文摘
介绍。炎症和endothelium-derived超氧化物pathomechanisms atherothrombotic疾病很重要。之前我们可以表明,酪氨酸磷酸酶SHP-1作为负调节内皮细胞过氧化物生产。在这项研究中,我们调查的影响SHP-1在TNF platelet-endothelium交互和动脉血栓形成α全身的血管内皮炎症在活的有机体内。方法。小动脉的血栓形成和血小板在活的有机体内C57BL / 6小鼠研究使用活体的显微镜的背侧皮肤褶室微循环模型。结果。由具体的药理抑制剂钠抑制SHP-1 stibogluconate并未显著提高platelet-endothelium交互在活的有机体内在生理条件下而导致一个增广的血小板在肿瘤坏死因子α全身系统性炎症。因此,ferric-chloride-induced小动脉的血栓形成,已经增加了SHP-1抑制,进一步增强TNF的设置α全身的炎症。血小板聚集在体外以及体外不会受到SHP-1-inhibition。在培养的内皮细胞,钠stibogluconate肿瘤坏死因子增加α全身的表面表达p-selectin和血管性血友病因子。此外,肿瘤坏死因子αSHP-1活动和蛋白表达增加。结论。血管内皮细胞的酪氨酸磷酸酶SHP-1血管止血方面扮演着重要的角色体内,肿瘤坏死因子的关键是什么α全身的血管内皮炎症,它可以作为一个autoinhibitory分子,防止过度炎症反应和血栓形成。
1。介绍
炎症过程发挥重要作用在动脉粥样硬化的发展及其致命结果,如心肌梗死、缺血性中风(1,2]。促炎细胞因子包括肿瘤坏死因子α和il - 1β导致动脉粥样硬化斑块大小的进展(3,4]。易位NF -κB,增加活性氧的生产(活性氧),或以挪士的表情似乎影响中央步骤调节炎症的影响(5- - - - - -9]。炎性细胞因子的作用和ROS在心血管疾病是紧密联系,和高endothelial-derived活性氧激活proatherogenic信号通路和刺激血管平滑肌细胞增殖10,11),清除endothelium-derived一氧化氮,因此,加重内皮功能障碍(10,12]。此外,血小板代表一个重要联系炎症,血管硬化,血栓形成(13- - - - - -16]。血小板可以与激活内皮(17)和存储在释放促炎细胞因子和趋化因子α颗粒如il - 1β或CD40L [18),进而增强内皮炎症和维持炎症的恶性循环。毫不奇怪,慢性炎性疾病患者患心血管发病率和atherothrombotic事件(19),不能用传统的心血管风险因素来解释(20.- - - - - -22]。之前我们和其他人可以表明TNF的系统性管理α调节凝血的影响在活的有机体内(23,24),至少部分通过内皮细胞介导的。
SH2-domain包含蛋白质酪氨酸磷酸酶1 (SHP-1)是免疫受体信号的负调节淋巴细胞,巨噬细胞和血小板,它通常是coactivated刺激对细胞施加一个autoinhibitory函数(25- - - - - -27]。SHP-1基因缺陷的小鼠(“motheaten可行的老鼠”)显示激活的转录因子NF -增加κB和连续水平升高的炎症细胞因子影响的调节免疫反应(28]。之前我们可以证明SHP-1表达血管内皮细胞和负调节NAD (P) H-oxidase-dependent内皮抑制过氧化物生产的PI3 K活动和随后的失活的小GTPase Rac1;SHP-1 mRNA击倒以及与药理抑制剂抑制钠stibogluconate导致氧化应激在内皮细胞(29日]。
在这项研究中,我们调查的影响SHP-1抑制剂钠stibogluconate在TNF platelet-endothelium交互和动脉血栓形成α全身的血管内皮炎症体内。
2。方法
2.1。化学物质
小鼠肿瘤坏死因子α来自Chemicon国际(美国),人类肿瘤坏死因子α从Reliatech(德国),胶原蛋白是来自奈科明(德国)、多平台分析和试剂都来自Dynabyte(德国慕尼黑);反人类的SHP-1抗体(C-19和D-11)来自圣克鲁斯(美国),兔子反phospho-SHP-1 (Y564)抗体Abcam(英国剑桥),anti-GAPDH抗体从微孔(美国Billerica) antirabbit抗体和antimouse二级抗体来自Calbiochem(达姆施塔特,德国)和反vWF-FITC,反p-selectin-RPE,各自负控制来自Abd Serotec(英国)。stibogluconate钠和其他化学物质来自Sigma-Aldrich(德国)。
