文摘
兼性胞内病原体,金黄色葡萄球菌入侵巨噬细胞,然后促进cytoprotection感染细胞从而稳定安全的适合沉默的持久性。这个过程通过upregulation至关重要的凋亡基因,特别是,骨髓细胞leukemia-1 (mcl1)。在这里,我们调查了底层机制和信号转导途径导致增加mcl1表达被感染的巨噬细胞。生活金黄色葡萄球菌不仅刺激新创mcl1的合成,而且长时间的这种抗凋亡蛋白的稳定性。与此一致的是,我们证明mcl1的至关重要的作用金黄色葡萄球菌全身cytoprotection,因为沉默MCL1通过siRNA深刻逆转cytoprotection受感染的细胞,导致细胞凋亡。增加MCL1在感染细胞与增强NF表达以来B激活和随后的il - 6分泌,抑制NFB和il - 6的信号通路废除mcl1感应和cytoprotection。最后,我们确认我们的观察在活的有机体内在小鼠模型的脓毒性关节炎显示关节炎和mcl1的严重程度之间的关系表达式。因此,我们建议金黄色葡萄球菌劫持是Mcl-1-dependent抑制细胞凋亡以防止受感染宿主细胞的消除,从而使细胞内病原体的持久性,其传播感染的巨噬细胞,葡萄球菌疾病的进展。
1。介绍
金黄色葡萄球菌社区获得性和医院感染的一个主要原因,包括局部和全身威胁生命的条件,如骨髓炎、心内膜炎、肺炎、败血症(1]。尽管由于葡萄球菌感染的发病率和死亡率增加,相对很少有人知道这个病原体传播系统的分子机制。最近的研究表明,金黄色葡萄球菌不仅存活有中性粒细胞和巨噬细胞的吞噬作用,也能够坚持在这些细胞(2,3]。的情况一样单核细胞增多性李斯特氏菌和结核分枝杆菌(4- - - - - -6),长期生存,尤其是在巨噬细胞内,可能是葡萄球菌的传播机理。进一步支持了这一假设是观察到细胞内金黄色葡萄球菌腹腔巨噬细胞操纵信号流程和转录促进生存没有根除细菌感染的吞噬细胞(7]。因此,精确的说明cytoprotection诱导的巨噬细胞的机制,一个潜在的病原体在宿主体内传播的工具,是高度重视的。
最近,我们表明,活细胞内细菌诱导cytoprotection在人类和小鼠巨噬细胞,使病原体默默地坚持,保持无形的免疫系统(3,7]。我们建议病原体引发prosurvival信号通路通过抗凋亡因子的诱导表达,包括骨髓细胞leukemia-1 (mcl1)的抗凋亡蛋白bcl - 2家族。mcl1 bcl - 2具有同源性(BH)域1 - 4,类似于其他凋亡bcl - 2家族成员(bcl - 2, BCL-XL BCL-W, A1)。它隔离proapoptotic抑制细胞死亡的蛋白质(如伯灵顿,贝克,荡妇,彪马和坏的),因此稳定线粒体膜,防止细胞色素的释放c(8,9]。MCL1表达式可以被生存和分化诱导信号产生细胞因子和生长因子等的激活大量的著名的信号转导途径(例如,MAP激酶,PI3K / Akt, JAK / STAT,和NFκB) (10]。细胞mcl1水平监管也在改变蛋白质的周转率,这是依赖于害虫序列mcl1和其他主题的氨基端区域内目标的蛋白酶降解的蛋白质(8]。
在当前的论文,我们记录了mcl1水平升高金黄色葡萄球菌人来华的主要巨噬细胞在小鼠模型和关节化脓性关节炎,与巨噬细胞的渗透到滑液。我们首次显示,小RNA沉默抑制(si)MCL1在金黄色葡萄球菌对来华的巨噬细胞废除cytoprotection staurosporine-induced凋亡,证实mcl1的角色在维持在感染巨噬细胞的可行性。此外,我们证实金黄色葡萄球菌通过信号通路诱导mcl1 NF要求κB和il - 6,因为这些途径抑制部分抑制bacterial-mediated增强mcl1和cytoprotection表达式。因此,我们提出一个模型prosurvival基因的表达,如MCL1,使毒性金黄色葡萄球菌菌株绕过细胞死亡,从而确保安全的生态位在传播之前。细胞内调控人类巨噬细胞的寿命金黄色葡萄球菌了解发病机制的临床意义葡萄球菌使得传染病。
2。材料和方法
2.1。细胞培养
