文摘

的P2X7受体purinergic ligand-gated阳离子通道表达在白细胞包括小胶质细胞。本研究旨在确定P2X7激活诱导有机阳离子的吸收,活性氧(ROS)的形成,在鼠小胶质EOC13细胞系和死亡。使用小鼠巨噬细胞J774细胞系作为积极的控制,rt - pcr,免疫印迹,immunolabelling P2X7 EOC13细胞的存在。一个cytofluorometric试验证明了P2X7受体激动剂腺苷′三磷酸腺苷(ATP)和2′(3′)- o - (4-benzoylbenzoyl) ATP诱导ethidium⁺或YO-PRO-1^{2 +}吸收进两个细胞系。ATP诱导ethidium⁺吸收到EOC13细胞浓度的方式,电子商务₅₀的~130年μm . P2X7拮抗剂艳蓝G、A438079 AZ10606120, AZ11645373抑制ATP-induced阳离子吸收成EOC13细胞到75 - 100%。cytofluorometric试验证明P2X7激活诱导活性氧形成EOC13细胞,通过一个独立的Ca机制^{2 +}流入和K⁺流出。Cytofluorometric Annexin-V绑定和7 aad吸收的测量表明,P2X7激活诱导EOC13细胞死亡。ROS清道夫N-acetyl-L-cysteine受损都P2X7-induced EOC13活性氧的形成和细胞死亡,这表明ROS调解P2X7-induced EOC13死亡。总之,P2X7激活诱导有机阳离子的吸收,在EOC13小胶质细胞活性氧的形成,和死亡。

1。介绍

小胶质细胞是居民的先天免疫细胞的中枢神经系统(CNS)和发挥重要作用在免疫监视1),在许多中枢神经系统障碍的发病和进展(2]。小胶质细胞不断移动,花时间扫描中枢神经系统的细胞外空间(1]。针对脑损伤或免疫刺激,这些细胞被激活并接受戏剧性的形态和功能的变化,这是高度依赖于上下文的激活(3]。活化的小胶质细胞吞噬碎片和多肽,目前的抗原,并产生大量的可溶性因子。这些因素可能是炎症、监管或细胞毒性,包括活性氧(ROS),一氧化氮(NO),促炎和抗炎细胞因子,前列腺素,生长因子(4,5]。小胶质细胞激活时可以神经或神经毒素,根据产生的因素和它们的数量和上下文释放,延长或过度激活这些细胞与神经炎症,许多中枢神经系统疾病的恶化6]。背后的机制增强小胶质激活这些疾病和功能确定神经保护和神经毒性之间的平衡并不完全理解。

P2X7受体是一种三聚物的ligand-gated阳离子通道属于P2X purinergic家族受体(7]。P2X7主要表达在单核白细胞包括巨噬细胞和小胶质细胞,在炎症和免疫过程中发挥作用8]。特别是P2X7目前收到关注由于其可能的角色存在(9]。激活的细胞外腺苷P2X7′三磷酸腺苷(ATP),或最有力P2X7受体激动剂,2′(3′)- o - (4-benzoylbenzoyl) ATP (BzATP),导致小阳离子通道包括Ca^{2 +},Na⁺和K⁺在质膜,以及有机阳离子,如荧光染料ethidium⁺和YO-PRO-1^{2 +}(7]。相对于其他P2X受体,激活P2X7需要ATP浓度相对较高,半最大有效浓度(EC₅₀)100 - 300μ米(7]。激活P2X7导致下游的特异性信号事件,包括活性氧和活性氮物种的形成10),和细胞增殖或死亡11,12]。

使用分子、免疫化学和药理技术,我们在当前的研究中表明,鼠小胶质EOC13细胞系(13表达功能P2X7。由ATP激活P2X7这个细胞系诱导有机阳离子的吸收,活性氧的形成和细胞死亡。

2。材料和方法

2.1。试剂和抗体

rpmi - 1640和DMEM / F12媒体,GlutaMAX,正常马血清(NHS), 0.05%胰蛋白酶,YO-PRO-1^{2 +}2′,7′二乙酸-dichlorodihydrofluorescein (H₂DCFDA)和2′,7′二乙酸-difluorofluorescein (DAF-FM DA)从英杰公司(大岛,纽约)。胎牛血清(的边后卫)(使用前heat-inactivated)从Bovogen生物制剂(Keilor东部、澳大利亚)。ATP, BzATP、溴化乙锭、二甲亚砜(DMSO),甘油明胶,P2X7拮抗剂艳蓝G(广播)来自Sigma-Aldrich(圣路易斯,密苏里州)。P2X7拮抗剂A438079, AZ10606120, AZ11645373来自Tocris生物科学(Ellisville、钼)。引物来自GeneWorks (Hindmarsh说他是澳大利亚)。蛋白酶抑制剂鸡尾酒平板电脑(完整、迷你、EDTA-free)和Annexin-V-Fluorescein来自罗氏诊断(潘茨堡,德国)。SuperSignal西方Pico化学发光底物是皮尔斯(罗克福德,IL)。可行性染料7-aminoactinomycin D (7 aad)和活性氧清除剂N-acetyl-L-cysteine (NAC)来自恩佐生命科学(普利茅斯会议上,PA)。广谱活性氧抑制剂diphenyleneiodonium从开曼群岛(DPI)化学(安阿伯市MI)。n-dodecyl Phenyl-methyl-sulfonyl-fluoride (PMSF)-D-maltoside,乙二醇四乙酸(EGTA)来自Amresco(梭伦,哦)。

