保护作用机制,我们研究了低温的影响文化TLR3-activated小胶质干扰素(IFN)的释放β和一氧化氮(NO)与神经细胞死亡有关。当老鼠小胶质细胞培养条件下的低体温(33°C)和正常体温(37°C) TLR3受体激动剂,polyinosinic-polycytidylic酸,干扰素的生产β也没有在TLR3-activated小胶质细胞在48小时被正常体温相比减少了体温过低。此外,暴露在重组干扰素-β和硝普酸钠,一个没有捐助,死老鼠神经嗜铬细胞瘤引起的PC12细胞24小时后浓度的方式。总的来说,这些结果表明小胶质干扰素的生产——的衰减β也没有抑制的低温治疗会导致神经细胞死亡。
1。介绍
toll样受体(通常)是其为病原体的主要传感器的分子模式(pamp)调解先天免疫和适应性免疫反应参与1]。生产和发布的受损细胞分子的异常表达或结构改变可以刺激通常的活动(2,3]。在这种情况下,这些分子被认为是损害或危险分子模式,立即引发反应或增强对组织损伤和炎症反应(3- - - - - -5]。
小胶质细胞表达通常和主要免疫细胞在中枢神经系统(CNS)。功能特征得到了太多的关注,因为这些细胞是大脑的主要来源的免疫介质(6]。虽然通常的刺激小胶质细胞激活函数,对消除病原体(很重要7),小胶质通常,尤其是TLR2和TLR4,调解stroke-induced损伤中枢神经系统(8,9)、神经炎症和神经损伤(4,5,10,11通过对内源性化合物)。Lehnardt等人详细调查的角色内生机制触发激活的小胶质通常4]。他们发现分子的监护人,热休克蛋白60 (HSP60),作为中枢神经系统损伤的信号通过激活小胶质由TLR4信号通路介导和TLR适配器蛋白质叫做骨髓分化因子88 (MyD88)。垂死的中枢神经系统细胞释放HSP60结合小胶质细胞,进而毒害神经的分泌一氧化氮()。这些数据提供了第一个证据的内源性通路可能是常见的许多形式的神经损伤和双向链接的中枢神经系统炎症与神经退化。Lehnardt et al。4]这些事件特征为“神经退化的恶性循环,”中枢神经细胞死亡的最初原因,不管其性质,导致释放内源性分子从垂死的细胞,激活小胶质细胞通过通常。这导致神经毒性分子的释放,造成进一步伤害邻近的神经元。符合这一假说,坏死神经元激活小胶质细胞的MyD88-dependent通路,导致不仅释放,同时也促炎细胞因子,如白介素6 (IL)和肿瘤坏死因子(TNF)α(5),与神经损伤(12,13]。
低温治疗可以保护神经元严重脑损伤后,如发生创伤性脑损伤(TBI)后,心脏骤停14,15]。阐明神经保护作用的可能机制负责,我们和其他人检查是否减少温度的影响在体外通过激活的小胶质释放炎症因子TLR2和TLR4,表明小胶质肿瘤坏死因子——的生产α、il - 6和实际上是降低了低温培养条件下(16- - - - - -20.]。
在目前的研究中,我们重点检查体温过低的文化的影响干扰素(IFN)的生产β和小神经胶质细胞,TLR3被激活,为了更好地理解低温治疗和小胶质反应之间的关系。TLR3是一个主要的中介细胞对病毒感染的反应,即使在中枢神经系统(21),因为它对双链RNA(极),一个共同的中间病毒复制的22]。这种抗病毒反应的特点是高的I型干扰素的表达,主要是干扰素-α和干扰素-βTLR3的刺激引起的,这是23]。在炎症,TLR3还承认坏死细胞释放的RNA作为内源性配体(24- - - - - -26),导致I型干扰素的释放(24,25]。因此,host-derived核酸可能作为内源性配体激活TLR3,尤其是小胶质细胞,这可能会进一步增强中枢神经系统的炎症。