PBMCs隔绝人类血液用淋巴细胞分离介质(PAA)密度梯度产生的分数高纯度单核细胞(90% CD14-positive)如前所述7]。细胞被镀在/在24-well板块(Sarstedt) RPMI1640 (PAA)补充了2毫米谷酰胺,50μg / mL庆大霉素(σ),10% autological人类血清。24小时之后,不依从PBMCs被洗完全培养基,和贴壁细胞分化在这个媒介hMDMs 7天用新鲜媒介改变了每2天。血从红十字会,克拉科夫,波兰。红十字会血液消除识别信息材料适合人体机密性保证。因此,当前纸坚持适当的企业排除在人类受试者的批准。小鼠巨噬细胞的细胞系来源于美国类型文化集合的264.7是维护在DMEM (PAA)补充5%胎牛血清。
2.2。菌株、存储和生长条件
实验室金黄色葡萄球菌应变纽曼是请提供t·福斯特博士(三一学院、都柏林,爱尔兰)和大肠杆菌压力是来自实验室的股票。细菌生长的平稳增长阶段37°C下一夜之间不断旋转(180 rpm),然后通过离心收集(5000克,8分钟),用磷酸盐洗净,resuspended PBS所需的。在37°C葡萄球菌被孵化调理的热灭活FCS 30分钟,洗净,resuspended PBS。至关重要的细菌数量在样品用于镀吞噬试验验证他们的照例是稀释在琼脂板和菌落计数来确定每毫升CFU。热处理(一小时80°C)被用来杀死细菌。
2.3。巨噬细胞感染
巨噬细胞感染进行使用金黄色葡萄球菌和大肠杆菌如前所述(7]。未指明的吞噬细胞激活的惰性粒子决心使用乳胶珠子(1.1μm;σ)如前所述7]。吞噬作用分析进行了2小时37°C在感染复数(MOI) 1: 50 (hMDMs)或1:5(原始264.7),导致> 85%的巨噬细胞吞噬至少一个细菌。后,细胞被清洗4次,冰冷的磷酸盐。剩余的被培养在培养基中,细菌nonphagocytosed含庆大霉素(50μg / mL) 24 h。中被替换为新的媒体没有抗生素,和文化是维持所需的时间。细胞治疗相同,但没有细菌,在所有实验分析了控制(mock-infected细胞)。
在接种前抑制剂实验,与细菌或应用控制刺激,巨噬细胞与无毒剂量preincubated 30分钟NF(数据未显示)κB抑制剂湾11 - 7082(厅μ米)。表明,环己酰亚胺(最终浓度10μg / mL)增加了30分钟前感染细菌和出现在媒体,直到细胞被洗30分钟后感染。这种治疗减少了新创翻译由巨噬细胞蛋白质的95.5%35S-Met合并(数据没有显示)。
2.4。可行性分析
后金黄色葡萄球菌吞噬作用和/或治疗化合物诱导细胞凋亡,巨噬细胞生存能力研究了乳酸脱氢酶(LDH)释放。使用CytoTox96 LDH释放试验进行非放射性乳酸脱氢酶细胞毒性试验设备(Promega)。感染和控制hMDMs 24-well或生264.7细胞细胞培养板(细胞每)治疗1μM staurosporine (STS;σ)添加2 h或24 h的刺激器在感染后细胞凋亡。样本培养6小时或24小时,和200年μL培养基被撤销和受到分析如前所述7]。
2.5。Caspase-3活动的分析
caspase-3的活动是由释放7-amino-4-trifluoromethyl-coumarin DEVD-AFC肽底物(亚)。细胞,控制和接触金黄色葡萄球菌有或没有凋亡刺激,通过离心收集(200g 5分钟4°C),用冰冷的PBS洗净,resuspended在100年μL裂解缓冲(50毫米三羟甲基氨基甲烷、液pH值7.5,150毫米氯化钠,NP-40 1%, 0.5%脱氧胆酸和0.1% SDS)。样本然后孵化冰20分钟和受到离心(16000g, 10分钟)。上层清液的蛋白质含量测定用BCA法和半胱天冬酶活动决心通过使用光谱马克斯双子座EM(分子设备)如前所述7]。
2.6。蛋白质分离和免疫印迹
整个细胞提取物控制和刺激细胞准备使用100μNa-deoxycholate L RIPA-lysis缓冲区(0.25%,0.5%诺乃清洁剂p 40, 0.05% SDS,蛋白酶抑制剂鸡尾酒,和2.5毫米EDTA在PBS)和存储−20°C。在300年的关节DBA1老鼠均质μL RIPA-lysis缓冲区。等量的蛋白质(40μg /使用sds - page)分离(12%或16%凝胶取决于感兴趣的蛋白质分子质量),在硝化纤维膜electrotransferred (BioRad)缓冲区由25毫米三、甘氨酸0.2米,和20%甲醇(30 V,一夜之间)。