2.2。动物
动物实验在野生型C57BL / 6小鼠,进行购买的查尔斯河,Sulzfeld,德国。手术进行了短期麻醉诱导下一腹腔内注射咪达唑仑5毫克/公斤(Ratiopharm、德国),芬太尼0.05毫克/公斤(CuraMED制药公司、德国)和Medetomidinehydrochloride 0.5毫克/公斤(辉瑞公司、德国;由猎户制药、芬兰)在0.9%生理盐水稀释。后,实验动物被注射过量(2 g / kg)戊巴比妥钠(梅里亚,德国)。所有实验按照德国动物保护法律和区政府批准上巴伐利亚(参考号AZ 55.2 - 1-54-2531-162-08)批准。调查符合欧盟指令2010/63 /欧洲议会。
2.3。活体的显微镜的背侧皮肤褶室Microcirculatory模型
背侧皮肤褶室microcirculatory模型用于老鼠像前面描述的那样24]。与一个完整的动物微循环进行了颈动脉导管的应用药物或注射的孤立的血小板,分别。活体荧光显微镜进行使用修改后的显微镜(蔡司Axiotech碧瑶风,德国)。照片用数码相机记录(德国卡尔蔡司AxioCam HSm)。对所有在活的有机体内实验小鼠肿瘤坏死因子α(美国Chemicon国际)是管理通过颈动脉导管在剂量为0.4μ克/公斤。这是匹配计算等离子体水平的大约5 ng / mL,造成影响在体外。钠stibogluconate中通过颈动脉导管注入剂量计算匹配plasmal大约10水平μ克/毫升,因为它已被证明特别抑制SHP-1在这个浓度(30.]。
2.4。小鼠血小板分离和染色在活的有机体内研究
全血从麻醉小鼠的心脏穿刺。防止血液凝固注射器包含10%的柠檬酸钠。柠檬酸盐全血纺在130 g和获得的PRP孵化与Carboxyfluorescein (CFDA-SE 17μmol / L, Bachem,瑞士)在黑暗中30分钟。标记血小板被旋转340 g和resuspended calcium-free生理的缓冲溶液(138更易/ L氯化钠,2.7 L更易与氯化钾,12更易/ L NaHCO3,0.4更易/ L不2阿宝41 L MgCl更易2×6小时2啊,5更易/ L d -葡萄糖,5更易/ L玫瑰;pH值7.35)。对离心Iloprost (10 ng / mL,先灵葆雅,德国)增加了防止血小板激活。孤立和彩色血小板聚合的能力被血小板aggregometry测试。
2.5。活体的Platelet-Vessel-Wall交互分析
活体的研究血小板与完整的血管壁的交互的孤立和fluorescent-stained小鼠血小板从供体动物通过颈动脉导管注入和背侧皮肤褶室模型中观察到。电影的30年代序列4 - 6船段在每个动物记录和分析使用AxioVision软件(德国卡尔蔡司)。与异常血管流被排除在分析之外。血小板生成的长度的痕迹在单图片,速度单血小板计算使用每一个图片的曝光时间。血小板血管壁相互作用(PVWI)表示的频率直方图组成的血小板速度进行了分析。直方图归一化到容器内最大血小板速度排除偏压改变不同小动脉血流速度的影响。因此向右改变血小板内速度分布直方图表达PVWI较少,而在左边转变庆祝增加PVWI小动脉的墙。血小板以不到5%的速度最快的血小板被定义为血小板。
2.6。小动脉的血栓形成的活体的评估
活体的血栓性血管闭塞时间评估在C57BL / 6小鼠小动脉背侧皮肤褶室模型。intra-arteriolar诱导的血栓形成,氯化铁溢出方法如前所述[24]。在实验前血管流数字记录和定期对所有分析小动脉血液流动被证实。可视化血管腔血管损伤前50μL 5%的荧光素isothiocyanate-labelled葡聚糖溶液(FITC-Dextran, 150000 MW)是通过颈动脉导管注入。损伤血管壁是由应用程序30μL的氯化铁溶液(25更易/ L)到小动脉,使用一个标准化的协议和电影直到血流停止记录。
2.7。血小板聚集实验
