文摘
Interleukin-23 /辅助17 (IL-23 / Th17)通路中发挥着关键作用在炎症性肠病(IBD)的发病机制,但对其表达中国人所知甚少。在这项研究中,我们调查了信使rna和蛋白质水平的IL-12p40,肿瘤坏死因子以细胞因子1 (TL1A), Janus激酶2 (JAK2), IL-23R中国IBD患者局部和全身。我们的结果显示,在mRNA水平IL-12p40和TL1A增加在溃疡性结肠炎(UC)患者。此外,血清IL-12p40和TL1A水平更高的活跃UC患者,特别是在患者疾病过程小于1.25年或初始发病。之间不存在相关性的基因型和血清IL-12p40或TL1A UC患者。此外,mRNA和蛋白表达的JAK2和IL-23R增加溃疡性结肠炎和克罗恩病(CD)的病人。综上所述,我们的研究结果提供的证据表明,IL-23 / Th17通路基因可能代表的重要生物标志物IBD的活跃阶段,作为炎症性肠病的新药在中国人口。
1。介绍
炎症性肠病(IBD)是一种慢性,复发胃肠道发炎的疾病包括溃疡性结肠炎(UC)和克罗恩病(CD)。炎症性肠病是由复杂的相互作用的遗传,免疫调节因子,肠道微生物群,和环境因素。其中,遗传易感性IBD已经证明是一个关键因素的传统流行病学研究(1]。全基因组协会(GWA)研究发现某些炎症性肠病易感基因在interleukin-23 /辅助17 (IL-23 / Th17)通路,如IL-12B IL-23R, Janus激酶2基因(JAK2),信号传感器和转录激活3 (STAT3)和肿瘤坏死因子(配体)总科成员15 (TNFSF15) [2- - - - - -5]。
到目前为止,人们很少知道IL-23 / Th17途径在中国炎症性肠病病人,很多研究表明,基因突变,使炎症性肠病似乎不同地理和种族6,7]。因此,我们之前研究了26个snp的加州大学的分布和18 IL-23 / Th17通路中的CD基因的单核苷酸多态性在中国炎症性肠病病人,发现IL-12B的多态性,IL23R, JAK2和TNFSF15与中国IBD患者密切相关。说明IL-23 / Th17通路是肠道内稳态的关键调节器和促炎反应在微生物感染的防御8- - - - - -10]。IL-12B编码IL-12p40单元共享的il - 12和IL-23细胞因子基因水平(11]。功能,促炎细胞因子il - 12和IL-23扮演关键角色在弥合先天和适应性免疫系统在炎症性肠病,虽然IL-23R可能发挥更重要的作用比IL-12/23p40 IBD的遗传易感性8,12,13]。
IL-23和IL-23受体的相互作用复杂激活JAK2 / STAT3信号通路,最终导致各种下游免疫反应。最近,JAK2演示与加州大学和CD的风险增加有关在英国的一个大型研究[14]。与此同时,第一个GWA研究提供的证据表明,变异在TNFSF15导致CD和加州大学在欧洲人口(15]。此外,细胞因子,肿瘤坏死因子以细胞因子1 (TL1A),由TNFSF15编码,参与IBD发病机制(16]。越来越多的证据表明,IL-23R snp可能导致39-untranslated地区的一个变体IL-23R mRNA和影响其应对anti-TNF疗法在加州大学(17,18]。这单核苷酸多态性(snp)与炎症性肠病可能解释为影响基因功能和/或表达导致失调的肠道炎症。
总体而言,我们实验室插图IL-23 / Th17通路基因的多态性,而表型功能和潜在genotype-phenotype交互在中国IBD患者主要是未知的。我们调查IL-12B的mRNA和蛋白表达,TNFSF15, JAK2, IL23R本地(肠道粘膜)和系统(外周血)在中国IBD患者提供一种揭示洞察他们在IBD发病机制中的作用。
2。材料和方法
2.1。主题
在这项研究中,118 UC患者和30例乳糜泻患者研究,以前IL-23组/ Th17基因多态性(表1)。诊断是基于传统的临床、放射学、内镜和组织学标准。结肠疾病的程度取决于内窥镜检查和报告根据蒙特利尔分类(19]。疾病活动被爱人和威特评估活动指数在UC患者(20.),而CD患者由克罗恩病活动指数(CDAI) [15]。比较是93年由健康对照组同时患有传染性结肠炎、缺血性结肠炎、肠结核、自身免疫性疾病被排除在外。本研究通过武汉大学中南医院的伦理委员会。