非特异性结合位点被封锁在ttb缓冲3% BSA(20毫米三、0.5 M氯化钠和pH值7.5与0.05%渐变20)1 h,其次是1-2-hour孵化与相关主要抗体:100倍稀释anti-Mcl-1 (Santa Cruz),或3000倍稀释反β肌动蛋白(σ)。膜清洗广泛在ttb缓冲和二次孵化辣根过氧化物酶,(合)共轭抗体,10000倍稀释驴anti-rabbit免疫球蛋白,或20000倍稀释羊anti-mouse免疫球蛋白,包含1% BSA 1 h ttb缓冲区中。膜清洗(分钟)ttb缓冲区,并使用ECL墨迹开发检测(免疫印迹检测试剂;Amersham生物科学)。
2.7。光密度分析
光密度分析西方的屁股使用柯达数码软件进行。结果给出了任意密度测量的平均值单位更正为背景强度或增加的褶皱nonstimulated细胞水平的特点。
2.8。定量PCR(存在)
从培养细胞总RNA提取hMDMs使用aRNeasy迷你包(试剂盒)根据制造商的指示。RNA样本DNase治疗,并使用RevertAidTM互补脱氧核糖核酸是由逆转录合成第一链cDNA工具包(Fermentas)。五百毫微克的RNA从每个样本用于cDNA与低聚糖合成反应(dT)引物根据制造商的指示。定量PCR反应进行一个20 SYBR绿色反应体积的方法μL,包含1μ0.5 L的cDNA样本,μM的底漆,1 x SYBR绿色启动Taq准备混合(σ)。存在正向和反向引物il - 6,MCL1,mcl1管家基因和EF-2基因(用于规范化)表中列出1。5分钟后初始变性在95°C,反应在一定条件下进行了40周期:变性,95°C, 20秒;退火,56°C - 62°C(如表所示1),60秒;扩展,72°C, 60秒;紧随其后的是最后一个伸长步骤10分钟的72°C。所有的反应都是在重复执行。对阈值周期(Ct)值计算和分析使用“δCt”量化方法(11]。经常,质量评估中存在的反应,样本解决nondenaturing 1.5%琼脂糖凝胶和可视化与溴化乙锭染色。
2.9。细胞因子测定
二百年μL细胞培养上清液的收集和储存在−80°C到分析。il - 6的水平是由使用商用ELISA包根据制造商的指示(研发系统)。
2.10。转染与核
沉默的MCL1基因表达是通过转染的细胞与特定的核或消极控制核(Accell智能池和控制池,分别地。热科学Dharmacon)。简而言之,对于每个转染井,核(最终浓度60海里)结合3μL lipofectamine 2000(表达载体)Opti-MEM介质(表达载体)。转染了4 h后24小时的正常细胞生长所需的分析之前进行。
2.11。评价NFκB活动
NFκB活动以EMSA核蛋白质提取的方法。核提取物是由像之前描述的那样miniextraction过程(12]。蛋白质浓度测定用bicinchoninic酸(BCA法),和获得的提取物被冻结(−80°C) 10%的甘油。NF -κB-directed EMSA,双链探针使用一对引物AGCTTCAGAGGGGACTTTCCGAGAGG和AGTCTCCCCTGAAAGGCTCTCCTCGA准备。EMSA像之前描述的那样执行(12]。
2.12。脓毒性关节炎感应和感染的检查
男性DBA1老鼠(8 - 12周)从育种获得人类发育生物学的部门单位,大学,医学院。老鼠热压处理过的食物和水。所有实验动物使用和保健委员会根据指南盖隆大学医学院。给小鼠注射金黄色葡萄球菌尾静脉(200年μ0 L)的一天。的总体条件评估是评估体重和一般的外观。后爪子和脚掌的检查了每隔一天。动物观察每天的关节炎,和临床疾病严重程度得分为每个爪子在0 - 4,该指数是分数的总和为所有四个爪子。评分标准如下:0:没有证据表明红斑和水肿;1:轻度红斑和肿胀的手腕或脚踝;2:温和的红斑和肿胀从手腕到掌骨关节或从脚踝到跖骨的关节;3:严重的红斑和水肿的整个爪子包括数字;4:最大红斑和肿胀的爪子。的细菌负荷关节、肾脏和脾脏检查时牺牲(8天皮)。 The organ homogenates were plated on tryptic soy agar and CFU counted after overnight incubation at 37°C.
