文摘

我们最近表明,西地那非降低细胞因子的表达,cox - 2和GFAP在脱髓鞘模型诱导在野生型小鼠(WT)。,西地那非的神经保护作用的理解和中介的间接宾语/不系统引起的炎性脱髓鞘cuprizone进行调查。伊诺的小脑−−/老鼠检查治疗4周后与cuprizone单独或结合西地那非。Cuprizone增加GFAP、Iba-1 TNF -αcox - 2, il - 1β和干扰素-γ谷胱甘肽的表达,减少表达S-transferaseπ(GSTpi),并在伊诺受损髓磷脂−−/老鼠。西地那非减少Iba-1,干扰素-γ,il - 1β但没有影响GFAP的表达水平,TNF -α,cox - 2相比cuprizone组。西地那非GSTpi水平升高和改善了髓鞘结构/超微结构。伊诺−−/老鼠遭受严重的炎症cuprizone治疗后,虽然WT小鼠温和的炎症,在前面的研究发现。可能是炎症调节通过iNOS-feedback伊诺缺席−−/老鼠,使他们更容易受到炎症。西地那非至少部分通过伊诺抑制抗炎效应,对伊诺作为它的影响−−/老鼠是有限的。还需要进一步的研究来解释西地那非的底层机制的影响。

1。背景

一氧化氮(NO)是一种高活性分子的生理功能(1,2]。这个信使中扮演一个重要的角色在血管张力的调制3),神经传递(4,5),和免疫系统6- - - - - -8]。没有生产的精氨酸合成酶(诺斯)。除了本构形式的酶(内皮(以挪士或NOS3)和神经元(nNOS或NOS1)),还有一个诱导形成(间接宾语或NOS2)。最后一个是最常见的与炎症相关条件没有大量生产。

有强有力的证据表明伊诺的参与在神经退行性疾病的发展。伊诺的感应,没有,没有副产物被发现在多发性硬化(MS)患者和动物模型和与疾病严重程度和水平的炎性浸润[9- - - - - -12]。然而,有趣的是,iNOS-deficient小鼠模型开发了一个更严重的女士(13,14]。发现消除伊诺不改善,可能会加剧,髓鞘脱失cuprizone-demyelinating模型(15),这表明伊诺/不得神经系统。需要更多的信息来理解伊诺/不在炎症反应的作用,少突细胞细胞死亡和髓磷脂损害/损失。

环鸟苷3′,5′一磷酸(cGMP)信号通路是一个重要的NO-signaling分子。没有结合可溶性guanylyl环化酶(国网公司)和cGMP的浓度增加,激活信号级联,导致cGMP-dependent反应(16,17]。cGMP信号可以终止行动的几个磷酸二酯酶(PDE) (18]。的cGMP-selective PDE5表示心血管,神经和免疫系统18]。研究表明,选择性PDE5抑制剂,广泛用于治疗勃起功能障碍的人,如西地那非(伟哥;辉瑞)和伐地那非(血管扩张;拜耳),大脑中提高cGMP水平和提供保护作用,改善认知和记忆(19),降低缺血性脑血管损伤后神经细胞死亡(20.),减少白质损伤,和调节炎症反应的模型(女士21,22]。最近的研究的作者在野生型C57BL6小鼠模型诱导女士发现,西地那非有抗炎作用,减少促炎细胞因子水平和cyclooxygenase-2 (cox - 2)和保护髓鞘结构(22]。然而,西地那非神经保护机制仍然未知。

在目前的研究中,炎性脱髓鞘在伊诺诱导−−/老鼠,西地那非是管理的四个星期。本研究的重点是识别一个强有力的炎症反应分子的作用,iNOS-derived不,与西地那非相关的保护机制。目前研究还旨在澄清没有保护和/或有害的作用机制在脱髓鞘模型。