在目前的研究中,我们使用一种合成模拟dsRNA, polyinosinic-polycytidylic酸(聚(我:C)),刺激TLR3信号。这种化合物激活小胶质细胞在体外(27,28),在活的有机体内(29日- - - - - -31日),后者会导致神经退化(29日]。因此,聚(我:C)可用于研究由TLR3-driven神经炎症小胶质细胞在中枢神经系统。保利(我:C)诱发I型干扰素(32),干扰素-β比干扰素-α,在小胶质细胞(27]。尽管有一些抗炎作用在中枢神经系统,例如,干扰素-β减少促炎细胞因子的表达(33,34和抑制T细胞的渗透35),它直接导致神经细胞死亡(36)和作为其他细胞因子的发现,I型干扰素的超标或不适当的活动会导致中毒甚至死亡(神经退化)[37,38]。因此,干扰素的作用β在中枢神经系统有点争议。
以确定其参与神经保护引起体温过低,我们调查是否干扰素-β和直接导致死亡的神经嗜铬细胞瘤细胞(PC12)。
2。材料和方法
山口大学医学院动物保健委员会审查和批准在这项研究中使用的所有协议。
2.1。隔离的小胶质细胞
小胶质细胞分离得到1 -大脑的主要文化抱Wistar鼠或C57BL / 6 n小鼠(从日本购买SLC、滨松、日本)如我们之前的报告所述,包括切除脑膜(20.,39]。细胞纯度> 95%,由流仪分析和免疫细胞化学染色小胶质的标记,Mac-1 (CD11b)和Iba1,分别。小胶质细胞的标记都是可靠的标记在这个孤立的传统方法的这些细胞具有类似纯度(90% - -99.5%)5,40,41]。我们使用anti-Mac-1 (Immunotech,马赛,法国)和anti-Iba1 (Wako纯化学工业,日本大阪)抗体,分别为这个目的。此外,我们确认了文化并没有使用抗体对星形胶质细胞胶质原纤维酸性蛋白通过免疫细胞化学染色,根据另一项研究的结果(40]。
2.2。小胶质细胞培养
老鼠小胶质细胞(在未经处理的细胞/ 96 -孔板)孵化有或没有聚(我:C) (100μg / mL;美国圣地亚哥Imgenex CA)在杜尔贝科修改鹰的介质(DMEM) (Gibco,宏伟的岛,纽约,美国)含10%胎牛血清的边后卫(Gibco)。细胞培养在低体温(33°C)和正常体温(37°C) 48 h来衡量干扰素的生产β和。我们初步调查的基础上对每个变量的最优反应,聚(我:C)的剂量和潜伏期测定。浮在表面的游离是储存在−80°C。
2.3。干扰素-β分析
干扰素-浓度的老鼠β出现在小胶质文化上层清液以重复使用酶联免疫吸附试验(ELISA)试剂盒(PBL干扰素源,皮斯卡塔韦,新泽西,美国),根据制造商的指示。我们进行干扰素-β测定小鼠,因为只有鼠标IFN -酶联免疫试剂盒β是商用。
2.4。没有分析
生产老鼠和老鼠小胶质细胞检测和量化的亚硝酸盐(),一个相对稳定的代谢物培养基中积累。使用格里斯试剂比色测定(Sigma-Aldrich,圣路易斯,哦,美国)如前所述执行(20.,39]。
2.5。PC12细胞培养
河鼠PC12细胞系得到理研生物资源中心的(日本、茨城、日本)。未分化细胞种植在DMEM 37°C (Gibco)补充10%的边后卫(Nichirei生物科学、东京、日本)和10%马血清(HS) (Gibco)。
2.6。细胞毒性试验
PC12细胞(细胞/)放置在I型collagen-coated 96 -孔板含有培养基和孵化24 h在37°C。此后,文化被换成了上层的DMEM补充条件培养基的0.1%的边后卫,0.1%的商品,和10 ng / mL鼠神经生长因子2.5 s (Almone实验室,耶路撒冷,以色列),包括各种浓度的老鼠重组干扰素-β(Sigma-Aldrich)或硝普酸钠(一种脱水捐赠者)(SNP;Wako纯化学工业),细胞培养24小时的37°C。文化的生存能力是决定使用WST-8 colorimetrically试剂(Nacalai Tesque,京都,日本)在修改3 - (4 5-dimethylthiazol-2-yl) 2, 5-diphenyltetrazolium溴化(MTT)还原试验42]。总之,文化上层清液取而代之的是条件培养液包括10% WST-8试剂和孵化37°C 1 h。吸光度测量在使用标450海里。提出了细胞的异常值相对于那些获得细胞治疗时车辆(0.04%无菌蒸馏水)之间的变化来控制实验。