细胞与H preincubated₂O可溶性化合物(广播、A438079 AZ10606120)比较细胞preincubated没有每个化合物。细胞preincubated DMSO可溶性化合物(AZ11645373和DPI)比较单独细胞preincubated DMSO溶液。解决方案包含40毫米NAC准备在生理盐水中(140毫米氯化钠5毫米氢氧化钠5毫米氯化钾,消息灵通的10毫米,5毫米葡萄糖,pH值7.4)和调整pH值7.4;细胞被preincubated在生理盐水中有或没有南汽。期间在场孵化项目研究时,对手/抑制剂与ATP。

兔子anti-mouse P2X7(细胞外抗原决定基)多克隆抗体(Ab)和兔anti-rat P2X7 (c终端抗原决定基)Ab(和相应的阻断肽)来自Alomone实验室(耶路撒冷,以色列)。Peroxidase-conjugated山羊anti-rabbit免疫球蛋白Ab是罗克兰免疫化学(Gilbertsville, PA)。Cy3-conjugated驴anti-rabbit免疫球蛋白Ab是杰克逊ImmunoResearch(西树林,PA)。老鼠anti-mouse P2X7单克隆抗体(mAb)从恩佐生命科学(克隆HANO43)。老鼠IgG2b同形像控制马伯,allophycocyanin——(APC)共轭驴anti-rat免疫球蛋白Ab来自eBioscience (CA)圣地亚哥。

2.2。细胞系

小鼠巨噬细胞J774细胞系,鼠小胶质EOC13细胞系,与小鼠淋巴母细胞LADMAC细胞系,最初从美国获得的所有类型的文化集合(马纳萨斯,弗吉尼亚州),请提供了Jasmyn邓恩(澳大利亚布里斯班昆士兰大学)(J774)和伊恩•坎贝尔(悉尼大学,悉尼,澳大利亚)(EOC13和LADMAC)。J774细胞被维护在RPMI - 1640中含有10%的边后卫和2毫米GlutaMAX(完整的RPMI介质)。EOC13细胞在DMEM / F12补充10%的边后卫,2毫米GlutaMAX, 20% LADMAC条件培养液(完整的DMEM培养基)。细胞系都维持在37°C和95%的空气/ 5%的股份有限公司₂并通过每3 - 4天。使用MycoAlert季度进行支原体检测支原体检测设备(Lonza,大我),按照制造商的指示。实验,细胞收获细胞刮,除非另有说明。

2.3。荧光阳离子染料吸收试验

细胞在生理盐水中洗(300×5分钟),在氯化钠介质resuspended,平衡在5分钟37°C (1×10⁵细胞/ 1毫升/管)。细胞培养与25μM ethidium⁺(或1μM YO-PRO-1^{2 +}表示)没有或P2X7受体激动剂的ATP BzATP(显示)5分钟。在一些实验中,ATP-induced阳离子吸收与细胞悬浮在氯化钾评估媒介(150毫米氯化钾,5毫米葡萄糖,玫瑰和10毫米,pH值7.4)或包含1毫米CaCl氯化钠介质₂或100μM EGTA。在其他的实验中,细胞preincubated没有或存在P2X7拮抗剂或活性氧清除剂NAC(表示)15 - 30分钟,分别在阳离子和ATP。孵化项目与核苷酸被停止的同等体积的冰冷的生理盐水中含有20毫米MgCl₂(MgCl₂介质)离心(300×紧随其后5分钟)。细胞被洗一次与氯化钠介质和事件收集使用光敏电阻二流式细胞分析仪(BD生物科学,圣地亚哥,CA)(励磁488海里,排放收集ethidium 575/26和515/20的带通滤波器⁺和YO-PRO-1^{2 +}、职责)。相对的平均荧光强度(MFI)阳离子吸收决心使用FlowJo软件(树明星、亚什兰或)。

2.4。通过rt - pcr P2X7表达式

细胞总RNA隔绝了使用RNeasy迷你包(试剂盒、希尔登,德国)按照制造商的指示。如前所述(执行PCR扩增14)使用上标三世一步法rt - pcr系统铂Taq DNA聚合酶(英杰公司)500 ng的RNA,并P2X7 (5′-ATATCCACTTCCCCGGCCAC-3′)和反向(5′-TCGGCAGTGATGGGACCAG-3′)引物为42周期(94°C, 1分钟;68°C, 1分钟;72°C, 1分钟)。PCR产品2%的琼脂糖凝胶上分离Tris-acetate EDTA缓冲和溴化乙锭染色呈现。使用凝胶凝胶的图片收集逻辑212 PRO成像系统(Carestream健康,罗彻斯特,纽约)。

2.5。P2X7蛋白质免疫印迹检测

细胞被洗了三次磷酸盐(PBS) (300×5分钟)和细胞溶解(1×10⁷细胞/毫升)在冰冷的裂解缓冲超过60分钟(50毫米BisTris, 750毫米6-aminohexanoic酸,n-dodecyl 1%-D-maltoside、1毫米PMSF和蛋白酶抑制剂鸡尾酒,pH值7.0)。细胞被剪通过十倍通过21 G针和储存在−20°C,直到需要。细胞被解冻,清除(16000×在4°C 10分钟)。上层清液(25μg蛋白/ lane)分离减少条件下(5%β巯基乙醇)使用不连续sds - page系统叠加凝胶4%和10%的分离胶。蛋白质被转移到硝化纤维素膜(Bio-Rad大力神,CA)和阻塞在4°C隔夜Tris-buffered盐水(250毫米氯化钠和50毫米三羟甲基氨基甲烷、液pH值7.5)包含奶粉Tween-20 0.2%和5%。第二天,硝化纤维膜在室温下是孵化为2 h anti-mouse P2X7 Ab(1: 500)在Tris-buffered盐水含有奶粉Tween-20 0.2%和5%。膜清洗三次超过30分钟Tris-buffered盐水含0.2% Tween-20然后孵化室温1 h和peroxidise-conjugated anti-IgG Ab(1: 1000)在Tris-buffered盐水含有奶粉Tween-20 0.2%和5%。膜清洗如上所述,想起使用化学发光底物和Amersham Hyperfilm发射极耦合逻辑(通用电气医疗集团,小都,白金汉郡,英国)。电影的图片收集使用gs - 800校准密度计(Bio-Rad)。