2.13。统计数据
结果分析了使用非参数学生的统计学意义以及。差异被认为是重要的时候。
3所示。结果
3.1。金黄色葡萄球菌特别是诱发mcl1人类巨噬细胞表达
我们之前显示,金黄色葡萄球菌可以通过upregulation防止感染巨噬细胞凋亡的凋亡基因的表达(7]。在这些基因中,MCL1在巨噬细胞生存方面起着关键的作用[13,14]。在这里,我们调查的潜在机制mcl1的监管,以及它在cytoprotection诱导中的作用金黄色葡萄球菌。mcl1感应回应吞噬作用不同的细菌和颗粒被孵化研究巨噬细胞金黄色葡萄球菌,大肠杆菌,8小时或乳胶珠子。金黄色葡萄球菌诱导mcl1水平最高,约5次(倍以上的控制水平)比在mock-infected细胞(图1(一))。相比之下,mcl1水平没有变化观察孵化后乳胶珠(),只有轻微的后加速大肠杆菌()(图1(一))。增强mcl1生产响应金黄色葡萄球菌是成正比的感染率(图1 (b)),并施加只有可行的细菌细胞(图1 (c))。后者显然是明显的从一个比较的相对水平MCL1信使rna诱导的反应或死亡的细菌生活在巨噬细胞来源于不同的献血者(8.87和2.75,4.36和2.35,2.24和0.4,分别地)。一个有趣的特点金黄色葡萄球菌全身mcl1表达式或者拼接的合成MCL1基因产物(mcl1proapoptotic同种型),观察早期感染后(图在mRNA水平1 (d))。然而,值得注意的是,的表达mcl1在低得多的水平比长篇,凋亡MCL1表单(图1 (d))。
(一)
(b)
(c)
(d)
综上所述,这些研究结果表明,刺激巨噬细胞是优先mcl1表达的诱导可行金黄色葡萄球菌。
3.2。金黄色葡萄球菌影响mcl1合成和流动率
关联金黄色葡萄球菌全身cytoprotection的表达MCL1,我们确定时间后依赖特定的信使rna诱导的巨噬细胞与细菌的挑战。4倍增长MCL1信使rna观察1 h感染后,持续upregulation观察6小时(图2(一个))。在蛋白质水平,mcl1水平显著增加2 h感染后,达到最大8 h,保持在三倍高水平相比mock-infected细胞至少20 h(数字2 (b)和2 (c))。
(一)
(b)
(c)
(d)
由于观察mcl1的高水平的表达金黄色葡萄球菌来华的巨噬细胞可能的结果新创合成或降低流失率,我们比较mcl1巨噬细胞对放线菌酮缺乏稳定和存在金黄色葡萄球菌。如图2 (d)在mock-infected细胞,阻断新创生物合成导致细胞mcl1水平迅速下降。相比之下,在感染细胞金黄色葡萄球菌,mcl1水平明显高于(图2 (d))。日积月累,这些结果显示的双重性质的影响金黄色葡萄球菌在mcl1涉及mcl1增加蛋白质合成以及增加蛋白质的稳定性。
3.3。mcl1表达式与发病率和严重程度金黄色葡萄球菌全身的关节炎
金黄色葡萄球菌是大约60%的病原体nongonococcal细菌性关节炎病例,健壮的疾病特征等大量巨噬细胞和维持关节激活(15,16]。因此,我们决定mcl1表达式在发炎的关节先前建立的小鼠模型金黄色葡萄球菌关节炎(17]。为此DBA1老鼠注射输液CFU一剂导致低死亡率(见补充图1 (a)在网上补充材料http://dx.doi.org/10.1155/2013/427021)。在注射后第8天所有的动物显示清晰的关节炎的症状(补充图1 (b))。细菌检查关节、脾脏和肾脏揭示了丰富的负载金黄色葡萄球菌在100%的小鼠(补充图1 (c))。这一发现与炎症反应通过il - 6分泌(补充图1 (d))和脾肿大(数据没有显示)。进一步的调查之间的关系和临床细菌学的关节炎和关节mcl1表达式的迹象显示重大协会(数字3(一个)和3 (b))。我们发现mcl1表达显著调节金黄色葡萄球菌艾滋病患者的关节(倍以上的控制水平)与未感染组织(倍以上的控制水平,)。此外,我们还观察到积极联系mcl1表达水平和细菌在关节负荷。这表明金黄色葡萄球菌诱导mcl1表达式也在活的有机体内在炎症组织。