血小板聚集在人类富含血小板血浆(PRP)采用比浊法测定所描述的(出生31日]。人类PRP离心获得的整个柠檬酸盐的血液,来自人类肘静脉130 g。ADP、胶原蛋白、TRAP-induced血小板聚集测量光度计的使用2声道凝集计(美国ChronoLog 490 - 2 - d)在1000 rpm在连续搅拌下37°C。获得书面同意从血小板捐献者。
老鼠研究血液收集从下腔静脉麻醉小鼠注射含有肝素。聚合是由全血阻抗aggregometry与多平台(多个血小板功能分析仪)试验(Dynabyte,慕尼黑,德国)根据制造商的协议。阻抗的变化表示为聚合振幅超过6分钟重复记录和结果表示为意味着任意聚合单元(AU)。
2.8。细胞培养
人类脐静脉内皮细胞(HUVECs)和猪主动脉内皮细胞(PAECs)被孤立如前所述32)和培养与10% FCS M199媒体补充,10%内皮生长媒体(PromoCell、德国),和1%的青霉素和链霉素。重组体人肿瘤坏死因子对所有细胞培养实验α(德国Reliatech)使用。过程是通过大学伦理审查委员会和调查符合赫尔辛基宣言中概述的原则。
2.9。内皮细胞表面分子的表达
HUVECs种植与虚假的描述和孵化或重组TNFα(5 ng / mL)或钠stibogluconate表示。细胞染色使用anti-p-selectin RPE和anti-vWF FITC或相应的RPE - FITC-labeled消极的控制。测量FACSCanto II流式细胞分析仪(美国,正欲)使用。数据分析使用FACSDiva软件(正)。
2.10。免疫沉淀反应SHP-1和SHP-1活动
PAECs清洗和细胞溶解在radioimmunoprecipitation(里帕)缓冲区和蛋白质含量确定所述其他地方(33]。从300年整除μg蛋白的免疫沉淀反应SHP-1进行使用多克隆主要anti-SHP-1鼠标抗体(C-19), mac蛋白g微,mac分离列Miltenyi研究(Bergisch格拉德巴赫、德国)根据制造商的协议。等量SHP-1被平衡的磷酸酶检测缓冲区(玫瑰20更易/ L,氯化钠100更易/ L,氯化镁5更易/ L,氯化锰5更易/ L, pH值6.5)。后添加10更易/ L的显色底物p-nitrophenylphosphate和孵化1 h (37°C)解决方案被转移到多井盘子,和灭绝为405 nm (SpectraFluor, Tecan,德国)。
2.11。免疫印迹
蛋白溶解产物从PAEC或HUVEC(完整的细胞溶解产物)准备和蛋白质含量量化描述的其他地方。溶菌产物受到免疫印迹分析如前所述[33)和SHP-1使用兔子anti-SHP-1多克隆抗体检测(C-19)。测量SHP-1活动磷酸化的SHP-1 Y564检测使用一只兔子anti-phoshpho-Y564-SHP-1抗体(Abcam)磷酸化在这个网站被描述与磷酸酶活性(34]。GAPDH作为加载控制。
2.12。统计分析
SigmaStat软件用于计算统计差异。使用学生的数据进行了分析以及为正态分布变量方差分析或Mann-Whitney等级测试或方差分析和排名,当正态分布并不是。数据表示为±SEM手段。差异被认为是重要的误差概率水平时。
3所示。结果
3.1。Platelet-Endothelium交互在活的有机体内
我们评估瞬态交互的注射标记血小板在血管壁在活的有机体内背侧皮肤褶的活体的显微镜的船只。使用stibogluconate钠的浓度为10μ克/毫升(11μ米),它已被证明为SHP-1展览迄今为止最高的亲和力,而高10倍浓度必须抑制等其他酪氨酸磷酸酶SHP-2和应用PTP1B30.]。
全身治疗与钠stibogluconate (10μg / mL, 30分钟)稍微提高滚动血小板的数量在生理条件下(0.4±0.2%的分析注射没有SHP-1抑制血小板和0.1±0.1%;,),但明显升高血小板在肿瘤坏死因子引起的急性全身性炎症α治疗(5 ng / mL, 4小时;1.0±0.3%滚动血小板和0.4±0.2%没有SHP-1 inhibtion,,,图1(一))。瞬态platelet-endothelium交互SHP-1抑制后增加了钠stibogluconate TNFα全身的炎症也表示一个左方的改变血小板流速分布图(速度从2900 - 3300年分析了5种不同的血小板在每组动物,人物1 (b))。最大血小板在分析船舶速度近似测量流速的治疗组之间没有显著差异。
