文摘

肝脏在代谢亢进中起着重要作用,产生急性期蛋白在全身炎症反应综合征和它在宿主防御和细菌是至关重要的。我们以前的研究表明,程序性死亡1 (PD-1)及其配体编程死亡ligand-1 (PD-L1)宿主免疫反应在脓毒症的重要调节器。我们目前的研究目的是探讨PD-L1在sepsis-induced肝损伤小鼠盲肠的结扎和穿刺(CLP)模型。我们的结果表明,有一个显著增加PD-L1表达在CLP后肝脏挑战sham-operated控制相比,在mRNA转录水平和免疫组织化学。Anti-PD-L1抗体明显减轻肝损伤的形态学CLP老鼠。Anti-PD-L1抗体政府降低ALT和AST释放在CLP老鼠,减少肿瘤坏死因子(TNF)的水平α、白介素6 (IL)和IL - 10 mRNA在肝脏脓毒症的挑战。因此,anti-PD-L1抗体可能有治疗潜力衰减在脓毒症肝损伤。

1。介绍

脓毒症仍然是一项重大的临床挑战在重症监护病房(ICU),表现为全身炎症反应和多器官功能衰竭(1]。肝脏被认为是第二个器官影响败血症和肝脏功能障碍已经知道经常发生在脓毒症的情况下(2,3]。然而,sepsis-induced肝损伤,脓毒症的链接部分,一直忽略了重症监护医生(4]。

已经证明,与脓毒症相关的高发病率和死亡率可能会造成免疫抑制受损的病原体引起的间隙感染后(5- - - - - -7]。接受,肝脏在代谢亢进中起着重要作用,产生急性期蛋白在全身炎症反应综合征(8]。肝代谢发生变化,他们可能是至关重要的细菌在宿主防御和间隙(9]。相比之下,炎性细胞因子释放的过程中脓毒症也可能影响肝细胞的代谢途径(10]。研究旨在探讨脓毒症的潜在机制和潜在的治疗方法及相关器官的损伤是必要的。

程序性死亡1 (PD-1)是一种新发现的coinhibitory受体已被证明是一个重要的调制器的免疫反应11,12]。PD-1主要表达在细胞表面活化的CD4和CD8 TCELS。PD-L1 (B7-H1)和PD-L2 (B7-DC) PD-1的两个主要的配体。PD-L1广泛表达于造血和nonhematopoietic细胞,包括T细胞、B细胞、树突状细胞(dc)、巨噬细胞、内皮细胞、上皮细胞、胰岛细胞,成纤维细胞的网状细胞(12]。PD-1 / PD-L1通路已被证明是一个至关重要的调制器调节宿主免疫反应的自身免疫、肿瘤免疫、移植免疫、过敏、免疫特权,和缺血/再灌注损伤(13,14]。PD-1 / PD-L1通路建议中发挥关键作用抵抗宿主之间的相互作用的免疫反应和某些细菌致病性等15]。

我们以前的工作表明,发生在败血症患者PD-1和PD-L1计算表达式的值(16]。我们检查了PD-1的作用,在19个脓毒性休克患者和22 sex-matched PD-L1和年龄健康对照组。我们发现,与健康对照组相比,感染性休克诱导显著增加细胞凋亡的检测CD4 caspase-3 annexin-V绑定和活跃⁺CD8 T细胞,⁺T细胞,CD19⁺B细胞。表达PD-1 PD-L1的T细胞和单核细胞在感染性休克患者显著调节。PD-1 / PD-L1通道封锁在体外与anti-PD-L1抗体T细胞诱导的细胞凋亡的减少肿瘤坏死因子α或t细胞受体结扎。与此同时,这封锁强lipopolysaccharide-induced肿瘤坏死因子α并通过单核细胞il - 6生产和降低il - 10生产在体外。简而言之,PD-1 / PD-L1途径可能在sepsis-induced免疫抑制起着关键作用。我们的动物研究发现,PD-L1封锁改善脓毒性小鼠的生存(17]。PD-1的表达在T细胞、B细胞、单核细胞和PD-L1 B细胞和单核细胞是调节在感染性动物相比sham-operated控制。Anti-PD-L1抗体政府阻止sepsis-induced损耗的淋巴细胞,肿瘤坏死因子(TNF)增加α和白介素(IL) 6产品,降低IL - 10生产,增强细菌清除率。Anti-PD-L1抗体政府sepsis-induced免疫抑制可能是一个有前途的治疗策略。