2。材料和方法

2.1。实验设计

五个伊诺敲除小鼠(B 6.129 P2 - Nos2),年龄在7到10周,重15 - 20克,每组使用。老鼠检查健康状况,适应实验室环境25°C和12 h光明/黑暗光周期,和安置在金属笼子。对照组接受标准实验室饮食和纯水。在四周内,实验小组收到0.2% cuprizone (oxalic-bis-cyclohexylidenehydrazide Sigma-Aldrich Inc .,圣路易斯,密苏里州,美国)混合到食物和纯净水或0.2% cuprizone周润发和25毫克/公斤体重的西地那非(伟哥;辉瑞公司,纽约,纽约,美国)管理通过饮用水(22- - - - - -24]。体重是每周访问和水中的药物浓度维持剂量调整。所有的实验都是在遵守道德准则进行动物实验(L-10/2010-CEUA;05/10-CIBIO FIOCRUZ)。治疗后,动物麻醉(坜)与氯胺酮(115毫克/公斤)和甲苯噻嗪(10毫克/公斤)(Sespo Comercio e工业Ltda。巴西,圣保罗,SP)。

2.2。免疫荧光(如果)

动物麻醉后,用生理盐水灌注transcardially(20毫升),其次是4%多聚甲醛(Sigma-Aldrich)(40毫升)0.1米磷酸盐(磷酸氢钠和氢七水硫酸锌,Sigma-Aldrich)缓冲盐水(PBS), pH值7.2。小脑是解剖和沉浸在15%蔗糖一夜之间,其次是30%蔗糖第二个晚上(36小时总)。标本被嵌入在OCT-Tissue Tek化合物(美国樱花Finetek托兰斯,CA)和冷冻在正己烷(Dinamica、圣保罗、SP、巴西)与液态氮冷却。Cryosections (8μ米厚)permeabilized Triton x - 100年(0.3%)和孵化1 h和屏蔽解决方案(3% BSA + 0.2%渐变20三羟甲基氨基甲烷缓冲液盐)。随后,部分被孵化与抗体胶质原纤维酸性蛋白(GFAP) (DakoCytomation,猫。不。和光,佐薇334)和Iba-1 (kouichi大阪,日本,猫。不。019 - 19741年)(1:100)。部分是孵化主要与多克隆抗体过夜然后孵化Cy3-conjugated二级抗体(杰克逊,猫。不。705-165-147)对兔免疫球蛋白(1:200)1 h。幻灯片是清洗和安装在荧光延长黄金不变色介质(生活技术,猫。 no. P36930) for observation under an inverted fluorescence microscope (Zeiss MicroImaging GmbH) equipped with a camera (Zeiss AxioCam MRM) and the Release 4.7.2 image analysis software.

2.3。免疫组织化学(IH)

灌注后的描述,如果小脑被立即删除,后缀一夜之间在同一固定剂。样品在乙醇脱水系列(RJ Isofar化工有限公司,巴西),清除在二甲苯,嵌入在石蜡(默克公司目录。1071642504)。部分(5μ厚)是在一个RM 2035切片机(Reichert年代,徕卡),水化,洗在0.05 m PBS,孵化在这个缓冲1%牛血清白蛋白(BSA,分数V)(美国英里,内伯威尔市,IL)一小时。内源性过氧化物酶被执行和抗原检索,预处理部分的20毫米柠檬酸缓冲,pH值为6.0,在100°C, 30分钟。所有组织都孵化与兔多克隆anti-COX-2 (Abcam、加拿大/美国的猫。不。ab15191)(1: 100年,一夜之间在4°C)。洗后,部分覆盖了1 h和biotin-conjugated二级抗体使用合工具包(美国CA DakoCytomation,生物素化的链接普遍合;猫。不。K0690)和可视化3′3-diaminobenzidine (DAB)作为发色体。部分被弱复染色与哈里斯的苏木精和安装在entellan(默克公司的猫。 no. 1079610100).

