文摘
5 -羟色胺(5 -)在慢性疼痛的参与机制建立。5 -抑制中央痛苦的刺激,但最近的数据表明,5也可以提高疼痛刺激的外围,肥大细胞起着重要的作用。我们在研究中针对澄清的影响选择三环类抗抑郁药(TCAs)肥大细胞功能:分泌,吸收,再摄取5 -,可能干扰5水平,以这种方式导致疼痛的一代。作为实验模型,我们使用隔离大鼠腹腔肥大细胞,用选定的见面会上,孵化(氯丙咪嗪、阿米替林、多虑平、丙咪嗪)在不同的实验条件。5 -释放、吸收和再吸收测定spectrofluorometrically。我们表明,见面会上,能够抑制5 -从肥大细胞分泌,以及吸收外源性5 -和5 -回肥大细胞分泌的再摄取。见面会上的影响浓度依赖性;更高浓度的见面会上,抑制5 -诱导的分泌化合物48/80,而低浓度的见面会上,抑制5 -吸收。最有效的柠檬酸是卤代氯丙咪嗪。在见面会上,介绍了在慢性疼痛治疗,行动是重要的洞察机制的理解各种疼痛的效果。
1。介绍
慢性疼痛是一种复杂的神经生物学现象与各种因素的周边和中枢疼痛信号的机制。慢性疼痛的常见基本机制的存在部位的炎症引起的损坏或影响组织的几个炎症介质释放前列腺素,缓激肽、组胺。这些代理初级感觉神经元的敏感性增加痛苦的刺激(1]。强烈激活的促炎介质还驱动电压门控钠离子通道的开放(VGSCs)中央和周边的关键敏感和兴奋性神经元在中枢和周围神经系统(2- - - - - -4]。因此释放促炎和immunoactive物质启动本地行为和可能导致更广义的反应导致慢性疼痛状态。
除了周边感觉通路,有中央抑制或facilitatory途径,各种神经递质和信号分子可以贡献的一代和/或维护中心以及周边痛苦的刺激(1]。其中,5 -羟色胺(5 -)起着复杂的作用。在中枢神经系统中,单胺能的(去甲肾上腺素和5 -)和下行通路opioidergic神经元抑制疼痛传输;神经性疼痛,持续的疼痛被认为是主要是由于降疼痛facilitatory通路激活和失活的痛苦下行抑制通路(5- - - - - -9]。在脊髓,收敛的外围输入和下行通路发生。这里,抑制分子如γ-氨基丁酸(GABA)、内源性阿片类物质和类,控制有害刺激的传播(10,11]。
相反的抑制作用5 -中央痛苦的刺激,最近的研究结果表明,5 -可能增强边缘的疼痛刺激。人们已经发现,增加5 -水平之间的关系和肥大细胞数量的增加慢性腹痛患者(12- - - - - -14]。可能的粘膜肥大细胞数量之间的关系和直肠敏感性也被证明在人类14]。也有证据表明在肥大细胞数量显著增加患者肠道肠道综合症。与肥大细胞数量增加,有直接支持,肥大细胞数量与腹痛的患者(15]。另一方面,我们只有有限的数据对肥大细胞在中枢神经系统的作用在慢性疼痛的发生。肥大细胞衍生的精确作用5 -因此在慢性疼痛的机制仍然未知。
到目前为止,选择抗抑郁药物治疗策略被认为是作为一个重要组成部分治疗不同类型的持续性痛像神经性疼痛,痛苦多神经病(16,17],postherpetic神经痛[18,19)以及类风湿性关节炎,强直性脊柱炎(20.),和纤维肌痛21),虽然在这些过程的确切机制目前还不完全清楚(审查[1])。抗抑郁药物的作用机制主要包括钢筋的下行抑制通路通过增加突触间隙中去甲肾上腺素和5 -在脊髓和脊椎上的水平。VGSCs的进一步的研究已经证明了一个关键的角色在不同类型的慢性疼痛综合征;从这个意义上说,抗抑郁药物阻断钠通道的财产已被证明可有效抑制持续疼痛信号(1]。我们在之前的研究发现,某些抗抑郁药物可以影响5 -肥大细胞的分泌物22,23]。派生自肥大细胞的影响5 -在持续性痛可能是重要的,我们现在的工作很感兴趣阐明选择抗抑郁药的影响在不同的流程,由肥大细胞,分泌、吸收和再吸收,可能干扰5的水平,因此生成和/或维护的痛苦。