2.2。定量实时聚合酶链反应分析
信使rna表达分析,肠道粘膜活检获得31 UC患者结肠镜检查调查期间,30 CD患者和28健康对照组。实时PCR进行实时PCR设备(豆类、志贺、日本)和放大LightCycler仪器(BioRad、大力神、钙、美国)。反应条件的初始变性30年代在95°C,紧随其后的是40周期95°C的变性5秒和退火54°C (IL-12B), 58°C (TL1A), 55°C (JAK2),或56°C (IL-23R) 40秒。所有样品都是一式三份处理。相对单位计算的方法(21]。引物组用于PCR扩增(表所示2)。
2.3。通过ELISA检测可溶性IL-12p40和TL1A
血液收集从118年UC患者和93名健康对照血清中分隔符管,和血清分离,整除,储存在−80°C。血清IL-12B (Mabtech,斯德哥尔摩,瑞典)和TL1A(美国纽约恩佐,法明岱尔)水平的UC患者和健康对照组测定,酶联免疫吸附试验(ELISA),根据制造商的协议。
2.4。免疫印迹
蛋白质提取从结肠组织我们用于定量PCR上面提到的。蛋白质样本10% sds - page凝胶电泳分离和转移到聚偏二氟乙烯膜(美国微孔,Billerica的),然后用初级抗体免疫印迹:人类JAK2(细胞信号技术,贝弗利,妈,美国),人类IL-23R(美国微孔,Billerica的)β肌动蛋白(细胞信号技术,贝弗利,妈,美国),分别。这些墨迹是由增强化学发光(ECL)免疫印迹基质(皮尔斯,罗克福德,伊利诺斯州,美国)和使用ECL成像系统(融合FX7 Vilber Lourmat, Torcy,法国)。乐队强度是决定使用一个软件数量(Bio-Rad、大力神、钙、美国)。
2.5。免疫组织化学染色
在结肠组织石蜡包埋,切片,免疫组织化学分析根据描述的方法。简单地说,山羊多克隆抗体反JAK2和IL-23R被用作主要的抗体。相应领域的部分被标记和大功率领域数在200 x放大。
2.6。统计分析
由于个人高度倾斜分布,比较值之间的所有日期IBD子组和控制是由Mann-WhitneyU测试(2组相比)或克鲁斯卡尔-沃利斯检验(超过2组相比)。所有的数据进行了分析与统计产品和服务解决方案的视力17.0 (SPSS,芝加哥,伊利诺斯州,美国)。被认为具有统计显著性结果只有值小于0.05。
3所示。结果
3.1。IL-12p40和TL1A mRNA水平调节在UC患者的肠黏膜发炎
以前,我们发现IL-12B和TNFSF15基因多态性与加州大学在中国患者中,清楚地表明这两个基因参与了人类对UC的易感性。
进一步了解他们的生物功能,在这里我们比较样本之间的相对IL-12p40和TL1A mRNA表达获得了加州大学的胃镜检查患者和健康对照组。IL-12p40成绩单在结肠粘膜的相对水平明显不同加州大学和健康对照组(平均数±标准差:与、职责;;参见图1(一))。IL-12p40相比,我们还观察到一个明显区别加州大学和健康对照组TL1A表达式(加州大学:健康对照组:;;参见图1 (b))。
(一)
(b)
(c)
(d)
3.2。血清IL-12B UC患者和TL1A水平增加
因为我们的组织数据明显显示的地方增加IL-12p40 TL1A,然后将他们的血清浓度在加州大学个人和系统性的健康对照组水平。我们发现血清IL-12p40水平升高在UC患者比健康对照组(255.59、68.16 - -4756.60和164.43,0.1 - -986.43 pg / mL;;95%可信区间中值;参见图2(一个))和血清TL1A浓度也增加了UC患者(354.24,172.78 -7113.24 pg / mL)与健康对照组(218.95,0 - 2032.06 pg / mL,;参见图2 (b))。
(一)
(b)