2.4。西方墨点法(WB)

小脑很快被切割,每组均质提取鸡尾酒(10毫米EDTA, Amresco,梭伦,美国;2毫米甲苯sulfonyl-fluoride 100毫米氟化钠10毫米焦磷酸钠,10毫米衣饰归宿4,10μ克抑肽酶/毫升和100毫米三羟甲基氨基甲烷、液pH值7.4)。小脑的五个动物混合、均质池从每组。世行是在符合Nunes et al。22]。简单地说,(40的蛋白质μg)分离(IFN - 6.5%γ),10% (TNF -α,il - 1β以挪士)或12% (GFAP)丙烯酰胺凝胶。在5%脱脂牛奶后,主GFAP抗体(DakoCytomation 1: 10000年,猫。不。佐薇334),cox - 2 (Abcam 1: 1000年,猫。不。ab15191)、肿瘤坏死因子-α(美国Peprotech 1: 1000年,新泽西,猫。不。500 - p64),干扰素-γ(1:2500年,Peprotech猫。不。500 p119), il - 1β(1:2500年,GenWay生物技术公司,CA /美国,猫。不。18-732-292194),GST3 / GSTpi (Abcam 1: 250年,加拿大,猫。不。ab53943),以挪士(1:1000年,BD生物科学,猫。不。610299)孵化了四个小时后跟辣根peroxidase-conjugated抗体anti-rabbit (Sigma-Aldrich 1: 80000年,猫。不。A9169)、anti-mouse (Sigma-Aldrich 1: 1000年,猫。不。 A0168), or anti-goat secondary antibody (1 : 100,000, Sigma-Aldrich, cat. no. A5420). For quantification, the pixel density of each band was determined using the Image J 1.38 software (http://rsbweb.nih.gov/ij/download.html;由韦恩Rasband NIH,马里兰州贝塞斯达,美国)。对于每个蛋白质研究,研究结果证实了在三组实验。免疫印迹,β肌动蛋白(Sigma-Aldrich 1: 1000年,猫。不。A2228)进行控制。

2.5。Luxol坚牢蓝色(局部反馈)

灌注后的描述,如果样本梯度乙醇系列脱水中,清除在二甲苯,嵌在石蜡中。部分(5μ厚)是在一个RM 2035切片机(Reichert年代,徕卡)。髓鞘被发现使用Luxol-Fast蓝色(局部反馈)染色(溶剂蓝38岁;Sigma-Aldrich)符合Nunes et al。22]。在倒置显微镜下观察的部分(蔡司缩微成像GmbH)配备了照相机(蔡司AxioCam MRM)和释放4.7.2图像分析软件(蔡司)。

2.6。透射电子显微镜(TEM)

麻醉后,动物被transcardial牺牲与生理盐水灌注(20毫升),紧随其后的是40毫升- 2.5%戊二醛和4%多聚甲醛固定液的0.1米甲次砷酸盐酸钠(Sigma-Aldrich)缓冲区,pH值7.2。小脑是一夜之间快速切割和后缀相同的固定剂。接下来,小脑片段被洗了两次相同的缓冲和后缀在溶液中含有1%四氧化锇(Sigma-Aldrich), 2毫米氯化钙、和0.8%铁氰化钾(Sigma-Aldrich) 0.1米甲次砷酸盐缓冲,pH值7.2,在丙酮脱水,嵌入SPIN-PON树脂(嵌入812 -电子显微镜科学,华盛顿,PA,美国)。树脂聚合进行了3天的60°C。Semithin部分(0.5μ米厚度)放在玻璃幻灯片,用甲苯胺蓝染色。超薄部分厚度(70海里)被放置在300 -镍网网格,复染色以5%醋酸双氧铀(电子显微镜科学)和柠檬酸铅(Sigma-Aldrich),并分析了使用范Morgagni 268 d透射电子显微镜。