(一)
(b)
3.2。小动脉的血栓形成在活的有机体内
分析影响SHP-1 inhibtion血栓形成在活的有机体内,我们评估了时间血栓性小动脉的血管闭塞后氯化铁伤血管壁溢出。时间来完成血栓性血管闭塞在损伤明显加速从307±34 s控制动物149±49 s在动物对待SHP-1抑制剂钠stibogluconate 10μ(克/毫升30分钟,和控制动物)。血管闭塞时间进一步加速了SHP-1抑制TNFα全身的炎症(5 ng / mL, 4小时)(50±14和176±42年代没有SHP-1 inhibtion;;,图2)。
3.3。影响SHP-1 Inhibtion内皮P-Selectin和vWF表面表达
更好地定义的相对贡献内皮的凝血效果施加SHP-1 inhibtion TNFα全身炎症我们分析了粘附分子与platelet-endothelium交互在体外在人类内皮细胞主要通过流式细胞术(HUVECs)。首先我们测试是否stibogluconate钠抑制SHP-1内皮细胞和酶pNNP-dephosphorylation试验测量SHP-1活动。用钠治疗stibogluconate (10μg / mL, 30分钟)减少SHP-1活动HUVEC 58±15%的基线活动(,,图3(一个))。
(一)
(b)
(c)
P-selectin没有明显调节SHP-1抑制剂钠stibogluconate (10μg / mL, 30分钟)基底条件下(120±11%的基线,;),但明显增加了SHP-1抑制TNFα全身的炎症(5 ng / mL, 4小时)(180±22%的基线和126±11%的基线没有SHP-1 inhibtion,,,图3 (b))。
接下来,我们测量了vWF HUVEC的表面膜,由SHP-1抑制剂调节钠stibogluconate (10μg / mL, 30分钟)已经在基底条件下(124±8%的基线,,),显示趋势进一步增加了SHP-1 inhibtion TNFα全身的炎症(5 ng / mL, 4小时)(136±13%的基线与121±8%的基线没有SHP-1 inhibtion,、n;这两个与控制,图3 (c))。
3.4。血小板聚集
测试的直接影响SHP-1抑制剂钠stibogluconate和肿瘤坏死因子α我们评估血小板血小板聚集在体外在人类PRP使用光透射aggregometry(出生的方法)。与人类肿瘤坏死因子PRP的孵化α4小时5 ng / mL,额外的抑制SHP-1(钠stibogluconate 10μg / mL 30分钟)不影响血小板聚集,在低和高剂量的刺激血小板受体激动剂ADP、胶原蛋白和thrombin-receptor-activating肽(陷阱;,每一个,图4(一))。
(一)
(b)
测试系统SHP-1抑制对血小板聚集的影响测定全血的老鼠与stibogluconate钠口服治疗后,并没有改变ADP-induced (ADP 6.5μ米)血小板聚集控制治疗动物相比,无论是在基础条件下还是在TNFα全身的炎症(动物每组人物4 (b))。
3.5。肿瘤坏死因子的影响α轴马力活动和表达
调查是否肿瘤坏死因子α影响SHP-1磷酸酶活性和蛋白表达我们测量SHP-1磷酸酶活性pNPP-dephosphorylation化验和检测SHP-1磷酸化酪氨酸564初级内皮细胞的免疫印迹(PAEC和HUVEC, resp)。
肿瘤坏死因子α治疗(5 ng / mL)引起的PAEC SHP-1磷酸酶活动的迅速增长到120±6%的基线后3分钟和30分钟后136±14%的基线(;与控制,图5(一个)在PAEC)。同样,SHP-1活动增加了肿瘤坏死因子α治疗(4 h 5 ng / mL)在HUVEC(112±2%的基线,;;图5 (b))。
(一)
(b)
(c)
SHP-1蛋白表达被TNF没有改变α4小时后(5 ng / mL)的刺激,但24小时后显著升高(132±6%的基线,,;图5 (c))。
4所示。讨论