肝脏免疫耐受中发挥了关键作用的各种疾病。然而,PD-L1封锁的影响与抗体sepsis-induced肝损伤及其分子机制仍不清楚。因此,我们目前的研究目的是调查的角色在sepsis-induced PD-L1通过小鼠盲肠的结扎和穿刺肝损伤模型。我们想确定PD-L1的表达式在肝脏脓毒症,并提供一个初步的结果在sepsis-induced PD-L1肝损伤的作用。

2。材料和方法

2.1。老鼠

男性8 - 10周大C57BL / 6小鼠,重22 g各30克,买来第二军医大学动物实验中心。所有的老鼠被安置在air-filtered、温度控制单元与12小时的明暗周期和免费的食物和水。所有实验机构的动物保健和使用委员会批准我们的大学。

2.2。感应CLP的脓毒症

如前所述(执行败血症CLP-induced幼童腹壁薄弱18]。简单地说,老鼠麻醉isofluorane和中线腹部切口。盲肠动员,结扎在回盲瓣,和刺穿了两次22计针腹膜炎诱导幼童腹壁薄弱。在两层腹壁被关闭。Sham-operated老鼠经历了同样的过程,包括打开腹膜和暴露肠,但不结扎和盲肠穿孔针。手术后,小鼠注射1毫升生理盐水为液体复苏。所有小鼠无限制地食物和水前和术后。一个剂量的50μg anti-PD-L1抗体(Anti-Mice CD274 (B7-H1) PE,克隆:MIH5,购自研发系统)在200年μL PBS的注入腹腔手术后1小时/鼠标。老鼠从同形像组注射一剂量的50μg (200μL)控制抗体(鼠IgG2a,λ相应的)。

2.3。等离子体化学

小鼠安乐死CLP或sham-operated手术后24小时。血液样本是从心脏。从全血的离心分离后,等离子体被用于测定丙氨酸转氨酶(ALT)和吸入转氨酶(AST)活动商业化ELISA试剂盒(南京建成生物工程研究所、南京、中国)根据制造商的指示。

2.4。肝组织学

右叶肝血获取后迅速收获。肝脏是然后在10%福尔马林固定石蜡包埋。5μm组织部分被剪切了石蜡块和与苏木精和伊红染色。组织部分光学显微镜下检查一位独立的病理学家。

2.5。肝脏免疫组织化学

左叶肝也切断microtome-cryostat被冻结。连续的4-micron部分标本风干了10分钟,然后在丙酮固定了10分钟。内源性过氧化物酶活动被治疗0.3%氢过氧化物酶在PBS在室温下30分钟。部分被洗了三次在PBS。与正常solcoseryl阻止非特异性结合后20分钟在室温下,部分在湿润孵化室在4°C一夜之间主要抗体,Anti-PD-L1抗体,从eBioscience购买(美国MIH5,圣地亚哥,CA)和使用的最终浓度20μ克/毫升。早上使用二次抗体与PBS洗涤后与初级抗体和部分孵化在室温20分钟。二次抗体检测与民建联根据制造商的指示,和部分与苏木精复染色。消极的控制没有初级抗体和积极控制组织包括所有实验,确保染色质量。

