文摘

Isoliquiritigenin (ISL),一个简单的chalcone-type类黄酮素,是从甘草化合物,主要存在于食品、饮料和烟草。活性氧(ROS)是一个关键因素参与调节心脏压力响应信号在缺血和再灌注。我们假设ISL作为天然抗氧化剂可以保护心脏免受缺血性损伤通过调节细胞氧化还原状态和调节心血管信号通路。荧光探针H₂DCFDA是用来测量细胞内ROS水平。葡萄糖吸收由2-deoxy-D-glucose——决定³H积累。IonOptix系统测量分离心肌细胞的收缩功能。结果表明,ISL治疗显著改善心肌细胞收缩功能障碍引起的缺氧。ISL明显心血管信号刺激,活化蛋白激酶(AMPK)和细胞外signal-regulated激酶(ERK)信号通路。ROS的荧光探针H₂DCFDA测定表明,ISL显著降低心脏ROS水平在缺氧/复氧。此外,ISL减少线粒体潜力()的孤立的老鼠心肌细胞。综上所述,ISL作为一种天然抗氧化剂对缺血性损伤的心脏保护证明可能属性的激活AMPK和ERK信号通路和细胞氧化还原平衡状态。

1。介绍

心肌梗死是死亡的主要原因之一。尽管恢复血流的唯一方法挽救坏死的心肌,reperfusion-induced受伤的背景高死亡率(1]。大量研究表明,心肌缺血再灌注(I / R)损伤与增加活性氧簇(ROS)的产生。ROS可能导致抑郁的收缩功能,心律失常,内源性抗氧化剂网络损耗,和膜透性的变化(2]。有证据表明,活化蛋白激酶(AMPK)信号通路参与心脏氧化还原调控(3- - - - - -6]。我们的实验室和其他提供了明确的证据表明,AMPK在保护中扮演着一个关键的角色在心脏缺血/再灌注损伤(7- - - - - -14]。

Isoliquiritigenin (ISL),一个简单的chalcone-type类黄酮素,是从甘草化合物,和出现在食品,饮料和烟草15]。据报道具有广泛的生理和药理作用,包括抗氧化活动(16),抗血小板聚集作用[17,18),抗肿瘤的活动(19)和雌激素的属性(20.]。据报道,预处理和ISL reperfusion-induced心律失常的严重程度明显减少心肌梗塞大小和减少乳酸脱氢酶(LDH)和肌酸酐的活动磷酸激酶(CPK) [18]。JAK2 / STAT3磷酸化的心增加了ISL似乎ISL的机制保护心脏免受缺血和再灌注损伤18]。进一步描述ISL的心血管效应心肌细胞在低氧的压力,我们分离小鼠心肌细胞调查ISL的影响在缺氧/复氧心肌细胞收缩功能和心肌细胞介导ISL行动的信号机制。

2。材料和方法

2.1。药物和化学物质

Isoliquiritigenin (ISL)购买的σ(密苏里州圣路易斯(计划1)。ISL是溶解在二甲亚砜(DMSO)产生一个股票解决10更易与L,最后和DMSO浓度小于0.01% (v: v)。其他化学试剂均为分析纯。

2.2。动物和细胞系

8-12-week-old男性FVB /新泽西老鼠从杰克逊实验室购买(美国我巴尔港)。所有动物都保存在纽约州立大学制度动物设施(纽约州立大学)在水牛和美联储随意。本研究中使用的所有动物程序批准的机构动物保健和使用委员会在纽约州立大学纽约州立大学布法罗分校。

2.3。隔离小鼠心肌细胞

心肌细胞是具有孤立如前所述[21]。短暂,成年小鼠的心被灌注和氧合(5%股份有限公司₂/ 95%啊₂)Krebs-Henseleit碳酸氢盐(港口)缓冲区包含(118毫米)氯化钠,氯化钾4.7,1.25 CaCl₂1.2 MgSO₄1.2 KH₂阿宝₄25 NaHCO₃11.1,10玫瑰,葡萄糖。所有的化学品都购自σ(圣路易斯,密苏里州,美国)。心被灌注Ca^{2 +}无加工制造包含Liberase Blendzyme 4(罗氏公司公司,印第安纳波利斯,在美国15 - 20分钟。灌注后,左心室心肌细胞被移除和切碎的驱散在Ca^{2 +}无港口设立缓冲区。细胞外钙^{2 +}逐步增加了1.25毫米。只有杆状细胞和清晰的边缘被选为药理测试和细胞收缩性的研究。ISL的心肌细胞治疗(50,100μM) AMPK信号、ROS水平、线粒体膜电位,和葡萄糖吸收测量。