2.6。细胞表面P2X7蛋白质通过流式细胞术检测

细胞在生理盐水中含有10%的国民健康保险制度和0.02%的南₃(1×10⁵细胞/ 200μL /管)孵化与anti-P2X7或鼠IgG2b同形像控制马伯(5μg / mL)在室温下30分钟。细胞然后用氯化钠介质(300×洗两次5分钟)和孵化APC-conjugated anti-rat免疫球蛋白Ab (1.3μg / mL)和7 aad(排除死细胞)30分钟免受光。细胞被洗一次。事件被收集使用LSR II流式细胞分析仪(励磁633海里,排放收集660/20 APC的带通滤波器;励磁488海里,排放收集7 aad) 695/40的带通滤波器。相对细胞表面P2X7决心使用FlowJo软件和表达的不同特定马伯的MFI标签和同形像控制标签。

2.7。共焦显微镜P2X7蛋白质检测

EOC13或J774细胞在各自完成培养基被镀成24-well板13毫米玻璃盖玻片(5×10⁴细胞/ 0.5 mL /)和孵化37°C, 95%的空气/ 5%的公司₂一夜之间,允许时间遵守。第二天,细胞被固定为4%多聚甲醛在PBS在室温下15分钟,然后用PBS洗了三次超过10分钟。细胞培养与permeabilisation解决方案(包含0.1% DMSO PBS, NHS 2%, 0.1% Triton x - 100)在室温下与PBS 10分钟,洗了三次。细胞被屏蔽20% NHS在PBS室温20分钟。细胞培养在4°C隔夜anti-rat P2X7 Ab (5μg / mL;preincubated 1 h在没有或存在阻塞肽按照制造商的指令)PBS中含1% BSA,南NHS 0.2%,和0.05%₃。细胞然后洗如上所述,在室温下孵化1 h和Cy3-conjugated anti-rabbit免疫球蛋白Ab (15μ包含0.2% NHS g / mL)在PBS。细胞被洗如上然后盖玻片安装到幻灯片为50% (v / v)甘油明胶在PBS。盖玻片和指甲油密封。使用DM IBRE细胞呈现倒置显微镜和TCS SP共焦成像系统(徕卡,曼海姆,德国)(励磁488海里,排放收集在560 - 600海里)。使用徕卡共焦图像捕获软件。

2.8。ROS生成分析

EOC13完整细胞在DMEM培养基被镀成24-well板块(5×10⁴细胞/ 0.5 mL /)和孵化37°C, 95%的空气/ 5%的公司₂过夜。细胞培养与氯化钠介质包含10μM H₂DCFDA(0.5毫升/)在37°C, 95%的空气/ 5%的公司₂免受光30分钟。中被移除,细胞进一步孵化CaCl氯化钠介质(包含1毫米₂)没有或2毫米的ATP在37°C, 95%空气/ 5%股份有限公司₂15分钟。孵化项目被停止添加同等体积的冰冷的MgCl₂媒介。细胞收获用0.05%胰蛋白酶(5分钟,37°C),并与生理盐水中洗一次。事件收集使用光敏电阻二流式细胞分析仪(励磁488海里,排放收集在515/20 nm)和相对的MFI二氯荧光素(DCF)使用FlowJo软件决定。

在一些实验中,ATP-induced ROS在氯化钾中评估,形成在氯化钠介质1毫米CaCl的缺失₂或存在100μM EGTA,或在没有完整的DMEM培养基或10μM AZ10606120(前15分钟预孵化,ATP之外)。免费的Ca^{2 +}降低了ATP的浓度⁴⁻(15),细胞没有孵化1毫米^{2 +}与1.4毫米ATP提供孵化克分子数相等的ATP吗⁴⁻浓度(575μ米),计算使用绑定并确定程序(16]。在其他的实验中,细胞preincubated没有或AZ10606120面前,南汽,或DPI(表示)15日30日之前30分钟,分别ATP。细胞收获也想起之前通过微分干涉对比(DIC)成像使用Eclipse TE2000倒置显微镜(尼康、东京、日本)检查细胞形态学和DIC图像捕获使用Image-Pro AMS(6.1版)(位于马里兰州Rockville媒体控制论)。

2.9。没有形成分析

EOC13完整细胞在DMEM培养基被镀成24-well板块(5×10⁴细胞/ 0.5 mL /)和孵化37°C, 95%的空气/ 5%的公司₂过夜。细胞培养与氯化钠介质包含10μM DAF-FM DA(0.5毫升/)在37°C, 95%的空气/ 5%的公司₂免受光30分钟。中被移除,这些细胞被洗一次。细胞然后用氯化钠介质没有preincubated或10的存在μ米AZ10606120 37°C, 95%的空气/ 5%的公司₂15分钟。这后,细胞进一步孵化没有或1.4毫米的ATP,持续15分钟。孵化项目被停止添加同等体积的冰冷的MgCl₂媒介。细胞收获用0.05%胰蛋白酶(5分钟,37°C),并与生理盐水中洗一次。事件收集使用光敏电阻二流式细胞分析仪(励磁488海里,排放收集在515/20 nm)和相对的MFI苯并三唑衍生物使用FlowJo软件决定。