2.7。统计分析
数据表示为平均值±标准平均误差(SEM)。两组的差异值或使用配对组间进行了分析以及或单向方差分析其次是Newman-Keuls多重比较方法(StatFlex Ver5.0, Artech,大阪,日本)。的价值被认为是表明一个显著差异。
3所示。结果
3.1。体温过低的文化对干扰素的产生的影响β
干扰素-β几乎检测不到48小时后如果鼠小胶质细胞的文化。保利(我:C)应用于鼠小胶质细胞培养在33°C或37°C诱导干扰素-β生产48 h(图1)。干扰素水平有显著减少β在33°C(低温)相比,在37°C(正常体温(图)1)。
3.2。体温过低的文化对生产的影响
发现在低水平如果老鼠和老鼠小胶质细胞后48 h的文化,在这两种情况下聚(我:C)提高吗生产(数据2(一个)和2 (b)、职责)。的生产未经处理或处理老鼠和老鼠小胶质细胞减少低体温与正常体温(数字2(一个)和2 (b)、职责)。
(一)
(b)
3.3。干扰素的作用- - - - - -β和SNP,没有捐助,神经元PC12细胞的可行性
干扰素-β和SNP诱导神经元的死亡PC12细胞浓度的方式暴露后24 h(数字3(一个)和3 (b)、职责)。这些细胞存活率显著的减少12 - 300 U /毫升IFN -β-10年(80%)降低-69%和0.08μM SNP(79%减少-63%),而车辆(数字3(一个)和3 (b)、职责)。
(一)
(b)
4所示。讨论
TLR信号可以通过识别pamp或诱导内源性组件。在病理生理条件下,这些内生受体激动剂产生或释放在nonphysiological外观异常浓度或存在(43,44),立即引发反应或增强对组织损伤和炎症反应在小胶质细胞(4,5,8- - - - - -11]。因此,了解TLR-driven小胶质细胞的神经炎症似乎特别意义的阐明低温治疗的神经保护效应背后的可能机制。我们之前检查体温过低的文化的影响的释放炎症因子通过激活小胶质细胞TLR2和TLR4 [19,20.]。在这里,我们专注于刺激TLR3和显示,在TLR3-activated小胶质细胞,低体温(33°C)降低干扰素的生产β和在48 h的文化。我们所知,这是第一篇描述小胶质反应低温使用保利(我:C), TLR3的活化剂。减少在低温下的文化水平是一致的报告关于活化剂TLR2和TLR4的16- - - - - -20.]。
增加一些促炎细胞因子的水平,如il - 1和il - 6,出现在重型颅脑损伤后脑脊液(CSF)在人类14,45,46]。这些潜在的毒害神经的因素是由活化的小胶质细胞在缺血后神经元被破坏或创伤(6,47,他们与继发性脑损伤有关13,48]。因此,证据表明,抑制小胶质细胞的释放这些因素有助于低温治疗严重的脑损伤后的神经保护作用[14,15,49,50]。事实上,低温治疗变弱的促炎细胞因子水平的增加在脑损伤后的中枢神经系统(14,49,51),这是与一个有利的结果与正常体温(14,49]。进一步,期间体温过低严重围产期窒息防止增加3′,5′环一磷酸(的一个标志老鼠大脑)。在这项研究中,100%的低体温的老鼠活了下来,而70%的死亡率是观察性常温组(52]。