2.6。肝基因表达

评价介质在炎症反应的基因表达,PD-L1的mRNA水平,il - 6、il - 10, TNF -α是衡量实时聚合酶链反应(rt - pcr)。小方块的肝后立即得到老鼠的死亡。总RNA提取多维数据集使用RNeasy迷你包(试剂盒、希尔登,德国)。100 ng RNA用于互补脱氧核糖核酸合成使用高容量cDNA逆转录工具包(应用生物系统公司)根据制造商的协议。定量rt - pcr进行使用SYBR绿色(豆类)在7900年ABI棱镜序列检测器(美国应用生物系统公司)与SDS 2.1软件。每个反应都表现一式四份,最终计算结果从四倍的井。ΔΔCq方法被用来确定PD-L1的意思表达水平的差异,il - 6、il - 10, TNF -α研究对象之间rs4755453的不同基因型。对于每个个体,相对表达水平ΔCq (Cq T−Cq E) PD-L1、il - 6、il - 10, TNF -α与GAPDH规范化,然后转换成相对数量中移动使用公式(RQ = 2-ΔΔCq,ΔΔCq个人和ΔCq校准器)。向前PD-L1的引物5′-tgctgcataatcagctacgg-3′和反向5′-gctggtcacattgagaagca-3′。向前il - 6的引物5′-atggatgctaccaaactggat-3′和反向5′-tgaaggactctggctttgtct-3′。il - 10的引物5′-ccagttttacctggtagaagtgatg-3′和反向3′-tgtctaggtcctggagtccagcagactc-5′。肿瘤坏死因子-的引物α5′-catcttctcaaaattcgagtgacaa-3′和反向5′-tgggagtagacaaggtacaaccc-3′。

2.7。统计分析

所有的数据进行了分析使用GraphPad棱镜软件5.0.1 (GraphPad软件、圣地亚哥、钙、美国)。手段和标准错误意味着计算的实验。配对测试完成时,两组进行比较。图表显示平均误差代表标准误差。一个值< 0.05(双尾)被认为是具有统计学意义。

3所示。结果

3.1。脓毒症诱导的Upregulation PD-L1表达小鼠的肝脏

检查PD-L1表达式的定位在肝组织内,我们进行免疫组织化学染色(图1)。所有标本中脓毒症组PD-1呈正彩色细胞膜,细胞质,或在中央静脉周围分散模式。有广泛和强烈的表达PD-L1在小鼠的肝脏脓毒症的挑战。另一方面,没有染色PD-L1活动肝细胞或其他细胞的细胞质的骗局。

为了澄清在肝脏PD-L1定量的表达,我们进行实时PCR。我们的结果表明,有一个5.7倍的PD-L1 mRNA表达显著增加肝脏的老鼠CLP后24小时挑战比虚假的组(图2)()。

这些结果,基于mRNA转录和蛋白表达,揭示PD-L1不可或缺的角色在脓毒症小鼠的肝脏受到CLP-induced幼童腹壁薄弱。

3.2。Anti-PD-L1抗体减轻脓毒症引起的肝损伤的形态

H和E染色显示,小鼠肝组织病理学的虚假的集团几乎是正常的。相比之下,CLP-induced脓毒症导致显著肝损伤小鼠在24小时。肝脏形态的变化表明,系统性炎症存在(图3(a))。中央静脉阻塞是一个引人注目的特性在脓毒症组。(图3(一))的坏死和浸润的单核炎症细胞存在,还指出在intrasinusoidal区域(图3(b))。肝细胞肥大和正弦收缩也被发现。值得注意的是,大量肝细胞气球样变性(图3(c))。中央静脉显示不规则(图3(d))和门静脉充血也可以观察到。相反,老鼠从虚假的组呈现正常的组织学,与正常肝细胞,门户地区,和薄壁组织(不提供)。

肝损伤显然松了一口气anti-PD-L1组的价格相比脓毒症组显微镜下(图4(a))。虽然在中央静脉不规则可以发现,斯波蒂intrasinusoidal地区坏死不显著(图4(b))。观察脂肪变性肝细胞。然而,肝细胞仍正常和正弦曲线(图4(c))。浸润的炎症细胞只在有限的盘子,这可能是肝小叶的边界,包括门户地区(图4(d))。因此,PD-L1封锁的抗体可以逆转肝损伤小鼠脓毒症挑战后24小时。

3.3。Anti-PD-L1抗体降低ALT和AST败血症引起的肝损伤后释放

正如所料,CLP-induced败血症引起的小鼠的ALT和AST水平增加(更易与L和更易与L,职责),表明肝损伤,而虚假的集团(更易与L和更易与L,职责。)()。相比之下,anti-PD-L1抗体降低ALT和AST水平(更易与L和更易与L,职责)。。因此,anti-PD-L1抗体可以降低ALT和AST水平(图的水平5)。