在这项研究中,我们表明,抑制酪氨酸磷酸酶SHP-1导致增加platelet-endothelium交互和加速小动脉的血栓形成在活的有机体内,可能是内皮细胞粘附分子的upregulation。这些影响进一步强TNF的设置α全身的炎症。因为肿瘤坏死因子α增强的活动SHP-1,酪氨酸磷酸酶可能作为autoinhibitory反馈机制,这是很重要的,防止过度炎症反应和血栓形成。
在我们的在活的有机体内研究抑制治疗SHP-1抑制剂钠stibogluconate导致轧制量略大血小板比控制在生理条件下对待动物。然而,这种效果是显著增加SHP-1抑制时在急性炎症引起的系统性TNFα治疗,导致显著提高瞬态platelet-endothelium交互。当内皮激活,类似于白细胞,血小板可以在内皮(滚17]。剪切应力下p-selectin及其counterreceptors PSGL-1或GPIb和vWF调解血小板与内皮的交互,触发释放促炎细胞因子和趋化因子中存储α颗粒如p-selectin或chemokine-like因子il - 1β和CD40L18进而可以激活内皮。的确,在体外在培养的内皮细胞的SHP-1 inhibtion stibogluconate钠导致快速upregulation p-selectin TNFα全身的炎症状态,而一个重要的vWF upregulation观察已在基础条件下,在与我们的符合得很好在活的有机体内结果。描述了这些粘附分子来调节ROS不仅通过redox-sensitive等转录因子NF -κB (12),但也从Weibel-Palade迅速释放身体的转译后的细胞信号反应由不仅古典NADPH氧化酶还通过黄嘌呤氧化酶(35]。我们以前确定SHP-1的负调节内皮NADPH-oxidase依赖已经超氧化物基底条件下(29日],它高度表明活性氧的作用参与调解这些影响。
此外抑制SHP-1已经基底条件下(即。之前,没有与肿瘤坏死因子的刺激α)导致显著加速血栓性血管闭塞在活的有机体内在背侧皮肤小动脉氯化铁受伤。这种效应在TNF更加明显α全身的炎症。我们先前已经表明TNFα可以增加小动脉的血栓形成在活的有机体内通过几种机制组织因子的转录水平包括upregulation thrombomodulin[差别PAI-1,对这些24]。Inhibtion SHP-1活动只有很短的时间内再次表明,快速upregulation内皮vWF p-selectin,可能涉及代ROS,负责TNF的增强作用α全身凝血效果。高表达的vWF内皮细胞已被证明导致微血管血栓形成在活的有机体内(36)和氧化应激诱发凝血变化描述(12]。
应该提到的,不过,从SHP-1抑制血栓形成实验直接影响血小板不能排除。这是特殊利益尤其是鉴于先前的研究血小板分离“motheaten可行的老鼠”,SHP-1有缺陷的基因,被hyporesponsive GPVI刺激暗示SHP-1的生理作用降低了阈值为激活GPVI [27]。此外,角色SHP-1血小板的监管以挪士报道(37]。阐明是否观察到的凝血效果在活的有机体内可能是由于直接影响钠stibogluconate SHP-1抑制的血小板我们执行吗在体外(人类PRP)和体外(鼠标血液)聚合研究。有趣的是,在浓度显著影响内皮细胞被发现,没有血小板聚集的变化在体外后,无论是由钠stibogluconate本身还是之前与肿瘤坏死因子的刺激α,而未经处理的血小板等platelet-activating刺激胶原蛋白,ADP和陷阱可以观察到。同样的,体外在小鼠全血血小板聚集与stibogluconate钠治疗后,导致加速血栓形成在活的有机体内,没有受到影响,无论是在基础条件下还是在TNFα全身的炎症。因此,我们得出结论,我们观察到的影响在活的有机体内实验是由于内皮机制,而不是直接对血小板的影响。