2.4。缺氧的治疗

孤立的老鼠心肌细胞受到两组(正常和缺氧组)。低氧组保持在37°C在湿润湿润下密封室的气氛中5%的有限公司₂和95% N₂20分钟。正常组置于一个水套孵化器在同期37°C。

2.5。心肌细胞缩短/ Relengthening测量

心室细胞的力学性能评估使用SoftEdge MyoCam系统(IonOptix公司、弥尔顿、马、美国)(22]。总之,左心室细胞被置于室安装在倒置显微镜的阶段(奥林巴斯,ix - 70,中心山谷,PA,美国)和孵化与缓冲区包含25°C (mM): 131氯化钠,氯化钾,1 CaCl₂1 MgCl₂,10葡萄糖,和10个玫瑰,在pH值7.4。这些细胞被刺激阈上的电压在0.5赫兹的频率,3毫秒。持续时间,使用一对白金电线放置在两端的室和连接到一个电刺激器(美国FHC公司,不伦瑞克)。细胞的研究显示在电脑显示器使用IonOptix MyoCam相机。一个IonOptix SoftEdge软件被用来捕获细胞长度缩短和relengthening期间的变化。细胞缩短和relengthening评估使用以下指标:缩短(PS),峰值振幅对电刺激细胞缩短,表明高峰心室收缩性;time-to-PS (TPS),肌细胞的持续时间缩短,收缩持续时间的象征;时间- 90% relengthening (TR90) relengthening持续时间达到90%,舒张期持续时间的象征(90%,而100% relengthening被用来避免噪声信号基线浓度);和最大速度缩短/ relengthening最大斜率(导数)的缩短和relengthening阶段,表明最大速度的增加/减少心室压力。在改变的情况下刺激频率、稳态细胞收缩达到之前(通常是第一个5 - 6次)后PS幅值被记录。

2.6。细胞内钙^{2 +}瞬态测量

分离心肌细胞含有fura-2 / (0.5μ为15分钟),荧光测量记录dual-excitation荧光光电倍增管系统(IonOptix)。细胞被放置在一个奥林巴斯ix - 70倒置显微镜和成像通过萤石(圣路易斯,密苏里州,美国)石油的目标。细胞暴露在75 W灯发出的光,通过360或380纳米过滤器,而被刺激合同0.5赫兹。荧光排放检测到480至520海里的光电倍增管后第一次照亮细胞360海里,持续0.5秒。然后在380 nm录音协议期间(333 Hz采样率)。360海里激发扫描重复了最终协议,和定性胞内钙的变化^{2 +}浓度是推断fura-2比率的两个波长的荧光强度(360/380)。荧光衰减时间测量细胞内的一个迹象^{2 +}清算率。单和biexponential曲线拟合方程应用于细胞内钙计算^{2 +}衰减常数(21]。

2.7。测定活性氧(ROS)

如前所述(发现了活性氧23,24]。简单地说,5 - (6)-chloromethyl-2′, 7′二乙酸-dichlorodihydrofluorescein (CM-H₂DCFDA分子探针,尤金,或者美国)是一个cell-permeant指标ROS醋酸nonfluorescent直到切除组的细胞内酯酶,和细胞内的氧化发生。它是细胞deesterified和变成高度氧化荧光光纤。分离心肌细胞是悬浮在HEPES-saline缓冲和预培养10μM H₂在37°C DCFDA在黑暗中30分钟。细胞被洗两次后,荧光强度在激发波长485 nm和发射波长530 nm的荧光板读者(微型板块荧光计、光谱GEMINIXS、分子设备,美国)。包含ISL的井,但不是H₂DCFDA,被用作空白。ROS的产生表示为相对于未经处理的控制细胞的荧光强度。

2.8。线粒体膜电位评估()