3.4。PD-L1封锁对il - 6水平的影响,il - 10, TNF -α信使rna在肝脏

然后我们anti-PD-L1抗体的疗效评估的mRNA水平几个24小时后细胞因子在脓毒症。mRNA水平的il - 6、il - 10和TNF -α都是增加在CLP组相比,虚假的组。Anti-PD-L1抗体治疗显著降低mRNA水平的il - 6、il - 10, TNF -α在肝脏()。之间没有显著差异中电集团和同形像集团的每一个细胞因子()(图6)。这些结果表明,治疗管理anti-PD-L1抗体松了一口气CLP-induced脓毒症所引起的肝脏炎症。

4所示。讨论

本研究的主要发现是,PD-L1表达调控与脓毒症小鼠的肝脏,肝脏mRNA转录水平和免疫组织化学的基础上。PD-L1封锁与抗体可以减少CLP-induced感染性肝损伤的程度。

CLP-induced败血症引起显著炎症反应和损伤肝脏生化(ALT和AST活性)和特征(hematoxylin-eosin-stained部分)。我们的研究结果符合Koskinas的报告等。19]。他们表明,病人死于败血症主要是与门户炎症有关,小叶中心的坏死、肝细胞凋亡。AST和ALT水平增加观察的病人死于脓毒症(19]。

脓毒症与促炎细胞因子的生产过剩,从而导致白细胞的招聘和组织损伤20.,21]。大量的炎性细胞因子,包括il - 6、il - 10、il - 1、TNF -α参与脓毒症,这有助于组织和器官损伤。我们的研究发现,不仅anti-PD-L1抗体抑制促炎细胞因子(il - 6和TNF -α),而且抗炎细胞因子(il - 10)。这些结果部分按照我们先前的调查结果。Zhang et al。17)发现显著增加TNF的表达——PD-L1封锁α和il - 6和il - 10的水平下降在CLP小鼠血浆。总的来说,这些数据表明anti-PD-L1抗体在感染性肝损伤的保护作用可能部分通过抑制促炎细胞因子。

使用CLP-induced败血症、脓毒症的动物模型,我们的研究结果表明,PD-L1表达调控与脓毒症小鼠的肝脏。小鼠脓毒症在肝脏PD-L1表达的一个重要高度,基于mRNA水平和转录肝脏的免疫组织化学染色。表明PD-L1是表示对枯氏细胞(;)和肝脏正弦上皮细胞在小鼠肝组织(LSECs) [22]。肝细胞表达持续低水平的PD-L1但显示增加PD-L1表达式与干扰素刺激23]。进一步的研究需要阐明的确切定位PD-L1通过免疫荧光双重染色或流式细胞术在肝脏标本。基于当前对PD-L1在肝脏中的作用的理解,我们推测upregulation PD-L1;主要是和浸润的淋巴细胞。脓毒症是否会改变PD-1和PD-L2肝脏的表达也需要调查。

在我们的研究应该注意的几个限制。我们没有探索更具体机制anti-PD-L1抗体sepsis-induced肝脏损伤的保护作用。据报道,肝损伤在脓毒症是通过功能改变而不是结构损伤。PD-L1的作用的时间进程研究sepsis-induced肝损伤是十分必要的。我们目前的研究选择了一剂anti-PD-L1抗体使用老鼠,这是基于我们之前的发现。anti-PD-L1抗体的影响在不同剂量模型还需要澄清。此外,封锁PD-L1是否在其他器官损害起着至关重要的作用,也就是说,肾、肠,和心脏,在脓毒症也需要澄清。

5。结论

最后,我们发现PD-L1表达升高实验脓毒症小鼠的肝脏。PD-L1封锁与抗体可以发挥对sepsis-induced肝损伤保护作用,以减轻肝脏病理损伤,降低ALT和AST释放,和衰减肝脏炎症反应。因此,anti-PD-L1抗体可能减少肝损伤在脓毒症治疗的潜力。

利益冲突

作者宣称没有利益冲突披露。

作者的贡献

朱音译,瑞宝,小华球迷贡献了同样的纸。

确认

这项研究得到了国家自然科学基金(批准号81201492和81201492)。