2.10。细胞死亡分析

EOC13完整细胞在DMEM培养基被镀成24-well板块(5×10⁴细胞/ 0.5 mL /)和孵化37°C, 95%的空气/ 5%的公司₂过夜。细胞培养和无菌过滤ATP(显示)37°C, 5%的公司₂24 h。在一些实验中,细胞preincubated缺席或10的存在μM AZ10606120或40毫米NAC 15或30分钟,分别在ATP。在其他的实验中,细胞preincubated没有或40毫米的NAC 90分钟,在最后添加了2毫米ATP 15-60 min,然后中取代细胞孵化在37°C, 95%的空气/ 5%的公司₂为进一步的24小时。24小时孵化项目后,细胞收获从井用0.05%胰蛋白酶(5分钟,37°C)和洗一次Annexin-V绑定包含5毫米CaCl介质(氯化钠介质₂)。细胞培养与Annexin-V绑定中包含Annexin-V-Fluorescein室温和7 aad免受光了15分钟。事件收集使用LSR II流式细胞分析仪(励磁488海里,排放收集515/20和695/40带通滤波器Annexin-V-Fluorescein和7 aad resp)。和MFI Annexin-V-Fluorescein和7 aad使用FlowJo软件决定。象限标记被用来确定Annexin-V的百分比⁺/ 7 aad⁻,Annexin-V⁻/ 7 aad⁺,Annexin-V⁺/ 7 aad⁺细胞。在某些实验中,细胞收获之前被DIC的视觉成像检查细胞形态,和DIC图像捕获的2.8节中概述。

2.11。数据表示和数据分析

数据均值±SD。多个治疗之间的差异比较,方差分析搭配图基的HSD期末测验使用棱镜5为Windows(5.04版)(GraphPad软件,圣地亚哥,CA)和差异被认为是重要的。反应和抑制浓度曲线安装使用棱镜5和假设可变斜率,正常化和nonnormalised响应曲线,分别选择获得最适合的。EC的估计₅₀值最大的半抑制浓度(IC₅₀)获得个人适合这些情节。

3所示。结果

3.1。P2X7拮抗剂抑制ATP-Induced Ethidium⁺吸收到J774巨噬细胞细胞浓度的方式

小鼠巨噬细胞的J774细胞系是众所周知的表达功能P2X7 [17]。此外,我们的团队已经证明存在的各种细胞类型使用定时功能P2X7荧光阳离子吸收试验(例如,14,18])。因此,这种技术被用来确认存在P2X7 J774细胞和验证使用这个细胞系作为积极的控制。孵化P2X7受体激动剂的J774细胞ATP和最有力P2X7受体激动剂BzATP诱导显著ethidium⁺吸收到这些细胞与细胞培养在缺乏核苷酸(图1(一))。此外,孵化J774细胞ATP引起重大YO-PRO-1^{2 +}吸收细胞相比没有孵化ATP(图1 (b))。然而,ATP-induced YO-PRO-1^{2 +}吸收明显低于ATP-induced ethidium⁺吸收(图1 (b))。

一些非常具体的P2X7拮抗剂,包括A438079 [19],AZ10606120 [20.],AZ11645373 [21),最近变得可用。此外,广播通常用作P2X7拮抗剂在体外和在活的有机体内(例如,(22,23])。因此,确定最优浓度所需的这些对手抑制小鼠P2X7 J774细胞preincubated缺席或不同浓度的广播,A438079, AZ10606120, AZ11645373 ATP-induced ethidium⁺吸收评估。每个对手受损的1毫米ATP-induced ethidium⁺吸收浓度的方式,集成电路₅₀的值,,,μ分别为M(图1 (c))。AZ10606120和A438079完全抑制ethidium⁺吸收各自的浓度的10 100人μm .相比之下,广播和AZ11645373部分拮抗剂在ATP浓度(1毫米)使用。

3.2。EOC13小胶质细胞表达P2X7

确定EOC13小胶质细胞表达P2X7,一系列的实验用J774细胞进行积极的控制。首先,RNA从EOC13和J774细胞分离和放大了rt - pcr对P2X7使用引物。类似J774细胞,EOC13细胞被发现表达P2X7 mRNA,明显从230碱基对乐队的大小对应于预测产品(图2(一个))。P2X7总蛋白质的存在是由探测整个溶解产物分离的细胞系anti-P2X7 Ab。免疫印迹显示一个主要蛋白质群75 kDa EOC13和J774细胞(图2 (b)),预测对应糖化P2X7的大小。此外,这两个细胞系孵化anti-P2X7马伯和细胞表面P2X7由流式细胞术的存在。Immunolabelling证明细胞表面P2X7 EOC13和J774细胞,与小额信贷机构的和分别为()(图2 (c))。最后,两个细胞系都沾一个anti-P2X7 Ab和共焦显微镜分析。这同样证明了细胞表面P2X7的存在,以及细胞内P2X7,明亮染色观察细胞(图2 (d))。预培养的anti-P2X7 Ab阻断肽完全废除了检测P2X7细胞株(数据未显示)。总之,这些结果表明,P2X7 EOC13细胞中表达。

3.3。表达功能P2X7 EOC13小胶质细胞

确定P2X7 EOC13细胞功能,定时ethidium⁺吸收试验。ATP和BzATP诱发重大ethidium被发现⁺吸收到EOC13细胞相比,细胞没有孵化核苷酸(图3(一个))。接下来,EOC13细胞ATP浓度增加孵化了。ATP诱导ethidium⁺吸收浓度的方式,获得的最大吸收的ATP浓度1毫米和电子商务₅₀的μM(图3 (b))。后续特征的P2X7 EOC13小胶质细胞进行使用这个最大的ATP浓度(1毫米)。