的用5、5′6 6′-Tetrachloro-1, 1′, 3、3′-tetraethylbenzimidazolocarbocyanine碘(JC-1,σ,圣路易斯,密苏里州,美国)。短暂,JC-1带正电的荧光化合物是由线粒体比例内线粒体膜电位(25]。当超过临界浓度时,JC-1单体形式J-aggregates并成为荧光红色,改变化合物的荧光特性。因此,红色(J-aggregate)绿色的比率(单体的JC-1)排放成正比的线粒体膜电位。分离心肌细胞是悬浮在HEPES-saline缓冲和预培养10μM JC-1 10分钟37°C。细胞被洗两次后,每个样本在荧光激发波长490 nm和发射波长530 nm和590 nm的荧光板读者(微型板块荧光计、光谱GEMINIXS、分子设备,美国)。导致荧光强度表示为590 530海里排放比例。

2.9。免疫印迹分析和抗体

如前所述(执行免疫印迹14,24,26]。分离心肌细胞蛋白质被解决通过sds - page和转移到聚乙二烯二氟化物膜(Bio-Rad、大力神、钙、美国)。reprobing,膜被50 mM Tris-HCl, 2% SDS, 0.1米巯基乙醇(pH值6.8)。膜被封锁在TBS (pH值7.4)与5%脱脂牛奶含有0.1% Tween-20 1 h和随后孵化主要抗体(1:1000稀释)一夜之间在4°C。免疫反应性的乐队被发现使用anti-rabbit辣根peroxidase-conjugated二级抗体和可视化使用化学发光底物(ECL)。兔多克隆抗体phospho-AMPK(刺^172年),总AMPKα,phospho-Akt phospho-ACC phospho-ERK(刺^202年/酪氨酸^204年),phospho-p38 MAPK(刺^180年/酪氨酸^182年)、phospho-STAT3和GAPDH是购自细胞信号(丹弗斯、马、美国)。免疫印迹乐队的密度进行了分析使用密度计扫描(模型gs - 800;Bio-Rad)加上Bio-Rad个人电脑分析软件(27- - - - - -29日]。

2.10。葡萄糖的吸收

2-Deoxy-d - [1³H)葡萄糖H9c2细胞中积累了如前所述[30.,31日]。H9c2细胞生长在6-well盘子洗两次与血清DMEM和孵化2毫升相同的介质在37°C 2 h。这些细胞被洗3次,Krebs-Ringer-HEPES (KRH)缓冲和孵化2毫升KRH缓冲在37°C为30分钟。胰岛素(10 nM,σ,圣路易斯,密苏里州)和/或ISL (50, 100μ米)被添加到H9c2。葡萄糖吸收由添加0.1毫升KRH缓冲和2-deoxy-d - [1³H]葡萄糖(0.21 Ci /毫升,通用电气医疗集团,皮斯卡塔韦,新泽西,美国)和5毫米葡萄糖作为最终的浓度。葡萄糖吸收三次被洗细胞终止与冷PBS。一夜之间,细胞被细胞溶解1毫升0.5 M氢氧化钠和SDS 0.1% (w / v)。放射性保留的细胞溶解产物是由闪烁计数器(贝克曼LC 6000 ic)和归一化蛋白质数量测量微BCA蛋白质分析工具包(美国皮尔斯化学,罗克福德,IL)。

2.11。统计分析

对于每一个系列实验,数据均值±SE。统计比较了使用方差分析(方差分析)。差异与被认为是具有统计学意义。

3所示。结果

3.1。ISL改善缺氧引起的心肌细胞收缩功能障碍

确定ISL保护心肌细胞对缺氧损伤,我们调查了心肌细胞收缩时暴露于低氧气氛。心肌细胞收缩的机械性能是在细胞外Ca获得的^{2 +}1.0毫米和刺激0.5赫兹的频率。如图1ISL (100μ米)治疗并不影响静息心肌细胞收缩功能正常或低氧条件下。然而,在缺氧条件下,显示的心肌细胞严重受损的峰值缩短(PS)(图1 (b))和缩短/ relengthening(最大速度降低,)(数据1 (c)和1 (d)),而ISL治疗显著改善心肌细胞的收缩功能障碍反映缩短峰值和最大速度缩短/ relengthening(数据1 (c)和1 (d))。此外,缺氧导致长期time-to-peak缩短(TPS)和时间- 90% relengthening (TR90)心肌细胞(数字1 (e)和1 (f));然而,ISL (100μ米)明显抑制心肌细胞的低氧诱导长期TPS和TR90(数字1 (e)和1 (f))。这些结果表明ISL保护从低氧诱导心肌细胞收缩功能障碍。