2.7。统计分析

免疫反应性的乐队(免疫印迹)的光密度值进行了分析使用GraphPad棱镜软件包(美国圣地亚哥,CA)。单向方差分析(方差分析),其次是Dunnett和/或图基的后续测试,用于比较组。结果表示为±SE,在适当的时候。一个 值< 0.05显示统计学意义。

3所示。结果

临床分析表明cuprizone-treated动物遭受了电动机的局限性,如震动、步行和姿势异常。西地那非治疗组(25毫克/公斤)表现出正常的行走姿势,和震动轻微或不存在的。

临床症状观察和记录三个观察员。的进气阀打开−−/控制动物表现出正常的运动机能和正常姿势和探索周围的环境。这组分为得分0(无信号)。老鼠接受cuprizone拱形(缩短)展出的姿势和震动和难以探索环境。这组分为分数2。老鼠接受25毫克/公斤的西地那非走和能够探索环境一般,没有或轻微的震动,被列为评分1。

Cuprizone GFAP增加,TNF -α小脑和cox - 2表达,表明星形胶质细胞激活(反应性胶质增生)和神经炎症。西地那非治疗不会降低这些蛋白质在老鼠身上没有伊诺的水平。

西方墨点法(WB)分析表明,GFAP、星形胶质细胞活化的标志(反应性胶质增生),存在于未经处理的伊诺的小脑−−/动物(控制)(图1(一))。0.2% cuprizone治疗4周这种蛋白质的表达显著增加(数据1(一)和1 (c); )。动物,与此同时收到了西地那非(25毫克/公斤)和cuprizone也表现出高水平的GFAP相比,控制数据1(一)和1 (c); )。

(一)
(一)
(b)
(b)
(c)
(c)
图1
GFAP免疫印迹。(一)GFAP免疫印迹伊诺−−/控制(续),cuprizone (CPZ)和cuprizone +西地那非(CPZ +小鲱鱼)组。(b)β肌动蛋白免疫印迹。(c)图代表量化和统计分析。对照组显示基底GFAP的表达。CPZ治疗诱导显著增加蛋白质和西地那非+ CPZ不会降低GFAP表达,保持高与对照组。实验进行了一式三份( 动物/组)。结果表示为±SE。* ,* * 而控制。

小脑的GFAP免疫荧光(如果)分析揭示细胞骨架中间丝蛋白的表达和位置的动物。在小脑的分子层,GFAP标签显示长期病患过程与一个典型的安排,是垂直于软脑膜膜(伯格曼神经胶质)(图2 (e))。病患过程也见过在其他细胞和血管(箭头人物2 (b),2 (d),2 (e))。正常对照组显示基底GFAP的表达定位(数字2(一个)和2 (d))。治疗CPZ诱导astrogliosis,增加标签在星形胶质细胞(数据的强度2 (b)和2 (e))。西地那非组GFAP标签比控制(数据更强烈2 (c)和2 (f))。

(一)
(一)
(b)
(b)
(c)
(c)
(d)
(d)
(e)
(e)
(f)
(f)
图2
GFAP免疫荧光。(a)和(d)显示GFAP的表达和生理位置在老鼠身上没有进气阀打开,也没有治疗。CPZ管理局((b)、(e))引起反应性胶质增生,厚和更多病患过程,而控制。GFAP仍然高与控制,应用程序之后,西地那非和CPZ ((c)、(f))。箭头显示病患过程和箭头指向过程周围血管和其他细胞。W:白质,M:分子层,P:浦肯野层、颗粒层、和v:容器。酒吧:20μm。

的进气阀打开−−/对照组的基础水平TNF -α(图3(a))。世行分析表明,cuprizone诱导细胞因子的显著增加,表明神经炎症(数字3(一)和3(b); ,而对照组)。动物收到cuprizone +西地那非TNF -也显著增加α相比,控制( )。