来确定观察到ATP-induced ethidium⁺吸收成EOC13细胞是由P2X7,细胞preincubated没有或存在P2X7拮抗剂抑制浓度最优为1毫米ATP-induced ethidium⁺J774细胞吸收,如上显示(图1 (c))。预培养和30 EOC13细胞μ广播,100μM A438079, 10μM AZ10606120, 30岁μM AZ11645373导致的重大障碍ATP-induced ethidium⁺吸收的,,,分别为%(图3 (c))。除了AZ11645373 P2X7拮抗剂的基底ethidium显著改变⁺成EOC13细胞吸收。除了AZ11645373,封闭的可行的细胞的数量减少了30%,细胞生存能力(如评估向前边撒)之间类似的治疗(数据没有显示)。

以确定P2X7激活可以诱导第二有机阳离子的吸收到EOC13细胞,细胞preincubated没有或AZ10606120面前,和ATP-induced YO-PRO-1^{2 +}吸收了。类似于ethidium⁺吸收,1毫米ATP引起重大YO-PRO-1^{2 +}吸收到EOC13细胞相比,细胞没有孵化ATP(图3 (d))。此外,预培养的细胞和10μM AZ10606120导致完全抑制ATP-induced YO-PRO-1^{2 +}吸收(图3 (d))。孵化基底YO-PRO-1 AZ10606120没有显著改变^{2 +}吸收(图3 (d))。此外,细胞生存能力(如评估向前边撒)之间类似的治疗(数据没有显示)。总的来说,这些结果表明,P2X7 EOC13细胞功能。

3.4。P2X7激活诱导活性氧形成EOC13小胶质细胞

P2X7激活报道诱导活性氧形成的细胞类型,包括初级小胶质细胞(24,25]。因此,ATP-induced ROS形成EOC13细胞系研究使用ROS敏感的光纤探针。细胞含有H₂DCFDA(转换为细胞内DCF)没有孵化或存在ATP,和随后的活性氧的形成通过流式细胞术分析。作为细胞外钙^{2 +}据报道是重要P2X7-induced ROS形成的细胞类型(24,26,27),化验最初进行的1毫米Ca的存在^{2 +}。然而,由于Ca的抑制作用^{2 +}P2X7 (15),化验最初对2毫米ATP。孵化与2毫米ATP诱导显著ROS生成EOC13细胞相比,细胞没有孵化ATP (MFI ROS的形成和分别地,,)。此外,预培养的细胞和10μ完全抑制ATP-induced M AZ10606120导致活性氧的形成(图4(一)),这表明这个过程是由P2X7激活。至于阳离子吸收(图3),AZ10606120并没有显著改变基底活性氧的形成(图4(一))或细胞生存能力(如评估向前边撒)(数据没有显示)。

P2X7 ligand-gated阳离子通道(7];因此阳离子通量的可能角色P2X7-induced ROS生成下一个调查。P2X7-induced ROS生成部分依赖于Ca^{2 +}涌入人类早幼粒细胞(26)和大鼠颌下腺细胞(27]。因此,要确定Ca^{2 +}需要大量涌入P2X7-mediated ROS EOC13细胞形成,ATP-induced ROS地层缺失和Ca的存在^{2 +}被调查。对于这个比较,等量的ATP⁴⁻(575μ米)通过添加使用1.4或2毫米ATP氯化钠介质名义上免费的Ca^{2 +}Ca或包含1毫米^{2 +},分别。ATP引起显著的ROS地层缺失和1毫米Ca的存在^{2 +}同样的待遇相比细胞ATP(图的缺失4(b))。细胞培养的缺失^{2 +}已经明显高于ATP-induced ROS形成相比孵化Ca的存在吗^{2 +}。相比之下,ATP-induced ethidium⁺吸收(P2X7函数)是相似的细胞没有孵化或Ca的存在^{2 +}(图4(b)),这表明ATP-induced ROS形成的差异不是由于改变P2X7函数。

生理盐水中可能包含Ca的名义金额^{2 +}。因此,为了进一步排除Ca的角色^{2 +}在EOC13 P2X7-mediated ROS生成细胞,ATP-induced ROS形成了Ca的缺失和存在^{2 +}螯合剂EGTA。孵化与1.4毫米ATP诱导显著但类似数量的ROS地层缺失和100年的存在μM EGTA同样的待遇相比细胞ATP(图的缺失4(c))。再次,ATP-induced ethidium⁺吸收是相似的细胞没有孵化或存在EGTA(图4(c))。

最后,K的角色⁺在EOC13 P2X7-induced ROS生成细胞研究。ROS和K⁺参与interleukin-1射流已报告(il - 1)从单核细胞释放,尽管这些下游过程是否尚未建立有关(28]。因此,要确定K⁺流出参与P2X7-mediated ROS EOC13细胞形成,ATP-induced活性氧的形成与细胞生理盐水介质和氯化钾介质,防止细胞内钾的损失⁺。孵化与1.4毫米ATP诱导显著ROS生成氯化钠和氯化钾媒体,ROS水平类似的形成在媒体(图4(d))。同样,ATP-induced ethidium⁺在氯化钠和氯化钾媒体吸收相似(图4(d)),表明高细胞外K的无能⁺损害ATP-induced活性氧的形成并不是由于改变P2X7函数。

确认P2X7 EOC13小胶质细胞活化诱导活性氧的形成,DCF-loaded细胞在生理盐水中preincubated没有或活性氧清除剂NAC面前,在孵化前缺乏或ATP的存在。如上(图4),1.4毫米ATP诱导活性氧的形成(图5(一个))。预培养和40毫米NAC抑制ATP-induced活性氧的形成%(图5(一个))。基底活性氧的形成(图5(一个))和细胞生存能力(如评估向前边撒)(数据未显示)是相似的治疗方法。预培养的细胞和40毫米NAC抑制ATP-induced ethidium⁺吸收的%(图5 (b))。因此,南汽在P2X7-induced ROS形成的抑制作用可能部分归因于抑制P2X7本身。然而,孵化与南汽和ATP,但不是化合物,封闭的可行的细胞的数量减少了40% ethidium⁺吸收试验(如评估向前边撒)(数据没有显示)。这表明,南汽的抑制作用ATP-induced ethidium⁺吸收可能是一种细胞毒性的测定结果。