据我们所知,此前的研究表明,genotype-phenotype协会在炎症性肠病发挥了重要的作用,所以我们怀疑,是否增加血清IL-12p40 genotype-phenotype协会和TL1A水平是由于血清浓度应在不同的基因型不同。我们调查的影响分布rs6887695或rs4263839 SNP IL-12p40和TL1A UC患者的血清,分别。有71 118 UC患者的基因等位基因C和87 rs6887695 UC患者的基因等位基因118 G,而82 118 UC患者的基因等位基因和84年118 UC患者的基因等位基因G rs4263839(图3)。结果表明,有三个基因型组之间无统计学差异(;参见图3)。因此,IL-12p40和TL1A表达的差异与他们的基因型。
(一)
(b)
3.3。血清IL-12p40协会和TL1A水平与UC患者的临床特征
然后我们检查是否IL-12p40的浓度和TL1A与UC患者的临床特征。我们分析血清IL-12p40和TL1A水平UC患者按性别分层后,年龄、病程、吸烟习惯,家族史,extraintestinal表现,位置,行为,和治疗疾病(表3)。我们的结果表明,疾病特点并没有发现血清IL-12p40协会或TL1A (),包括性别、年龄、吸烟习惯,和家庭的历史。血清TL1A水平更高的UC患者没有extraintestinal表现(),它表现出血清IL-12p40水平无显著差别。
UC患者,血清IL-12p40和TL1A水平受到疾病的影响,表现出更高的值在UC患者疾病过程小于1.25年(IL-12p40,;TL1A,)。比较在UC患者的血清IL-12p40和TL1A水平不同的疾病行为表现出显著差异(IL-12p40,;TL1A,),这比那些高初始发病患者慢性复发或慢性持续的炎症性肠病。此外,血清IL-12p40和TL1A水平高活动性疾病与不活跃的疾病(IL-12p40,;TL1A,)。疾病之间没有协会成立位置、治疗和血清IL-12p40 TL1A水平。
3.4。JAK2和IL-23R mRNA IBD患者中高度表达
至于mRNA,不同级别的JAK2观察在加州大学,CD和健康对照组(与与、职责;;参见图1 (c))。与此同时,相对平均IL-23R mRNA的表达在UC患者和在CD患者与健康对照组相比显著升高(;;参见图1 (d))。
3.5。JAK2的蛋白表达和IL-23R IBD患者明显升高
确认JAK2和IL-23R的表达,免疫印迹和免疫组织化学分析进行肠道粘膜活检的31个加州大学,30 CD, 28日健康对照组使用主要抗体识别的生物活性形式JAK2和IL-23R。JAK2的显著增加和IL-23R被发现在加州大学和CD与健康对照组相比,结肠组织(图4)。
(一)
(b)
4所示。讨论
我们的研究发现了异常IL-23 / Th17途径表达水平在IBD患者局部和全身。结果表明,UC患者有更高的mRNA和血清水平IL-12B TL1A,而JAK2和IL-23R水平更高的加州大学和CD患者。此外,genotype-phenotype分析表明,之间没有显著相关的血清水平和不同基因型群体IL-12B或TL1A UC患者。尽管如此,一些协会之间被发现血清IL-12p40和TL1A extraintestinal表现,疾病,和加州大学的行为在我们的研究中。
最近的研究表明,基因多态性在IBD相关基因表达和功能,表明遗传变异可以调节个体易受炎症性肠病(22- - - - - -25]。我们的未发表的数据发现,IL-12B IL-23R, JAK2和TNFSF15基因多态性在中国人口与炎症性肠病密切相关。在这项研究中我们首先证明了他们在IBD水平升高,然后调查是否遗传多态性可能影响IL-23 / Th17通路基因的表达导致中国IBD患者不同的临床特征。
因为我们发现IL-12B多态性参与人类对加州大学在中国的人口,我们观察到的信使rna和蛋白质水平显著增加IL-12p40粘膜活检和UC患者的血清。目前,有有限的数据在中国人口IL-12B的表型效应。然而,最近的研究表明,IL-12p40为可能有更高的亲和力IL-23比白介素受体,受体和IL-12p40交付改善硫酸葡聚糖sodium-induced结肠炎通过抑制IL-17A生产和肠粘膜炎症26]。此外,IL-12p40能够分泌抑制IL-23-mediated免疫反应(22]。因此,它表明IL-12p40可能成为另一个新目标。