2。材料和方法
2.1。材料
5 -羟色胺、阿米替林、多虑平、丙咪嗪和氯丙咪嗪从σ,Steinheim,德国。化合物48/80,伴刀豆球蛋白A,牛血清白蛋白,葡萄糖,Tris-HCl,和phthaldialdehyde(选择)也从西格玛化学品,Steinheim,德国。玫瑰从默克公司购买,达姆施塔特,德国,和Percoll获得Amersham生物科学,瑞典乌普萨拉。所有其他化学试剂均为分析纯。荧光光谱测定法在荧光谱仪进行了日本岛津公司rf - 1501。
2.2。动物
Wistar鼠(200 - 350克)是来自我们自己的繁殖生长。他们保持在恒定的环境条件下,22±1°C的环境温度,相对湿度55±10%,光暗周期的自然疗法。动物被关在笼子里Ehret类型4(德国);床上用品材料Lignocel 3/4。他们收到标准啮齿动物饮食Altormin(德国),免费获取食物和水。我们使用两个动物实验。所有动物国家动物伦理委员会批准的程序已经被斯洛文尼亚共和国和依法进行的欧洲公约保护脊椎动物用于实验和其他科学123 (ETS)。
2.3。隔离的肥大细胞
大鼠腹腔肥大细胞被分离腹膜腔如下:10毫升的缓冲盐溶液注入腹腔,然后腹部轻轻按摩为1.5分钟。大鼠腹膜细胞悬浮在缓冲盐溶液混合使用以下成分(更易/ L): 134.0氯化钠,氯化钾4.7,MgSO41.2,CaCl21.0、12.5 Tris-HCl牛白蛋白1毫克/毫升,pH值7.4。当时细胞悬液离心10分钟的220克,和上层的丢弃。收集到的细胞resuspended缓冲盐溶液和离心机220克10分钟。制备纯化的肥大细胞(> 98%),这些细胞被转移到HEPES-buffered(32更易/ L) Percoll解决方案。Percoll的梯度是由离心21000 g为30分钟在4°C。离心后,Percoll删除了在缓冲盐溶液洗涤肥大细胞分数,分数的和额外的离心,包含肥大细胞。
2.4。治疗见面会上的肥大细胞
肥大细胞在缓冲盐溶液resuspended (pH = 7.2)有以下组成(更易/ L): Na2HPO46.7,KH2阿宝42.7 137年6.7,氯化钠,氯化钾,CaCl21.0、牛白蛋白0.5毫克/毫升和葡萄糖1 g / L。每个样本包含在5.105和2.106肥大细胞。(1)在分泌的实验中,肥大细胞与不同浓度(10 preincubated−8-10年−4mol / L)的选择见面(阿米替林、多虑平、丙咪嗪和氯丙咪嗪)10分钟,然后孵化的化合物48/80 (0.1μg / mL)额外的10分钟。(2)在吸收实验中,肥大细胞被孵化与5 - (250 ng /样本)10、30或60分钟。实验进行在37°C或在0°C细胞外钙的存在2 +离子(10−3mol / L)或在Ca2 +无介质。在第二组实验中,肥大细胞与不同浓度(10 preincubated−8-10年−4mol / L)的选择见面(阿米替林、多虑平、丙咪嗪和氯丙咪嗪)与5 - 10分钟,然后孵化(250 ng /样本)额外的30分钟。(3)再吸收的实验中,肥大细胞被孵化与化合物48/80 (0.2μg / mL) 10、30或60分钟。在第二组实验中,肥大细胞与不同浓度(10 preincubated−8-10年−4mol / L)的选择见面(阿米替林、多虑平、丙咪嗪和氯丙咪嗪)10分钟,然后孵化的化合物48/80 (0.2μ或伴刀豆球蛋白(100.0 g / mL)μg / mL)额外的60分钟。孵化后,分泌、吸收或再摄取5 -停止通过冷却管在一个冰冷的浴。