3.2。细胞内钙的^{2 +}心肌细胞的性质

探索ISL的潜在机制保护对缺氧心肌细胞收缩缺陷,细胞内Ca^{2 +}体内平衡是评估使用荧光染料fura-2 / AM [32]。结果显示,缺氧引起的静息细胞内Ca的海拔^{2 +}在孤立的心肌细胞(图2(一个))和减少细胞内钙^{2 +}间隙与荧光衰减时间延长(单一和biexponential衰变数据2 (c)和2 (d)normoxia条件下)与心肌细胞。ISL (100μ米)并没有引起任何明显影响细胞内钙休息^{2 +}和荧光衰减时间nonhypoxic条件(数据2(一个)- - - - - -2 (d)),但明显恢复休眠细胞内钙升高^{2 +}细胞内钙水平和减少^{2 +}间隙在孤立的心肌细胞在缺氧条件下(图2)。然而,缺氧并没有改变电刺激细胞内Ca^{2 +}水平(图2 (b))。

3.3。ISL刺激心血管信号通路

我们组和其他人提供的证据表明,活化蛋白激酶(AMPK)是心脏保护中的关键信号对缺血性损伤(7,11- - - - - -13]。定义机制参与ISL的保护作用,AMPK信号通路被发现在孤立ISL治疗的心肌细胞的反应。结果表明,ISL显著AMPK Thr触发^172年磷酸化与汽车集团(图3(一个))。与AMPK活化,AMPK的下游目标,乙酰辅酶a羧化酶的磷酸化(ACC)被ISL诱导治疗(图3 (b))。有趣的是,ISL治疗也诱导细胞外signal-regulated激酶(ERK)信号通路在心肌细胞(图3 (c))。这些数据表明,ISL治疗可以引起的磷酸化α催化亚基在刺^172年AMPK,引发的生存信号ERK激活。

3.4。ISL分离心肌细胞的细胞内ROS水平下降

在再灌注后心肌缺血/缺氧,有一个快速增长的胞内钙诱导的线粒体渗透性转换孔注射(mPTP药物)[33]。解偶联线粒体内的电子传递链会导致破坏性的释放活性氧(ROS) (34]这ROS增加细胞死亡是一个重要的因素在发病再灌注(33]。荧光探针H₂DCFDA被用来衡量ISL的影响细胞内ROS水平在孤立的心肌细胞缺氧/复氧条件下。如图4(一)ROS水平下的心肌细胞缺氧/复氧远远高于汽车normoxia集团(对车辆normoxia)。ISL治疗显著降低的细胞内ROS水平隔离期间心肌细胞缺氧/复氧(对车辆缺氧)。建议ISL证明心脏保护对抗低氧诱导心肌细胞收缩功能障碍通过调节细胞氧化还原状态。

3.5。ISL心肌细胞线粒体膜电位的降低

有证据表明,AMPK信号通路参与调节线粒体膜电位()[35]。理解的机制ISL激活心脏AMPK信号通路,线粒体膜电位(使用JC-1)的心肌细胞进行评估,亲脂性的荧光团形成J-aggregates intramitochondrial浓度成比例。孤立的心肌细胞和10 preincubated 20分钟μM JC-1,彻底冲洗,并相应地处理ISL。图4 (b)代表红/绿色荧光的比例,对应JC-1 J-aggregate与单体的形式。结果表明,ISL治疗显著降低JC-1染料积累和减少J-aggregate心肌细胞线粒体中形成一个独立的方式,这表明ISL线粒体膜去极化引起的。的减少可能导致引起的AMPK ISL的激活。

3.6。ISL刺激葡萄糖摄取的心肌细胞

探索是否ISL-activated心脏AMPK在心肌细胞信号调节葡萄糖代谢,ISL在心肌细胞的葡萄糖吸收的影响研究使用2-deoxy-D-1 -³H-glucose吸收试验(31日]。如图4 (c),ISL显著刺激葡萄糖摄取分离心肌细胞(对车辆)。有趣的是,ISL治疗可以增强心肌细胞(图的insulin-induced葡萄糖吸收4 (c))。