我们的未发表的结果发现,苏格兰民族党rs6887695 IL-12B与UC发病机制有关。从genotype-phenotype互动的角度来看,我们的研究结果表明,rs6887695 SNP多态性可能无法完全影响IL-12p40血清水平,这表明这些基因遗传多态性位于没有彻底解释疾病表型或IBD发病机制的变化。此外,我们评估了血清IL-12p40之间可能的关系水平和UC患者的临床特征。我们的研究结果表明,血清IL-12p40级别的海拔只有受到疾病的影响过程和行为暗示活跃UC较短的课程或首次发病患者血清IL-12p40的高表达。类似的结果也观察到在自身免疫性关节炎的发病阶段27,28]。我们的研究结果表明,IL-12p40可能作为分子标记来表示活动性疾病的早发性UC患者和治疗IL-12p40可以延缓和减少加州大学发生严重性。
TL1A,代表死亡域受体的配体3 (DR3),参与临床与实验肠道炎症(16,29日]。TL1A Th17诱导免疫反应与IL-23合作在CD发病机理30.]。最近的研究报道,可溶性TL1A水平增加在加州大学(31日,32]。在此,我们证实了这些发现显示可溶性TL1A水平增加的加州大学以及粘膜TL1A mRNA的表达。它是第一个证明TL1A mRNA和蛋白表达水平在中国UC患者增加。
我们的研究结果暗示TNFSF15 rs4263839 SNP多态性,在我们之前与UC患者相关数据,可能无法完全影响血清TL1A水平。然后我们评估的可能关系血清TL1A水平与UC患者的临床特征。IL-12p40等之间存在着显著相关血清TL1A水平和课程或疾病的行为。诱饵受体的多态性3 (DcR3),另一个TL1A受体,也与儿童发病相关的加州大学(33]。我们的研究结果也显示,血清TL1A水平可以作为一个风险因素活跃UC患者的发病阶段。IL-12p40不同,我们发现血清TL1A水平更高的UC患者没有extraintestinal表现,大概是因为患者的群体是有限的和/或血清TL1A水平可能会影响到UC患者分布。
正如我们所知,IL-23 IL-23R激活JAK2 / STAT3诱导Th17细胞分化和这个途径导致了IBD发病机制8- - - - - -10]。各种研究划定JAK2对调节肠道炎症的影响(14,34,35]。我们的未发表的结果发现多态性IL-23R和JAK2与加州大学和CD,所以我们进一步证明了信使rna和蛋白质水平的IL-23R和JAK2增加肠黏膜炎症性肠病的患者。同样,也称IL-23R-positive细胞显著增加在NK细胞和一些种类的T细胞在炎症性肠病病人JAK2 mRNA表达调节在CD患者(36,37]。
最后,除了IL-12p40, TL1A、IL-23R JAK2本研究中提到的,IL-23 / Th17通路细胞因子在炎症性肠病还包括IL-23p19, STAT3, IL-17, il - 22生成2,3]。我们的未发表的研究并没有发现他们的多态性在中国人口与炎症性肠病有关。然而,据报道,Th17细胞可能负责有害的影响通过IL-17表达和/或有利影响il - 22生成生产,这意味着这些细胞因子在炎症性肠病发挥着潜在的作用[38,39]。此外,IL-17可以激活基质、内皮和上皮细胞产生细胞因子和趋化因子,这不仅有助于中性粒细胞招募到组织,但也由巨噬细胞诱导炎性细胞因子的生产(40]。因此,进一步的调查IL-23 / Th17细胞因子的机制仍然是需要的。
5。结论
综上所述,我们的数据是第一个全面发现评估IL-23 / Th17通路之间的关系和炎症性肠病在中国人口。我们发现IL-23 / Th17通路基因的表达在IBD患者局部和全身升高。此外,我们表明,血清IL-12p40和TL1A水平不相关的基因多态性,但高度表示在发病早期和UC患者的积极条件。在一起,IL-23 / Th17通路基因可能代表活跃在中国IBD患者炎症的重要生物标志物,他们新的潜在治疗IBD的目标。
利益冲突
所有作者声明没有利益冲突。
确认
作者感谢所有那些参与这项研究。这项工作是由中国国家自然科学基金(没有。81070280)和中国中部大学的基础研究基金(201130302020004和201130302020004号)。