2.5。测定5 -分泌、吸收和再吸收
5 -决心在上层清液和细胞分数,使用spectrofluorometric方法和省略提取过程(详细信息请参阅[24])。样本(1毫升)温暖的0.05毫升半胱氨酸(3%),1.1毫升盐酸(37%)和0.07毫升选择(0.2%)在75°C,持续15分钟。他们在冰浴冷却后,和5 -测量spectrofluorometrically在激发波长360 nm和发射波长478 nm)。五是在上层清液和细胞分数决定。5 -释放被表示为一个百分比的总5样本。所有值修正了自发释放5 -,这总是< 7.0%。
2.6。统计分析
决定5内容显示为意味着±标准平均误差(SEM)五个独立的化验。对于每一个治疗和控制,四个样品进行了分析。学生的以及用于统计分析。对于所有的测试,被认为是具有统计学意义。
3所示。结果
3.1。抑制作用的抗抑郁药物5 -释放
的促分泌素、复合48/80,从肥大细胞释放5 -。10分钟后孵化的肥大细胞与化合物48/80 (0.1μg / mL) 5 -释放大约是42%。结果表明,见面会上,能够抑制5 -分泌,引起肥大细胞复合48/80。效果是剂量依赖,只发生在更高浓度的见面。见面会上的抑制效果取决于药物的极性;卤代导数氯丙咪嗪是更有效的比其他使用抗抑郁药物(图1)。
3.2。抗抑郁药物的效果5 -吸收和再吸收到肥大细胞
结果表明,肥大细胞能够去除外源性5 -从孵化的媒介。吸收需要一个活跃的过程取决于温度和时间的孵化与外源性5 -肥大细胞。在37°C,它随孵化时间与外源性5 -肥大细胞,而在0°C抑制(图2(一个))。细胞外钙的吸收需要存在2 +离子。在中,包含细胞外钙2 +离子(10−3mol / L),孵化的吸收随时间增加。相比之下,钙的吸收明显抑制2 +无介质(图2 (b))。
(一)
(b)
在细胞外钙的存在2 +离子(10−3mol / L),见面会上,抑制5 -中肥大细胞吸收剂量依赖性的方式。最有效的化合物是卤代抗抑郁药氯丙咪嗪,抑制外源性5 -吸收是观察到浓度10−8mol / L(图3)。
在第二组实验中,我们表明,肥大细胞能够刺激肥大细胞的复合后再吸收释放5 - 48/80。再摄取与时间有关;10分钟后孵化的肥大细胞与化合物48/80 (0.2μg / mL),它会释放出平均5 -总数的60%。60分钟的孵化后,5 - 10分钟孵化相比显著降低,这表明肥大细胞能够发布的再吸收介质(图54)。
在进一步的实验中,我们审查的影响,选择见面后再摄取5 -到肥大细胞长期(60分钟)孵化肥大细胞与不同的促分泌素的化合物48/80,伴刀豆球蛋白a。我们的研究结果表明,预培养的肥大细胞与选定的见面会上,导致5 -再摄取抑制肥大细胞。抑制是剂量依赖和使用TCAs之间的不同;最有效的是卤代抗抑郁药氯丙咪嗪。在图5后60分钟,我们表明,刺激肥大细胞的促分泌素(化合物48/80和伴刀豆球蛋白A),介质中的释放5 -代表了36%和49%,分别相比,样品的总5。预培养的肥大细胞浓度范围从10选择见面−8到10−5mol / L导致5 -再摄取抑制肥大细胞,在剂量依赖性的方式。因此,60分钟后预培养的肥大细胞与柠檬酸浓度增加,我们观察到更高浓度的释放5 -媒介相比,肥大细胞中没有preincubated柠檬酸(图5)。
(一)
(b)
4所示。讨论