确认NAC没有诱导条件下的形态变化或造成细胞毒性ROS化验,DIC孵化后附着的细胞图像,在没有或ATP的存在。细胞没有孵化或NAC(没有ATP)的显示与长离散细胞体,开线的过程(图5 (c)),如前所观察到的13]。细胞在没有孵化或NAC (ATP)的存在也显示离散的细胞体,但收回和分支流程(图5 (c)),典型的ATP引起膜的变化(29日]。因此,ROS化验,EOC13细胞形态没有改变NAC相比,相应的治疗。

DCF-loaded细胞也preincubated没有或广谱的活性氧抑制剂DPI和ATP-induced ROS形成调查。然而,30分钟预孵化与DPI在不同浓度(有些人μ米)导致大量的细胞死亡(数据未显示),因此这种化合物没有进一步检查。

进一步验证P2X7 EOC13细胞活化诱导活性物种的形成,ATP-induced没有形成了使用敏感的探针DAF-FM哒。细胞含有DAF-FM DA(与没有反应生成荧光苯并三唑)preincubated没有或AZ10606120,其次是孵化没有或ATP的存在,以及随后没有形成通过流式细胞术分析。孵化与1.4毫米ATP诱导显著没有形成EOC13细胞相比,细胞没有孵化ATP(图6)。此外,预培养的细胞和10μM AZ10606120抑制ATP-induced没有形成%(图6),这表明这个过程是由P2X7激活。再次,AZ10606120没有明显改变基底没有形成(图6)或细胞生存能力(如评估向前边撒)(数据没有显示)。

3.5。P2X7激活诱导细胞死亡在EOC13小胶质细胞

P2X7激活导致死亡的各种细胞类型(11,12]。确定ATP引起的死亡EOC13小胶质细胞,细胞完整的DMEM培养基没有孵化或存在ATP 24 h,然后Annexin-V的百分比⁺/ 7 aad⁻,Annexin-V⁻/ 7 aad⁺,Annexin-V⁺/ 7 aad⁺细胞流式细胞仪等(图检查7(一))。死亡的细胞死亡表示为总(Annexin-V⁺/ 7 aad⁻)和(Annexin-V死了⁻/ 7 aad⁺和Annexin-V⁺/ 7 aad⁺)细胞。孵化2或3毫米ATP但不是1毫米ATP导致更高百分比总细胞死亡的细胞相比没有孵化ATP(图7(一))。接下来,来确定ATP-induced EOC13死亡是由P2X7激活,细胞preincubated没有或存在AZ10606120然后没有孵化或存在ATP 24 h。如上(图7(一)),2毫米ATP引起显著的细胞死亡,总比例较高的细胞死亡相比,细胞没有孵化ATP(图7 (b))。预培养10μM AZ10606120完全抑制ATP-induced细胞死亡(图7 (b)),这表明这个过程是由P2X7激活。

P2X7-induced小鼠RAW264.7巨噬细胞的死亡是由活性氧的形成30.]。因此,角色ROS P2X7-induced EOC13小胶质细胞的死亡的调查。确认P2X7诱导活性氧的形成条件下用于诱导细胞死亡,DCF-loaded EOC13完整细胞在DMEM培养基没有孵化或存在ATP,然后随后的活性氧的形成取决于流式细胞术。类似于ATP-induced细胞死亡(图7(一)),孵化2或3而不是1毫米ATP诱导显著ROS生成EOC13细胞相比,细胞没有孵化ATP(图7 (c))。要求更高的ATP浓度诱导细胞死亡(图7(一))或活性氧的形成(图7 (c)比孔隙的形成(图)3 (b))符合二价阳离子的抑制作用15培养基中,但不是在氯化钠介质使用。确认这个活性氧的形成是由P2X7,细胞preincubated AZ10606120和ATP-induced ROS形成的数量确定。平行实验细胞死亡,2毫米ATP是利用。再次,ATP诱导显著ROS形成细胞相比没有孵化ATP(图7 (d))。预培养10μM AZ10606120完全抑制这ATP-induced活性氧的形成(图7 (d))。

最后,NAC对P2X7-induced细胞死亡的影响进行了研究。EOC13细胞preincubated缺席或NAC的ATP 24 h紧随其后。然而,24小时孵化与40毫米NAC ATP的缺失导致了大量的EOC13细胞死亡(数据没有显示)。因此,为了减少总接触40毫米NAC,细胞也没有孵化的NAC 90分钟,在最后添加了ATP 15-60分钟。中被替换为新的完整的DMEM培养基和细胞培养24小时。孵化2毫米的ATP 30或60分钟但不是15分钟导致大量细胞死亡相比,细胞没有孵化ATP(图7 (e))。与南汽的24小时孵化,90分钟孵化与40毫米NAC (ATP)没有引起显著的细胞死亡相比,细胞培养的时间是一样长的没有南汽和ATP(图7 (e))。一个60分钟与南汽预孵化抑制引起的细胞死亡30分钟孵化与ATP%(图7 (e))。相比之下,75年和30分钟与南汽预孵化,其次是15和60分钟ATP治疗,分别对细胞死亡的比例没有影响细胞培养相比,同一时间长度与ATP缺乏NAC(图7 (e))。

进一步证实,南汽没有诱导条件下的形态变化或造成细胞毒性细胞死亡化验,DIC附着的细胞图像,24小时后孵化。如上(图5 (c)),细胞没有孵化或NAC(没有ATP)的显示与长离散细胞体,开线的过程(图7 (f))。此外,细胞孵化的南汽和ATP显示一个类似形态的细胞没有孵化ATP(图7 (f))。相反,细胞与ATP preincubated仅显示圆和颗粒细胞组织没有或很少流程(图7 (f)),细胞死亡的特征。此外,井与ATP独自preincubated大量的不依从细胞比其他疗法(数据没有显示)。因此,预培养与南汽阻止与ATP孵化相关的形态变化,但仅南京没有对细胞形态的影响。