肿瘤坏死因子的增强作用α全身的抑制促炎或凝血效果SHP-1活动在内皮细胞可以被解释为一个autoinhibitory磷酸酶的反馈机制。Autoinhibitory函数描述了SHP-1在其他细胞类型,如淋巴细胞、巨噬细胞,血小板,磷酸酶coactivated,作为负调节免疫受体的信号(25- - - - - -27]。在这个意义上我们可以先前表明,抑制内皮细胞导致的SHP-1 VEGF-dependent增加超氧化物形成(29日]。牛主动脉内皮细胞,肿瘤坏死因子α已被证明SHP-1激活和抑制增长factor-mediated细胞增殖通过这种机制(38]。因此,Sugano等人表明tnf可能调节血管生成过程采用SHP-1, SHP-1抑制内皮细胞增长。有趣的是,这是证明是由损伤引起的肿瘤坏死因子的能力α阻止酪氨酸的磷酸化VEGFR2诱导VEGF,强烈建议SHP-1展品TNF的负反馈调节α信号(39]。一些蛋白质酪氨酸磷酸化的下游TNF-receptor激活,涉及src -和jak-family激酶(40),这在某种程度上已被证明是由SHP-1 [41]。在内皮细胞肿瘤坏死因子α造成SHP-1磷酸酶刺激后激活开始已经在几分钟内。SHP-1抑制导致凝血的变化,尤其在肿瘤坏死因子明显α诱导炎症,我们提议激活SHP-1中扮演一个重要的在急性TNF autoinhibitory作用α信号。有趣的是,蛋白质含量的SHP-1内皮细胞没有显著升高后4小时的TNFα还刺激,但增加24小时后,显示一个函数的SHP-1慢性炎症过程。
考虑到炎性细胞因子,氧化应激的至关重要的作用在心血管疾病的病理生理学药理方法。这些因素是有趣的目标大量研究针对炎症细胞因子抗体或抗氧化剂活性氧的执行,,然而,导致冲突的结果对临床受益并没有成为建立标准治疗心血管疾病(42- - - - - -44]。导致心血管疾病的病理生理过程的理解是开发新的治疗策略的基础。SHP-1已经测试作为治疗目标在缺血性中风或心肌梗死、抑制其活动导致减少梗塞大小(45- - - - - -47]。另一个酪氨酸磷酸酶的抑制,即应用PTP1B,导致改善外围内皮功能障碍在心力衰竭(48]。细胞的效果和功能众多不同的胞质和膜结合酪氨酸磷酸酶多个敌对和许多倍。因此,保护酪氨酸磷酸化作为血管药物治疗原则,特别是利用酪氨酸磷酸酶抑制剂,必须被非常小心地分化方式和评估。
5。结论
我们的研究结果表明,内皮酪氨酸磷酸酶SHP-1血管止血,起着重要的作用,是肿瘤坏死因子的相关性α全身的血管内皮炎症,它可以作为一个autoinhibitory分子,防止过度的炎症反应。最终减少炎症SHP-1活动设置增加platelet-endothelium交互和加速小动脉的血栓形成在活的有机体内。
缩写
| ADP: | 二磷酸腺苷 |
| 以挪士: | 内皮细胞一氧化氮合酶 |
| HUVECs: | 人类脐静脉内皮细胞 |
| il - 1β: | Interleukin-1-beta |
| NF -κB: | Nuclear-factor-Kappa-B |
| PAECs: | 猪主动脉内皮细胞 |
| PAI-1: | 纤溶酶原激活物抑制剂1 |
| PI3凯西: | Phosphatidylinositide 3-kinase |
| pNPP: | 对硝基苯磷酸 |
| PRP: | 富含血小板血浆 |
| PSGL-1: | P-selectin糖蛋白ligand-1 |
| ROS: | 活性氧 |
| SHP-1: | SH2-domain含有蛋白质酪氨酸磷酸酶1 |
| 肿瘤坏死因子α: | 肿瘤坏死因子α |
| 陷阱: | Thrombin-receptor-activatingpeptide |
| VEGF: | 血管内皮生长因子 |
| VEGFR: | 血管内皮生长因子受体 |
| vWF: | vonWillebrandfactor。 |
利益的冲突
作者没有利益冲突。
作者的贡献
e .科赫公司设计并进行实验和解释数据。j .退却解释数据和写论文。t . Czermak e . Gaitzsh讽刺笑星阿里•g s、h . Mannell和m . Niemeyer进行实验。f·克罗和m . Wornle设计并监督知识内容的学习和做最后的修改。e·科赫和j .退却同样对本文亦有贡献。所有作者阅读和批准了期末论文。
确认
这项工作是支持的资助的“大幅减退Forderprogramm毛皮和学说”路德维希马克西米利安大学的资助我们1716/1-1“德意志Forschungsgemeinschaft”(DFG),和其他的资助Kroner-Fresenius-Stiftung Wilhelm-Vaillant-Stiftung。本文包含的伊丽莎白•科赫博士论文的一部分提交给慕尼黑路德维希马克西米利安大学的医学院。