我们不知道任何干扰素水平——的报告显示β增加脑损伤后脑脊液在活的有机体内;然而,一种动物研究表明生产水平的提高干扰素-α和干扰素-β无菌中枢神经系统损伤后(53]。尽管某些抗炎作用在中枢神经系统33- - - - - -35),干扰素-β仍有可能有害。负责I型干扰素的神经毒性影响的机制仍不清楚;然而,一些调查人员推测,细胞因子的间接影响是由他们的行为对周围器官或神经胶质细胞,例如,I型干扰素诱导促炎介质释放小胶质细胞(54,55]。另一种可能性是,I型干扰素可能发挥对神经元细胞直接毒性作用。基因芯片分析大脑细胞的RNA从文化与干扰素治疗α表明,神经元非常敏感目标细胞干扰素(56]。与这些研究结果一致,干扰素-β引起死亡的神经细胞(36]。在这里我们发现低体温降低干扰素的生产β小胶质细胞的激活TLR3表达。综上所述,我们的研究表明,低温治疗的神经保护效应相关的生产的衰减和干扰素-β小神经胶质细胞,尽管这些发现的临床意义还有待确定。
确定可能的病理生理的参与的减少生产干扰素-β和小胶质细胞的低温神经保护,我们检查是否IFN -β和/或直接诱导神经元PC12细胞死亡。我们能够证明干扰素-β和独立减少细胞浓度的方式生存,与先前的研究在协议的影响(57]。我们所知,目前的研究第一次表明,干扰素-β产生这种效果,尽管我们知道它在人类神经母细胞瘤细胞系凋亡36]。浓度IFN -β- - -全身的神经细胞死亡在活的有机体内发现高浓度的中枢神经系统中枢神经系统损伤后(46,53支持这样的结论,减少在体温过低水平贡献对神经元的保护。条件媒体TLR3-activated小胶质细胞在此类实验中可能产生类似的直接影响;然而,我们没有成功在我们的初步尝试回答这个问题。
因为我们使用保利(我:C),合成模拟dsRNA,刺激TLR3在小胶质细胞,激活的受体可能在我们目前的研究不同于无菌中枢神经系统损伤。然而,聚(我:C)被用来使TLR3信号检查对某些非传染性的疾病的病理生理学(29日- - - - - -31日]。尽管如此,这将是利用感兴趣的rna作为内生TLR3配体(24- - - - - -26]从受伤的中枢神经系统细胞4在此类实验中。有趣也会研究其他CNS-derived内源性配体(s)与TLR3 colocalize在小胶质细胞,如stathmin、监管机构的微管(58),这是存在于髓鞘和调节神经炎症期间59]。进一步研究使用这些模型来证实我们现在发现可能产生临床相关数据。我们的研究表明,干扰素的生产β和小胶质细胞是TLR3信号激活时减少了保利低温培养条件下(我:C)。灭活TLR3使用方法如RNA干扰和/或使用TLR3-knockout老鼠将进一步支持TLR3信号的作用。
5。结论
在这里,我们表明,低体温降低干扰素的生产β和由小胶质细胞激活TLR3表达,这些因素诱导神经细胞死亡。我们的研究结果表明,干扰素的生产——的衰减β和由低温治疗导致抑制小胶质细胞诱导的神经细胞死亡。中风的研究通常的使用动物模型表明,激活内源性配体的释放会导致组织损伤和表明TLR2和TLR4 [8,9,60,61年),但不是TLR3,造成这一病理过程(62年]。尽管对老鼠的研究缺乏TLR3支持这些发现,小胶质细胞的激活TLR3保利(我:C)会导致神经退化29日]。这表明TLR3表达的小胶质细胞在中枢神经系统损伤中发挥作用在一定条件下。我们的研究专注于TLR3信号在小胶质细胞,是第一个低体温对TLR3-driven神经炎症的影响。他们揭示了可能负责低温治疗的神经保护作用机制。
确认
这项研究支持部分由教育部,文化,体育,科学和技术的日本,补助金(B)的青年科学家,不。22791435 t .松井。作者要感谢Enago (http://www.enago.jp/)英语复习。