4所示。讨论

当前的研究首次表明,鼠小胶质EOC13细胞系表达功能P2X7。首先,建立了P2X7信使rna和蛋白质的存在使用rt - pcr和免疫印迹技术。此外,细胞表面的存在P2X7使用免疫荧光染色了。此外,P2X7 EOC13小胶质细胞的功能,随着P2X7受体激动剂ATP和BzATP诱导显著ethidium⁺或YO-PRO-1^{2 +}吸收到这些细胞。在这些实验中,ATP诱导ethidium⁺吸收与电子商务₅₀价值,属于典型的范围ATP-induced阳离子通量由重组小鼠P2X7 [31日]。此外,预处理细胞P2X7拮抗剂抑制ATP-induced有机阳离子的吸收。最后,ATP能诱导活性氧形成EOC13细胞的死亡,和这两个事件,常与P2X7激活(10- - - - - -12),可以抑制P2X7拮抗剂AZ10606120。上的功能性P2X7 EOC13小神经胶质细胞是一致的与这种受体的存在主要小胶质细胞和小胶质细胞系(包括N9、N13 BV-2, NTW8细胞)(32- - - - - -35]。

P2X7 EOC13小胶质细胞活化诱导活性氧的形成。在主要小胶质细胞(P2X7-induced ROS生成报告24,25),而这一过程在小胶质细胞的作用已经突出了一些研究。P2X7激活诱导活性氧的生产,过氧化物,在初级鼠小胶质细胞,而这种受体是调节转基因小鼠模型的阿尔茨海默病(25]。虽然之间的直接联系P2X7、过氧化物和阿尔茨海默氏症并不成立,作者提出了这些分子和这种疾病之间的联系。这个链接支持后续观察他人,纤维淀粉样肽,与阿尔茨海默氏症有关,导致ATP释放和自分泌激活P2X7导致活性氧形成主要鼠小胶质细胞(24]。此外,另一组证明P2X7-induced超氧化物释放主要鼠小胶质细胞诱导大鼠皮层神经元的损伤(36]。总的来说,这些数据表明P2X7-induced ROS形成从小胶质细胞可能参与各种神经炎症和神经退行性疾病。这可能是特别重要的在小胶质P2X7报道是调节的疾病如阿尔茨海默氏症、多发性硬化症、和肌萎缩性脊髓侧索硬化症25,37]。然而,值得注意的是,DCF,工作在当前的研究中,广泛采用其他检测活性氧,还可以传播ROS形成(38]。然而,我们观察到P2X7 EOC13细胞激活也引发的形成没有支持这种受体的作用活性物种的形成。

当前的研究排除了Ca的重要作用^{2 +}涌入P2X7-induced ROS形成EOC13小胶质细胞。这一发现是类似于其他观测与其他小鼠细胞类型,包括颌下腺[39)和红细胞细胞(40]。相比之下,P2X7-induced ROS形成主要鼠小胶质细胞(24和老鼠颌下腺27依赖于大量的Ca^{2 +}。这两个物种之间的这种差异的原因仍然未知但差异可能反映了实验小鼠和大鼠之间的协议或信号分子的差异。当前的研究也排除K的重要作用⁺射流在EOC13 P2X7-induced ROS形成小胶质细胞。活性氧的形成和K⁺射流参与il - 1从单核细胞释放,尽管这些下游过程是否尚未建立有关(28]。因此,我们的研究结果表明,P2X7-induced ROS形成不需要K⁺流出,ROS形成和K⁺射流在il - 1可能独立事件从骨髓细胞释放。

P2X7激活诱导细胞死亡在EOC13小胶质细胞。使用一个Annexin-V / 7 aad试验表明这一过程是由细胞凋亡。然而,在缺乏其他标记的细胞凋亡和坏死的情况下,这仍有待建立,特别是P2X7激活诱导细胞凋亡和坏死的小胶质N13细胞系(41]。然而,我们的观察结果支持先前的研究中,P2X7激活诱导死亡主要小胶质细胞和其他小胶质细胞系(41,42]。P2X7-induced小胶质细胞死亡的生理作用还不清楚。进一步模糊这是已知的P2X7激活作用在诱导小胶质细胞的增殖43]。P2X7这个矛盾的角色被认为是相对ATP浓度有关,浓度高促进细胞死亡和低浓度促进细胞增殖44]。支持这一点,我们的研究发现ATP只在2或3 EOC13诱导细胞死亡而不是1毫米ATP。此外,我们的数据还表明,ATP的瞬态孵化30 - 60但不是15分钟在EOC13小胶质细胞诱导细胞死亡。这表明瞬态ATP释放和随后P2X7激活可能足以杀死小胶质细胞在活的有机体内。