(一)
(b)
3.4。Downregulation mcl1的干扰金黄色葡萄球菌全身Cytoprotection
正如我们前面描述的金黄色葡萄球菌人类和小鼠保护感染巨噬细胞,对诱导细胞死亡(7]。因此,进一步确定是否感染巨噬细胞的生存,以应对proapoptotic兴奋剂依赖于mcl1合成、RNA干扰siRNA用于选择性地沉默MCL1基因的表达。治疗的细胞MCL1特殊核,但不是特异性的控制核,导致特定的mcl1和有效抑制蛋白质含量在24 - 72 h after-transfection(数据未显示)对巨噬细胞生存能力没有影响。感染的巨噬细胞24小时after-transfection已经没有影响了低水平的沉默后24 - 48小时内蛋白质感染(图4(一))。增加caspase-3活动(图4 (b)从巨噬细胞(图)和乳酸脱氢酶漏4 (c))透露,击倒MCL1表达显著减弱金黄色葡萄球菌施加cytoprotection staurosporine-induced细胞死亡的细胞模型。我们的数据也表明沉默的(补充图2)mcl1在金黄色葡萄球菌来华的巨噬细胞部分切除cytoprotection对自发的细胞死亡。这个观察证实,mcl1阻止细胞凋亡中起着重要的作用金黄色葡萄球菌来华的人类巨噬细胞。
(一)
(b)
(c)
3.5。金黄色葡萄球菌端依赖mcl1表达式是由il - 6的分泌
在人类骨髓瘤细胞il - 6上调mcl1 (18]。确定il - 6也起到了一定的作用金黄色葡萄球菌全身mcl1 hMDMs表达式,巨噬细胞被感染金黄色葡萄球菌,什么导致感染后24小时内il - 6分泌(补充图3)。高信使rna和蛋白质mcl1表达式后观察到细菌吞噬作用(数字5(一个)和5 (b)、职责)治疗后明显降低细胞il - 6受体(R)中和抗体。在一起,这些结果表明,金黄色葡萄球菌全身mcl1表达式部分介导的il - 6。
(一)
(b)
3.6。NF的κB通路参与IL-6-Dependent监管mcl1表达引起的金黄色葡萄球菌
各种各样的细胞内信号通路被激活的病原体。其中,NF的激活κB已被证明是关键的cytoprotection感染细胞(19]。此外,金黄色葡萄球菌是一个有效的诱导物NF吗κB活动被EMSA确诊感染巨噬细胞(图4)补充。确定NF的抑制效果κB通路在hMDMs mcl1表达式,巨噬细胞被感染金黄色葡萄球菌其次是孵化6 h与特定的NFκB-inhibitor,然后的水平MCL1评估与治疗感染的细胞。见图6(一),抑制NFκB通路废除了金黄色葡萄球菌全身的增加MCL1基因转录。这种效应被确认在蛋白质水平(图6 (b))。这些结果充分表明,mcl1表达式金黄色葡萄球菌来华的细胞是依赖NFκb因为白介素转录调节NFκB-dependent方式(20.),我们调查了NF的可能性κB刺激MCL1间接表达,通过il - 6。金黄色葡萄球菌全身的生产被感染的巨噬细胞il - 6的废除了治疗湾11 - 7095,NFκB-specific cell-permeable抑制剂,这表明,il - 6生产是绝对依赖NFκB(图6 (c))。总的来说,这些发现表明,IL-6-mediated mcl1表达感染巨噬细胞通过NF监管κB通路。