4所示。讨论

活性氧与应激损伤的发病机制,包括心肌缺血/再灌注损伤。ROS生成细胞有助于收缩功能障碍和细胞死亡在模拟缺血/再灌注灌注的心肌细胞模型(2,36]。广泛的研究表明,一些草药提取物或草药的活性成分表现出抗氧化效果(18]。尽管这些研究涉及抗氧化和ISL的心血管效应,ISL的这些行动是否能与它的心肌细胞收缩功能还不是很清楚。在目前的研究中,ISL作为一种天然抗氧化剂并不影响心肌细胞收缩功能正常的条件下。然而,心肌细胞显示严重的收缩功能受损,而ISL的hypoxia-caused收缩功能障碍明显改善心肌细胞。此外,ISL没有引起任何明显影响细胞内钙休息^{2 +}和荧光衰减时间nonhypoxic条件,但它明显升高细胞内钙电刺激^{2 +}水平和细胞内钙升高休息恢复^{2 +}细胞内钙水平和减少^{2 +}在hypoxia-isolated心肌细胞间隙。机械缺陷的解释观察到的在我们的研究中可能受损的细胞内Ca^{2 +}处理。减少细胞内Ca^{2 +}间隙可能负责长期松弛时间(TR90)和PS在缺氧心肌细胞减少。与此同时,缺氧心肌细胞的活性氧水平远远高于正常心肌细胞,这可能导致心肌细胞的收缩功能障碍。心肌细胞暴露于低氧气氛时,ISL治疗显著降低细胞内ROS水平和改善心肌细胞的收缩功能障碍。一般来说,低氧诱导活性氧的生产可能会引起膜脂质过氧化作用和蛋白质变性,打扰^{2 +}运输和线粒体膜电位。因此,ISL的抗氧化活动可以减少细胞内ROS水平和改善Ca^{2 +}运输和线粒体膜电位;所有这些都有助于改善缺氧应激条件下心肌细胞的收缩功能。

目前,活化蛋白激酶(AMPK)途径是显示的信号通路,防止心肌缺血(7,37- - - - - -39]。可以激活AMPK物激酶,ATP耗竭等缺氧(5),缺血(13),和锻炼(40]。激活AMPK可以使磷酸化乙酰辅酶a羧化酶(ACC)抑制其活动参与脂肪酸合成(41]。其他下游AMPK途径包括葡萄糖吸收的影响42,43),糖酵解(44),和脂肪酸氧化45),这有利于ATP生产供应足够的能量细胞生活在压力条件下。AMPK促进葡萄糖运输,保持ATP商店,防止损伤和细胞凋亡在缺血(39]。我们的研究结果表明,ISL刺激AMPK刺^172年磷酸化和激活在孤立的心肌细胞。ISL也大大刺激了AMPK下游效应在心肌细胞葡萄糖摄取。这些数据有力地表明,ISL可能直接引发心脏AMPK信号通路,调节葡萄糖体内平衡保护低氧诱导的心肌细胞损伤。

AMPK有几个直接的分子靶点对心脏也可能与其他stress-signaling通路。

另一方面,ERK激活凋亡在大多数组织(46]。我们的研究结果表明,ISL作为一种天然抗氧化剂触发ERK信号分离心肌细胞,尽管ISL的分子机制激活心脏ERK通路需要在未来的研究特点。

总之,ISL证明心脏保护与收缩功能障碍引起的缺氧/复氧。ISL的心脏保护机制与心血管信号通路的激活和调节细胞内氧化还原状态的心肌细胞。因此,ISL是一个潜在的小分子在未来治疗缺血性心脏病的。在我们先前的研究[10,24,27,38,47),对于临床,可能会带来好处使磷酸化AMPK在缺血性损伤的病人患有急性心肌梗塞。出于这个原因,ISL可以管理前经皮冠状动脉介入(PCI)减少缺血/再灌注损伤。

利益冲突

作者宣称没有利益冲突。

作者的贡献

朱张小雨,平,秀英张同样导致了这项工作。

确认

这项研究是由中国学术委员会和甘肃省自然科学基金(0710 rjza037,没有。张1208 rjza231)小雨,美国心脏协会西班牙0835169 n和12 grnt 0835169霁李,美国糖尿病协会基础科学资助1 - 11 - b - 92 -李记,重大国际(地区)合作研究项目2008 dfa31140和2010 dfa32660朱萍,和广东省自然科学基金10251008002000002 S2011010005836萍朱,和中国科学和技术支持项目2011 bai11b22剑庄。