当前研究了一种潜在的P2X7-induced ROS EOC13小胶质细胞形成和死亡之间的联系。一项研究表明,ATP-induced小鼠RAW264.7巨噬细胞的死亡是由活性氧源自NADPH氧化酶的下游P2X7激活(30.]。这与另一项研究中,发现P2X7-induced活性氧的形成,但不是死亡,是减毒主要从NADPH氧化酶缺乏小鼠巨噬细胞45]。我们的数据使用活性氧清除剂NAC支持ROS作用形成的P2X7-induced EOC13小胶质细胞的死亡。南汽的能力,以防止P2X7-induced EOC13小胶质细胞死亡是依赖于预培养时间与南汽,以及ATP的总孵化时间,只有45 - 60分钟预孵化与南汽防止细胞死亡引起的瞬态30 - 45分钟暴露ATP。相比之下,24小时孵化与南汽诱导大量EOC13小胶质细胞死亡,相当于,仅由ATP。这种细胞毒性的NAC可能发生由于增加有毒代谢副产品,如减少谷胱甘肽(46]。另外,清除ROS的NAC可能表明低数量的ROS对EOC13细胞体内平衡很重要。值得注意的是,活性氧抑制剂DPI也诱导EOC13小胶质细胞的死亡,尽管在时间进程快得多。最后,应该注意的是,南汽P2X7-induced死亡和抑制活性氧形成EOC13小胶质细胞可能是部分原因是P2X7的直接抑制作用。NAC抑制ATP-induced孔隙形成的30%相比,74年,99%的抑制ATP-induced活性氧的形成和细胞死亡,分别。这个直接抑制P2X7 NAC不是由于酸性pH值,这是众所周知的,损害P2X7功能(47),因为NAC-containing每次试验前解决方案调整pH值7.4。因此,我们的结果表明,细胞信号包括活性氧可能在EOC13调节P2X7激活小胶质细胞或NAC可以直接损害P2X7 40毫米。南汽用于这些实验的浓度(40毫米)4-8-fold高于很多类似的研究中使用(例如,48])。高浓度的NAC的需求是未知的但可能反映了NAC的跨越能力降低质膜或被转换成EOC13细胞中谷胱甘肽。

上的功能性P2X7 J774巨噬细胞细胞被确认在当前的研究中。P2X7存在在这个细胞株(17,激活P2X7导致成熟的il - 1的释放(49],macrophage-derived多核巨细胞的形成[50- - - - - -52),和细胞死亡53]。在这项研究中,四个P2X7拮抗剂的效力与1毫米ATP, ATP浓度最常用研究P2X7决心。的集成电路₅₀值广播、A438079 AZ11645373(1.8、7.9和1.5μM,分别地。)一个日志发表的范围内重组小鼠P2X7 [54,55]。相比之下,IC₅₀值为小鼠P2X7 AZ10606120尚未报道,尽管这化合物已被证明,具体结合,抑制大鼠和人类P2X7 [20.]。在当前的研究中,这种高度特定P2X7拮抗剂也完全受损ATP-induced ethidium⁺吸收、活性氧的形成和小鼠EOC13细胞的死亡。因此,AZ10606120小鼠P2X7将用于未来的研究。

在中枢神经系统中,细胞外ATP代理通过P2X7小胶质细胞神经炎症的一个重要中介(9]。ATP作为一种神经递质,是释放神经元突触传递过程中,从垂死的细胞(56]。在正常生理条件下,中枢神经系统的细胞外ATP浓度估计摩尔的微摩尔的范围内,根据ATP释放和退化之间的平衡,同时细胞内小胶质在毫克分子ATP浓度范围(57]。然而,中枢神经系统损伤后细胞外ATP浓度增加,可以达到高达毫克分子范围(57]。此外,它假定的ATP可能作用于小胶质P2X7在很近距离的ATP浓度可能会相当高。以初级小胶质细胞和小胶质细胞的激活P2X7行导致释放促炎il - 1和肿瘤坏死因子-(33,58和活性氧的形成24]。虽然促炎因子是重要的免疫(1),长时间或不恰当的释放等因素长期激活小胶质神经元可以剧毒,能促进神经炎症和神经退行性变的5]。有许多中枢神经系统疾病的特点是活化的小胶质细胞的存在,包括阿尔茨海默病、朊病毒感染、脑缺血、多发性硬化症和肌萎缩性脊髓侧索硬化症。在这种疾病,P2X7也被报道是调节(25,37,59,60]。这个问题可能的角色在调停P2X7不当小胶质反应中枢神经系统紊乱。

5。结论

这项研究表明EOC13小胶质细胞表达功能P2X7。这种受体的激活ATP导致有机阳离子的吸收,在这些细胞中活性氧的形成,和死亡。此外,EOC13细胞系为调查P2X7-mediated事件可能是有用的在小胶质细胞和受体的作用microglia-mediated炎症性疾病。

缩写

7法:	7-Aminoactinomycin D
阿瑟:	多克隆抗体
APC:	Allophycocyanin
ATP:	腺苷′三磷酸
广播:	艳蓝G
BzATP:	2′(3′)- o - (4-Benzoylbenzoyl) ATP
中枢神经系统:	中枢神经系统
DAF-FM DA:	2′,7′-Difluorofluorescein二醋酸盐
贴现:	二氯荧光素
迪拜国际资本:	微分干涉对比
DMSO溶液:	二甲亚砜
DPI:	Diphenyleneiodonium
电子商务50:	一半的最大有效浓度
EGTA:	乙二醇四乙酸
的边后卫:	胎牛血清
H2DCFDA:	2′,7′-Dichlorodihydrofluorescein二醋酸盐
集成电路50:	一半最大抑制浓度
il - 1:	Interleukin-1
马伯:	单克隆抗体
小额信贷机构:	平均荧光强度
南京:	N-Acetyl-L-cysteine
国民健康保险制度:	正常的马血清
没有:	一氧化氮
PBS:	磷酸盐
PMSF:	Phenyl-methyl-sulfonyl-fluoride
ROS:	活性氧物种。

确认

这项工作是支持的伍伦贡大学运动神经疾病研究所,国家卫生和澳大利亚研究理事会,澳大利亚研究理事会。r·巴特利特是一个澳大利亚的收件人研究生奖。j。j Yerbury是比尔Gole博士后奖学金的收件人。技术援助的伊拉瓦拉卫生工作人员和医学研究所也感激地承认。作者宣称没有利益冲突,也没有与任何公司的金融关系。