(一)
(b)
(c)
因为我们证明了金黄色葡萄球菌介导mcl1感应在人类和小鼠模型,因此,在所有进一步的实验我们经常使用hMDMs和/或原始264.7细胞系。
3.7。NFκB和il - 6是必需的金黄色葡萄球菌全身巨噬细胞凋亡的抑制作用
基于这一事实金黄色葡萄球菌延迟细胞凋亡在mcl1 upregulation在被感染的巨噬细胞,我们调查是否NFκB-dependent通路和/或il - 6是必要的金黄色葡萄球菌全身的细胞凋亡的抑制作用。在这个实验中我们使用hMDMs和小鼠巨噬细胞原始264.7细胞系,后者的结果来验证mcl1诱导小鼠关节金黄色葡萄球菌感染。NF预培养的巨噬细胞κB抑制剂(湾11 - 7095)逆转凋亡效应引起的(由caspase-3激活测量)金黄色葡萄球菌在staurosporine-treated细胞(图7(一))。的可行性hMDMs阻断il - 6信号后也被评估。预处理的人类巨噬细胞与IL-6R中和抗体部分废除金黄色葡萄球菌全身的防止细胞死亡所staurosporine,但没有影响cytoprotection对环己酰亚胺- (CHX)介导的细胞死亡(图7 (b))。确定il - 6以自分泌的方式采取行动防止staurosporine引起的细胞死亡,条件媒体金黄色葡萄球菌来华的巨噬细胞含有丰富的il - 6(补充图3)添加到未感染巨噬细胞,治疗的细胞与staurosporine紧随其后。确认后分泌的作用金黄色葡萄球菌感染il - 6在抑制巨噬细胞凋亡受阻使用anti-IL6白介素受体(1的作用μg / mL)抗体。测量caspase-3活动显示显著的影响,尽管低于引起的金黄色葡萄球菌感染,cytoprotection的条件培养基,可部分逆转信号抑制il - 6(图7 (c))。日积月累,这些数据表明,诱导巨噬细胞il - 6生产金黄色葡萄球菌感染是一个重要因素的激活下游的事件导致内在凋亡通路的抑制新创合成mcl1。
(一)
(b)
(c)
4所示。讨论
最近的结果在体外研究表明巨噬细胞感染金黄色葡萄球菌对细胞凋亡(诱导和自发的),这明显cytoprotective效应是重要的upregulation凋亡基因的结果,尤其是那些参与线粒体途径,如MCL1(7]。在这里,我们更详细地研究这一现象,首次展示金黄色葡萄球菌全身的抵抗细胞死亡是高度依赖mcl1表达式从特定的沉默MCL1废除了效果。在这方面,金黄色葡萄球菌显然像结核分枝杆菌或呼吸道合胞体病毒(RSV)、知名专性胞内病原体采用类似的策略21,22]。
mcl1是一种短暂的胞质蛋白(半衰期约3 h)注定要提示的蛋白酶降解[23,24]。这种快速蛋白水解切除mcl1明显放缓金黄色葡萄球菌来华的巨噬细胞。mcl1水平迅速提高细菌感染后2小时内,达到一个最大值6 h,然后仍然可以提高到24小时。除了增强MCL1基因表达(7mcl1水平增加),这在很大程度上是由于mcl1稳定增加。控制细胞相比,相对的mcl1水平感染的细胞被抑制的蛋白质翻译仅略有下降。这是符合的阻力金黄色葡萄球菌环己酰亚胺引起的细胞死亡实验感染巨噬细胞。因此,在巨噬细胞后细胞凋亡抑制金黄色葡萄球菌感染涉及增强MCL1在感染细胞转录和mcl1的漫长的一生。这突显出凋亡mcl1的重要作用金黄色葡萄球菌全身cytoprotection在巨噬细胞和认为劫持mcl1函数对生存至关重要的感染细胞从而促进细胞内的入侵者的生存。