最近的研究表明免疫之间的良好的沟通,内分泌,维护和神经系统的慢性疼痛,在[5扮演重要的角色25]。到目前为止,我们认为5 -抑制疼痛刺激的产生对中枢神经系统的水平,但最近的证据表明,5可能还通过增加疼痛传输有关的边缘,在肥大细胞发挥重要作用[26,27]。
使用大鼠腹腔肥大细胞,我们表明,TCAs影响肥大细胞衍生5水平通过至少三种不同的机制:分泌5 -,外源性5 -的吸收,再吸收分泌5 -。首先,选择见面能够抑制5 -从肥大细胞的分泌。剂量依赖性抑制作用,和卤代氯丙咪嗪被发现是最强有力的丙咪嗪相比,多虑平、阿米替林。5 -分泌的抑制肥大细胞对低浓度的5 -在外围,因此可以减少敏感的感觉神经末梢5 -,这是重要的一代的边缘痛苦的刺激(28,29日]。现在已经知道,大约95%的5 -在腹膜腔体内产生,并抑制5 -肥大细胞分泌物在治疗慢性腹痛可能是有益的(12]。我们的结果支持最新发现,增强的肥大细胞数量之间的关系和5水平在慢性腹痛患者建议(14,15]。与这方面,5 -已被建议作为一个重要的肥大细胞中介可以与周围神经导致增加肠道敏感性和慢性腹痛(30.- - - - - -33]。
然而,肥大细胞在这些情况下的精确作用尚未阐明,和几个问题仍有待解决。5 -旁边,肥大细胞释放一些介质,如组胺、类胰蛋白酶,蛋白聚糖,白三烯C4、血小板激活因子,和前列腺素D2。他们可以激活感觉神经,导致内脏痛觉过敏/触诱发痛[29日]。另一方面,肥大细胞不仅布满和释放促炎的物质,也可能在更接近胆碱能神经从而改变胃肠道蠕动和超敏反应(即。,增加腹痛)。5 -代谢的异常的检测腹腔因此产生了特别感兴趣(34- - - - - -36]。
在中枢神经系统中,5 -有助于抑制疼痛信号传输。在这个过程中,血清素激活的神经元从下行抑制通路,而不是肥大细胞,获得5 -对突触传递是至关重要的。它已经知道TCAs吸收抑制5 -羟色胺神经元和这种方式增强5 -的浓度在突触间隙和抑制中央痛苦的刺激。此外,抗抑郁药物阻断钠通道的属性(即。,VGSCs) have been shown to be effective in suppression of persistent pain signal because these channels play a fundamental role in the excitability of neurons in the central and peripheral nervous system, as well [25]。此外,我们在研究中显示,见面可以抑制吸收5到肥大细胞也可能导致更高浓度的5 -中枢神经系统。
在外围,见面会上,效果似乎更加复杂。他们抑制分泌5 -肥大细胞,导致5 -浓度下降。此外,他们还能抑制外源性5 -的吸收,以及再摄取的肥大细胞分泌5 -回肥大细胞,导致更高水平的环境中5。在腹腔肥大细胞代表5的一个重要来源,而当5 -从肥大细胞的分泌受到抑制,5-HT-mediated敏化的感觉可能是抑制。
5。结论
总之,我们发现见面能够抑制5 -从肥大细胞分泌,以及吸收外源性5 -和5 -回肥大细胞分泌的再摄取。所有这些事件影响5 -水平,因此可能导致一代和维护身体的痛苦的刺激。在见面会上,建立在慢性疼痛治疗,洞察他们的行动的机制是至关重要的因为在各种疼痛的影响的理解。在这方面,我们的研究提供了一个简单的在体外机械的化合物的研究方法,针对由肥大细胞5 -调制的水平。
利益冲突
作者宣称没有利益冲突。
承认
成立的工作科研补助金p3 - 0067从斯洛文尼亚研究机构。