图3
西方墨点法对TNF -α和cox - 2。(一)、(c))伊诺的免疫印迹−−/控制(续),cuprizone (CPZ)和cuprizone +西地那非(CPZ +小鲱鱼)组。((b)、(d))图形代表量化和统计分析。对照组显示基底TNF的表达α。CPZ治疗导致显著增加细胞因子,和西地那非+ CPZ没有减少它的表达,保持高与对照组。只有最低数量的cox - 2在对照组。CPZ和CPZ +小鲱鱼造成这种酶的显著增加,而控制。实验进行了一式三份( 动物/组)。结果表示为±SE。* ,* * 而控制。

分析了cox - 2白平衡和免疫组织化学(IH)测试。这种酶在少量表达伊诺的小脑−−/对照组(数据3(c)和4(一))。CPZ政府诱导cox - 2表达显著增加,而控制(数字3(c)和3(d); )。西地那非治疗并没有降低cox - 2,保持高与对照组相比(数字3(c)和3(d); )。IH标签显示cox - 2的表达和位置(数字4(一)- - - - - -4 (c)),这主要是发现在小脑白质。对照组有非常低的表达这种酶(图4(一)),而对待动物的cox - 2高表达在白质(数字4 (b)和4 (c))。

(一)
(一)
(b)
(b)
(c)
(c)
(d)
(d)
(e)
(e)
(f)
(f)
图4
cox - 2免疫组织化学((一)- (c))和免疫荧光Iba-1 ((d) - (f))。伊诺−−/控制(一个)显示非常低的cox - 2表达(箭头所指)。CPZ治疗后(b), cox - 2标记显著增加,主要在白质与控制。动物对待CPZ +小鲱鱼(c)也增加了cox - 2,对照组比较。基底表达式Iba-1被控制的动物没有伊诺(d)。CPZ Iba-1增加,诱导小胶质细胞的活化表型(箭头)(e),西地那非+ CPZ Iba-1下降,诱发潜在的表现型(箭头)的小胶质细胞(f)。

免疫印迹控制β肌动蛋白图所示1 (b)。

Cuprizone Iba-1增加,il - 1β和干扰素-γ伊诺小脑的表达式−−/老鼠。虽然西地那非减少这些蛋白质的表达,但表达水平仍高于对照组。

Iba-1小胶质标记,如果进行了分析。有生理表达Iba-1伊诺的小脑−−/控制动物,与细胞过程,通常分枝,薄和弱标记(箭头,图4 (d))。Cuprizone治疗诱导表达Iba-1走强(图4 (e)),与对照组相比,较厚,更强烈的标签小胶质流程。这些过程失去了典型的薄支出现,表明细胞表型获得了激活特性。西地那非与CPZ Iba-1表达减少,小胶质细胞表现出很薄,高度支化过程,典型的潜伏状态(图4 (f))。

免疫印迹的il - 1β和干扰素-γ揭示了基底伊诺这些细胞因子的表达−−/对照组(数据5(一)和5(c))。Cuprizone强烈增加这些细胞因子的表达 ),而对照组(数字5(一)-5(d)),这表明神经炎症。西地那非治疗导致明显降低il - 1β和干扰素-γ相比cuprizone组( )。然而,il - 1的水平β和干扰素-γ保持高sildenafil-treated组与基线水平相比对照组( 和 、职责)。


图5
西方墨点法对il - 1β和干扰素-γ。(一)、(c))伊诺的免疫印迹−−/控制(续),cuprizone (CPZ)和cuprizone +西地那非(CPZ +小鲱鱼)组。((b)、(d))图形代表量化和统计分析。对照组显示基底il - 1的表达β和干扰素-γ。CPZ治疗诱导这些细胞因子的显著增加,而控制。西地那非+ CPZ明显降低il - 1β和干扰素-γ表达,相对于CPZ组。实验进行了一式三份。结果表示为±SE。* * ,* * * 相比,控制;# # ,# # # ,而CPZ。