确认在葡萄球菌感染得到mcl1角色学习金黄色葡萄球菌全身脓毒性关节炎。我们的数据明显显示增强mcl1表达关节感染。这表明,也体内金黄色葡萄球菌收益率cytoprotection感染细胞建立一个安全的避风港抗菌力不受攻击的免疫系统。考虑到大多数cartilage-synovium结滑膜细胞,巨噬细胞参与破坏过程,受感染吞噬细胞的长期life-spam可能直接与脓毒性关节炎病变的严重程度有关。证实了我们的假设是细菌感染/水平传播和mcl1表达腹膜巨噬细胞分离金黄色葡萄球菌来华的老鼠,提高巨噬细胞相比,另外受感染动物暴露于NFκB或il - 6信号抑制剂(数据未显示)。
il - 6脓毒性关节炎的发病机制中起着重要的作用促进滑膜炎,体现趋化因子和粘附分子的刺激和炎症细胞的浸润,如巨噬细胞和淋巴细胞。il - 6也已证明是必不可少的促进巨噬细胞的积累(mcl1表达25]。因此,金黄色葡萄球菌全身的il - 6分泌可能是负责mcl1 upregulation在被感染的巨噬细胞。符合这一点,mcl1感应部分由专门阻止IL-6R减毒,这表明一个自分泌il - 6的作用金黄色葡萄球菌全身cytoprotection被感染的巨噬细胞通过增加mcl1的表情。这种效果是由NFκB通路是明显的观察到mcl1抑制NF表达减少κb .然而,应该强调,因为mcl1可以通过几种不同的生存和分化诱导信号,转录和转录后的水平,NF的参与κB和il - 6通路在此过程中是一个非常复杂的调控网络的一部分。
宿主和病原体之间的相互作用取决于采用的策略阻止病原体宿主免疫力。因此,定义选择特定病原体的防御机制,或者相反,精确的病原体毒力的策略是一个关键的一步预测感染的结果。这里描述和以前的报告(7)持续mcl1表达式和cytoprotection巨噬细胞金黄色葡萄球菌这种细菌感染后似乎是特定的,因为吞没的革兰氏阴性细菌或乳胶珠子产生微不足道的影响。这样的高度特定的激活mcl1表达可能是有益的主机或有利的金黄色葡萄球菌。病原体在保护细胞内环境中持久性或复制和传播感染的细胞被Fas-mediated凋亡之前强烈主张后者的选择。采用类似的策略结核分枝杆菌,每一个细胞内病原体,雇佣了一个策略,即细胞内复制是延长mcl1 upregulation和抑制细胞凋亡,因此促进慢性持久性(22]。已经记录了相反的方式行动链球菌引起的肺炎最初感染,增强巨噬细胞的生存能力允许专业吞噬细胞清除感染(26]。
因此,基于提出的数据我们提出细胞内的场景金黄色葡萄球菌使巨噬细胞抗凋亡从而使用这些移动细胞作为特洛伊木马传播。后续研究旨在明确验证这种吸引力的假设在我们实验室正在进行中。
5。结论
总之,我们的工作描述mcl1感应机制及其关键的作用金黄色葡萄球菌介导cytoprotection被感染的巨噬细胞。此外,mcl1的upregulation在活的有机体内表明,观察到的现象在葡萄球菌感染过程中扮演了一个角色。
确认
本研究由JK批准号N N301 050439从波兰科学和高等教育。学院生物化学、生物物理学和生物技术的大学是欧盟结构基金的受益者(批准号POIG.02.01.00-12-064/08:“分子生物技术对健康”)。投资者没有参与研究设计、数据收集和分析,决定发表或论文的准备。
补充材料
补充图1。临床和细菌学的检查金黄色葡萄球菌诱发脓毒性关节炎。
补充图2。增加易感性自发的细胞死亡MCL1可拆卸的巨噬细胞感染金黄色葡萄球菌。
补充图3。il - 6分泌引起的金黄色葡萄球菌在hMDMs。
补充图4。NFκB活动引起的金黄色葡萄球菌在hMDMs。