老鼠没有伊诺接受以挪士表达显著增加,而野生动物。

未经处理的小鼠伊诺−−/(对照组; )和间接宾语−−/动物对待CPZ或CPZ +小鲱鱼(两种 )以挪士水平有显著提高,与野生型小鼠相比并没有接受治疗。在伊诺的表达以挪士−−/老鼠接受CPZ和CPZ +西地那非伊诺相比没有显著提高−−/控制动物,但会增加倾向(数字6(一)和6 (b))。

(一)
(一)
(b)
(b)
图6
西方墨点法以挪士。野生型老鼠控制(a)免疫印迹(WT cont),进气阀打开−−/老鼠控制进气阀打开−−/续),进气阀打开−−/动物对待cuprizone(进气阀打开−−/CPZ),进气阀打开−−/动物对待cuprizone +西地那非(进气阀打开−−/CPZ +小鲱鱼)。(b)图代表量化和统计分析。以挪士是生理上表达WT老鼠。动物没有伊诺没有治疗这种酶有显著提高,而WT控制。后CPZ CPZ +西地那非,进气阀打开−−/以挪士的动物也有显著提高,而WT动物,但伊诺之间没有发现显著差异−−/控制和治疗动物。实验进行了一式三份。结果表示为±SE。* ,* * * ,而控制。

Cuprizone GSTpi下降,表明成熟少突胶质细胞的损耗。西地那非GSTpi表达增加伊诺的小脑−−/老鼠。

GSTpi髓鞘少突胶质细胞的一个标志,表示在对照组的小脑(图7(一))。与CPZ治疗后,这个标记显著降低( )与对照组相比,这意味着成熟的少突胶质细胞的损伤和顺向髓鞘损伤。西地那非治疗一起CPZ诱导GSTpi标记的部分恢复,表明西地那非对成熟的少突胶质细胞有保护作用。西地那非组GSTpi减少与控制(相比 ),但相比增加cuprizone集团( ;数据7(一)和7 (b))。

(一)
(一)
(b)
(b)
图7
西方墨点法GSTpi。(一)免疫印迹伊诺−−/控制(续),cuprizone (CPZ)和cuprizone +西地那非(CPZ +小鲱鱼)组。(b)图代表量化和统计分析。伊诺−−/控制显示基底GSTpi的表情。CPZ之后,GSTpi显著降低,而间接宾语−−/续。CPZ +小鲱鱼治疗增加GSTpi表达式与CPZ集团,但这种蛋白质的含量仍显著下降而控制。实验进行了一式三份。* * * 相对于控制;# # # CPZ相比。

髓鞘结构紊乱的动物没有伊诺(控制)没有接受治疗。Cuprizone诱发更严重的髓鞘破坏。西地那非髓鞘结构和超微结构改善。

有趣的是,进气阀打开−−/动物没有治疗(控制)中髓鞘结构和超微结构的瓦解(数字8(一个),8 (d),8 (g))。标准的局部反馈染色显示,对照组伊诺−−/在白质液泡(箭头在图吗8(一个)),导致不均匀和无组织的组织。定性分析超薄小脑部分通过TEM显示髓鞘通常是粉碎,与空白,没有特征层状模式(箭头人物8 (d)和8 (g))。

(一)
(一)
(b)
(b)
(c)
(c)
(d)
(d)
(e)
(e)
(f)
(f)
(g)
(g)
(h)
(h)
(我)
(我)
图8
Luxol快蓝(局部反馈)染色((一)——(c))和电子显微图((d) -(我))。(a)、(d)和(g)代表伊诺−−/对照组;(b)、(e)和(h)代表CPZ-treated动物;(c)、(f)和(我)代表CPZ + Sild-treated动物。(箭头),(c):在白质液泡;箭头(b):纤维之间的空间;箭头(d), (e), (g)和(h):破坏髓鞘;箭头(f),(我):保存髓磷脂。酒吧= 20μ((一)——(c));2μ((d) - (f));0.5μm ((g) -(我))。

Cuprizone-treated动物表现出更严重的破坏髓鞘结构和超微结构(数据8 (b),8 (e),8 (h))。局部反馈染色(图8 (b))显示液泡(箭头)和空间(箭头)缝在白质,高度混乱组织的特征。TEM显示CPZ造成严重破坏髓鞘超微结构,它有很多空间碎片之间几乎所有的纤维(由箭头表示数据8 (e)和8 (h))。典型的层状模式是完全缺席。

同时治疗与西地那非和CPZ导致明显改善髓组织(数字8 (c),8 (f),8(我))。白质更均匀,呈现更少,一般来说,小液泡和slit-like空间(图8 (c))。超薄部分分析揭示了更多保留髓鞘很少显示分解的迹象。

4所示。讨论

cuprizone模型的特点是主要和可逆的髓鞘脱失,由于周围免疫系统的髓鞘损伤(25]。在这个模型中,髓鞘脱失伴随着良好的一系列事件涉及的损耗成熟的少突胶质细胞,激活小胶质细胞和星形胶质细胞增殖(26]。因此,脱髓鞘和居民神经炎症引起cuprizone在啮齿动物中广泛用作模型[女士20.,27]。在目前的研究中,cuprizone模型的有效性评价的作用是相当大的,因为它允许伊诺/ NO-sGC-cGMP炎症通路,中枢神经系统脱髓鞘由居民细胞。

小脑选择进行分析,因为它是一个重要的中枢神经系统受影响地区在MS患者中,揭示严重白质的萎缩(28,29日]。此外,本研究的作者最近调查本地区(22]。目前的数据,与进气阀打开−−/动物,将参照以往研究讨论。Nunes et al。(2012)22C57BL / 6)显示,野生型小鼠(WT) cuprizone诱导组织损伤,增加GFAP Iba-1, cox - 2的表达,并导致脱髓鞘,相比于对照组。然而,cuprizone并不影响细胞因子(TNF的表达α干扰素-γ,il - 1β和2)在WT老鼠。在前面研究的作者,西地那非减少GFAP和Iba-1表达cuprizone组相比,保留髓鞘和轴突超微结构,以及显著下调IFN -γ肿瘤坏死因子-α,il - 1β2,cox - 2表达相比,控制和/或cuprizone组。前面的结果证明了西地那非在小脑的保护作用。西地那非促进cGMP的积累,这是主要的信号分子。调查被认为是重要的角色没有MS-model和西地那非的影响更加深刻。因此,在目前的研究中,iNOSnull老鼠之间的关系,MS-model,西地那非在小脑是调查的影响。

在缺乏伊诺/不,cuprizone GFAP的表达明显增加,TNF -αcox - 2, Iba-1 il - 1β和干扰素-γ。此外,cuprizone中毒GSTpi减少,髓鞘少突胶质细胞的标记,髓受损,引起震动,散步,和姿势异常。这些数据表明cuprizone中毒发生即使没有iNOS-NO系统和在WT老鼠,比在cuprizone没有增加细胞因子表达(22]。有趣的是,进气阀打开−−/控制动物显示髓鞘结构改变。

假设,如果没有进气阀打开,以挪士可能过表达作为补偿机制。Bernardini et al。30.)表明,治疗内毒素NOS表达的影响,移植进气阀打开,同时,表达下调以挪士。似乎有一个监管伊诺的表达之间的关系,并以挪士。事实上,它被发现,以挪士是伊诺强烈的表达−−/动物与WT老鼠相比。以挪士水平仍处于高位后cuprizone cuprizone总局+西地那非。在正常情况下,低水平的没有由以挪士和nNOS参与细胞信号传导和调节生理过程(31日]。然而,以挪士超表达(因此,常量高浓度的NO)可以负责髓磷脂的变化和在伊诺促炎的易感性−−/动物。

另一方面,伊诺具有一个重要的反馈机制在炎症条件下,当这种酶的增加是自动调整的,导致减少一些促炎的蛋白质(32- - - - - -35]。伊诺活动的抑制诱导增强il - 1β、il - 6和TNF -α水平(36),随后,一个持久增加伊诺表达,表达下调TNF受体(35]。在目前的研究中,缺乏伊诺可能解释增加TNF -α干扰素-γ在伊诺cuprizone治疗后,il - 1−−/老鼠,而cuprizone没有增加这些细胞因子在小鼠WT (22]。这种反馈机制是由高浓度的cGMP coregulated [32]。因此,另一个假说解释了更严重的炎症引起的小鼠cuprizone没有伊诺伊诺反馈机制的缺失。

有趣的是,尽管西地那非对伊诺低抗炎作用−−/老鼠,它大大提高了髓鞘结构没有伊诺的老鼠。Cuprizone铜螯合剂,导致与随后的髓鞘脱失(直接少突细胞死亡37]。在这个模型中,少突细胞死亡和髓鞘脱失是独立的免疫和炎症反应。发现cGMP模拟(8-Br-cGMP)保护分化少突胶质细胞的死亡由staurosporine thapsigargin或kainate [38]。西地那非,可能通过cGMP的积累,对少突胶质细胞有直接的有益作用,保护细胞和髓鞘形成,改善独立于它的抗炎作用。

总之,本研究的结果表明,进气阀打开−−/老鼠更容易cuprizone中毒的潜在参与两种机制:(1)在炎症条件不在iNOS-negative反馈机制,因此,促炎的蛋白质,如细胞因子和cox - 2,过度增加;(2)以挪士由代偿机制中并生成长期高水平的不,破坏组织。此外,本研究的结果表明,西地那非可能发挥其抗炎作用主要通过伊诺抑制,通过cGMP-iNOS反馈。此外,西地那非可能对少突胶质细胞有直接的保护作用。还需要进一步的研究来解释西地那非的分子机制保护中枢神经系统。

利益冲突

作者宣称没有利益冲突。

作者的贡献

卡塔琳娜州Raposo和安娜卡罗丽娜桑塔纳Nunes参与治疗的动物,世行的发展,如果遇到了测试程序,分析和解释结果,论文的起草。卡塔琳娜州Raposo和安娜卡罗丽娜桑塔纳Nunes同样本研究的发展起到了推波助澜的作用。Rayana Leal de Almeida卢娜和Shyrlene Meiry da罗查Araujo导致治疗动物,开发相关的和局部反馈测试过程和结果的分析和解释。玛丽亚爱丽丝da Cruz-Hofling导致的分析和解释数据和论文修改。克里斯蒂娜·阿尔维斯Peixoto导致技术的监督程序,数据的分析和解释,纸和修订,并最终批准出版的版本。

承认

作者感谢女士Josineide科雷亚是安妮·加布里埃尔·塞·伐斯冈萨雷斯,他玛丽亚da康西卡奥卡瓦略,和斯蒂芬妮·s·m·Federighi优秀的技术援助,为动物CPqAM住宿设施,Centro de Tecnologias Estrategicas做Nordeste(十六烯)实验室设施。Fundacao德帕罗支持的研究尽管做Estado de圣保罗(FAPESP)必须占州政府,Fundacao德帕罗Ciencia e Tecnologia做Estado de伯南布哥(FACEPE),慰问Nacional de Desenvolvimento Cientifico e学府(CNPq) Coordenacao de Aperfeicoamento de Pessoal de含量比(披肩)和西班牙de Ciencia e Tecnologia de Biologia Estrutural e Bioimagem (INBEB)。卡塔琳娜州Raposo从FAPESP,必须占州政府支持的研究奖学金玛丽亚爱丽丝da Cruz-Hofling和克里斯蒂娜·阿尔维斯Peixoto支持从CNPq研究奖学金。他们承认詹姆斯年轻的英语编辑。